Sebuah Varian Rendah Frekuensi Di Mapk14 Menyediakan Bukti Mekanistik.docx

Sebuah Varian rendah Frekuensi di MAPK14 Menyediakan Bukti mekanistik dari Link Dengan Myeloperoxidase: Sebuah Risiko Kardiovaskular prognosis Marker Latar Belakang - Genetika dapat digunakan untuk memprediksi efek obat dan menghasilkan hipotesis sekitar indikasi alternatif. Mendukung Losmapimod, sebuah p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor dalam pembangunan untuk sindrom koroner akut, kami ditandai gen variasi dalam MAPK11 / 14 gen dengan exome sequencing dan tindak lanjut genotip atau imputasi pada peserta yang phenotyped untuk kardiovaskular dan metabolisme sifat. Metode dan Hasil - Investigasi variasi genetik di MAPK11 dan MAPK14 gen menggunakan model genetik aditif dalam linear atau regresi logistik dengan fenotipe kardiovaskular, metabolisme, dan biomarker menyoroti sebuah asosiasi RS2859144 di MAPK14 dengan myeloperoxidase pada populasi dislipidemia (Genetic Epidemiology of Metabolic Syndrome Study), P = 2,3910? 6). Varian ini (atau kuasanya) secara konsisten dikaitkan dengan myeloperoxidase di Framingham Heart Study dan Kardiovaskular Studi Health Study (replikasi meta-P = 0,003), yang mengarah ke nilai meta-P dari 9,96910? 7 dalam 3 kelompok dislipidemia. Itu varian atau kuasanya kemudian diprofilkan dalam tambahan kohort berbasis populasi (hingga total 58 930 subjek) termasuk Cohorte Lausannoise, Ely, Fenland, European Prospective Investigation of Cancer, London Biologi Calon Studi Kependudukan, dan Genetika Asosiasi Obesitas studi obesitas kasus-kontrol untuk 40 sifat kardiovaskular dan metabolisme. Secara Menyeluruh analisis mengidentifikasi sama polimorfisme nukleotida tunggal untuk nominal terkait konsisten dengan filtrasi glomerulus Tingkat (P = 0,002) dan risiko obesitas (indeks massa tubuh ≥30 kg / m2, P = 0,004). Kesimpulan - Sebagai myeloperoxidase adalah penanda prognostik kejadian koroner, varian MAPK14 dapat menyediakan link mekanistik antara p38 peta kinase dan peristiwa ini, memberikan informasi sesuai dengan indikasi saat Losmapimod untuk akut

sindrom koroner. Jika direplikasi, asosiasi dengan laju filtrasi glomerulus, bersama dengan temuan biologis sebelumnya, juga menyediakan dukungan untuk penyakit ginjal sebagai indikasi alternatif. (J Am Hati Assoc 2014; 3:. E001074 doi: 10,1161 / JAHA.114.001074) Kata Kunci: akut koroner sindrom • gen sasaran narkoba • exome sequencing • myeloperoxidase • variasi langka mediator dari kaskade sinyal inflamasi yang mengarah aktivasi produksi sitokin, lebih mudah diamati selama acara akut, seperti sindrom koroner akut. Di pengaturan terapi statin, Losmapimod signifikan dilemahkan intervensi inflamasi postpercutaneous respon, yang diukur dengan sensitivitas tinggi C-reaktif protein (CRP) .1 Dalam sebuah penelitian fase 2, efek Losmapimod pada keselamatan, ukuran infark, dan fungsi jantung yang evaluated.2 Results3 Mendorong telah menyebabkan perkembangan Losmapimod untuk percobaan fase 3 hasil untuk koroner akut sindrom. Gen-gen yang mengkode MAPK-dan -b (MAPK14 dan MAPK11, masing-masing) dimasukkan dalam urutan besar bereksperimen memeriksa ekson dan mengapit daerah 202 gen target narkoba di lebih dari 14 000 peserta phenotyped untuk berbagai penyakit dan medis yang relevan traits.4 The Nelson et al studi sequencing melaporkan umum dan variasi langka di 202 gen termasuk MAPK14 dan MAPK11, gen target obat untuk Losmapimod, dan diuji asosiasi varian umum dan jarang coding varian, di agregat, dengan 12 diseases.4 ada penyakit umum yang ditemukan terkait dengan MAPK14 atau MAPK11 dalam

penelitian yang diterbitkan termasuk Nelson et al.4 Karya ini berfokus pada profil varian dalam MAPK11 dan MAPK14 gen untuk hubungan dengan kardiovaskular dan metabolisme fenotipe dan biomarker yang terkait. Mendalam fenotipe Informasi ditambah dengan gambaran yang lengkap dari umum dan variasi genetik langka yang tersedia dari studi sekuensing memberikan kesempatan untuk menggunakan genetika sebagai instrumen untuk lebih memahami peran MAPK-a / b di penyakit umum (Termasuk sindrom koroner akut) dan hubungannya dengan biomarker yang terkait. Hal ini diantisipasi bahwa frekuensi rendah kisaran (0,1% sampai 5% alel minor frekuensi [MAF]) bisa mengandung variasi fungsional dengan efek ukuran lebih besar daripada yang diamati dengan variasi umum (> 5% MAF) .5 Harus varian tersebut menjadi menemukan bahwa meniru efek pada target, mereka dapat membuat berguna alat untuk memprediksi efek obat dan menyarankan alternatif indikasi untuk MAPK-a / b modulator. Varian diidentifikasi oleh Nelson et al dan hadir dalam Genetik Epidemiologi Sindrom Metabolik Studi (GEMS) 6 dan Cohorte Lausannoise (CoLaus) study7 yang diprofilkan untuk hubungan dengan kardiovaskular dan metabolisme fenotipe dan biomarker yang terkait (38 dan 40 sifat, masing-masing). Analisis sifat-sifat ini dilakukan pada semua subyek sequencing untuk GEMS (n = 1576) dan CoLaus (N = 2086) dan dalam mata pelajaran dislipidemia untuk GEMS (N = 787). Varian diidentifikasi sebagai terkait dalam ini analisis awal dievaluasi dalam studi replikasi kecil (Hanya myeloperoxidase [MPO] dan laju filtrasi glomerulus

[GFR] hasil yang diperoleh) dalam Kardiovaskular Studi Kesehatan (CHS) dan Framingham Heart Study (FHS). Varian yang sama kemudian dianalisis secara lebih luas untuk hubungan dengan 40 sifat kardiovaskular dan metabolisme dalam meta-analisis di set diperluas termasuk CoLaus, Hidup Ilmu Calon Penduduk Studi (LOLIPOP), Eropa Investigasi Calon Kanker (EPIC) -Norfolk, Ely, Fenland, dan Genetika Asosiasi Obesitas (Genoa) Studi (Tabel 1 memberikan ringkasan sampel yang dianalisis dan Gambar 1 diagram alir penelitian) untuk memberikan kardiovaskular sebuah dan profil metabolik. Kami merangkum hasil dan menggambarkan bagaimana mereka mungkin berhubungan dengan hasil uji klinis. Bahan dan Metode Karakteristik Penduduk GEMS Studi Penelitian GEMS adalah studi multinasional besar yang dirancang untuk menjelajahi dasar genetik dari syndrome.6 metabolik Subyek direkrut dari 2 pusat di Eropa (Oulu, Finlandia dan Lausanne, Swiss), 1 di Amerika Serikat (Dallas, TX), 1 di Kanada (Ottawa, Ontario), dan 1 di Australia (Adelaide, Australia Selatan). Subyek dislipidemia diminta untuk memiliki kombinasi dari tinggi plasma trigliserida (> persentil ke-75) dan highdensity serum rendah lipoprotein (HDL) -cholesterol (
persentil, kolesterol HDL serum> persentil ke-50 untuk mereka usia, jenis kelamin, dan negara ambang, indeks massa tubuh (BMI) > 25 kg / m2, dan menjadi> 40 tahun. Subyek memiliki fenotipe untuk jantung dan sifat metabolik juga sebagai biomarker peradangan. Subyek dislipidemia (N = 787 orang) dan normolipidemic kontrol (n = 792 subyek), cocok dengan jenis kelamin, usia, dan pusat koleksi yang sequencing. Dalam beberapa analisis, hanya dislipidemia subyek dianalisis. Cardiovascular Health Study The CHS adalah, studi observasional berdasarkan populasi risiko faktor klinis dan subklinis diseases.8 kardiovaskular Penelitian itu melibatkan peserta 65 tahun dan lebih tua dari 4 US masyarakat (Forsyth County, North Carolina, Sacramento County, California; Washington County, Maryland; dan Pittsburgh, Pennsylvania) dalam 2 tahap: 5201 peserta dari 1989-1990, dan 687 (terutama peserta Afrika Amerika) dari tahun 1992 hingga 1993. peserta CHS selesai pemeriksaan klinis standar dan kuesioner di Studi awal dan pada 9 kunjungan tindak lanjut tahunan. Tindak lanjut untuk peristiwa klinis terjadi setiap 6 bulan. MPO diukur dari sampel plasma beku (n = 3044) dikumpulkan di 1992-1993 pemeriksaan CHS. termasuk 5.124 anak-anak dari kelompok asli dan mereka Tindakan spouses.10 Serum MPO tersedia untuk 2940 FHS Offspring kohort peserta selama siklus ketujuh Pemeriksaan (1998-2001).

CoLaus Studi Studi CoLaus adalah studi berbasis komunitas 6188 Subyek putih Eropa berusia 35-75 tahun. Peserta diambil dari Rumah Sakit Universitas CHUV di Lausanne Switzerland7 dan belajar untuk jantung dan metabolisme fenotipe. Studi LOLIPOP London Life Sciences Calon Studi Kependudukan (LOLIPOP) adalah studi berbasis populasi dari 21 915 subyek diidentifikasi dari daftar 58 dokter umum di Barat London.11 Peserta terutama India dan Asia Kulit putih Eropa berusia 35-75 tahun, yang telah ditandai untuk fenotipe kardiovaskular. Hanya Eropa putih (n = 6565) dimasukkan dalam analisis ini. EPIC-Norfolk Penelitian EPIC-Norfolk adalah studi kohort menyelidiki hubungan antara diet dan insiden disease.12 Lebih 25 639 pria dan wanita berusia antara 45 dan 74 adalah direkrut di Norwich dan daerah sekitarnya. Subjek ditandai untuk fenotipe kardiovaskular dan metabolisme. MPO tersedia dalam sampel serum dasar nonfasted untuk 1138 kasus penyakit arteri koroner insiden dan 2237 kontrol setelah 8 tahun tindak lanjut. Fenland The Fenland Studi adalah berkelanjutan, berbasis populasi kohort Penelitian (dimulai pada tahun 2005) yang dirancang untuk menyelidiki asosiasi antara faktor lingkungan genetik dan gaya hidup dan

risiko obesitas, sensitivitas insulin, hiperglikemia, dan ciri-ciri metabolik terkait pada pria dan wanita berusia 30 sampai 55 tahun.13 Peserta direkrut dari Praktek Umum frame pengambilan sampel di wilayah Fenland, Ely, dan Cambridge dari Perawatan Kepercayaan Cambridgeshire Primer di Inggris Raya. Setelah puasa semalam, peserta menjalani Pemeriksaan klinis rinci, dan darah sampel dikumpulkan. Data hingga 5105 peserta termasuk dalam analisis saat ini. Ely MRC Ely Study adalah kohort berbasis populasi secara acak dipilih dari orang-orang yang tinggal di Ely dan desa-desa sekitarnya (East Anglia, Inggris Raya), seorang etnis homogen Populasi keturunan Eropa. Desain penelitian, metode, dan pengukuran dari 3 fase telah dijelaskan secara rinci elsewhere.14 saat ini analisis termasuk termasuk 5.124 anak-anak dari kelompok asli dan mereka Tindakan spouses.10 Serum MPO tersedia untuk 2940 FHS Offspring kohort peserta selama siklus ketujuh Pemeriksaan (1998-2001). CoLaus Studi Studi CoLaus adalah studi berbasis komunitas 6188 Subyek putih Eropa berusia 35-75 tahun. Peserta diambil dari Rumah Sakit Universitas CHUV di Lausanne Switzerland7 dan belajar untuk jantung dan metabolisme fenotipe. Studi LOLIPOP

London Life Sciences Calon Studi Kependudukan (LOLIPOP) adalah studi berbasis populasi dari 21 915 subyek diidentifikasi dari daftar 58 dokter umum di Barat London.11 Peserta terutama India dan Asia Kulit putih Eropa berusia 35-75 tahun, yang telah ditandai untuk fenotipe kardiovaskular. Hanya Eropa putih (n = 6565) dimasukkan dalam analisis ini. EPIC-Norfolk Penelitian EPIC-Norfolk adalah studi kohort menyelidiki hubungan antara diet dan insiden disease.12 Lebih 25 639 pria dan wanita berusia antara 45 dan 74 adalah direkrut di Norwich dan daerah sekitarnya. Subjek ditandai untuk fenotipe kardiovaskular dan metabolisme. MPO tersedia dalam sampel serum dasar nonfasted untuk 1138 kasus penyakit arteri koroner insiden dan 2237 kontrol setelah 8 tahun tindak lanjut. Fenland The Fenland Studi adalah berkelanjutan, berbasis populasi kohort Penelitian (dimulai pada tahun 2005) yang dirancang untuk menyelidiki asosiasi antara faktor lingkungan genetik dan gaya hidup dan risiko obesitas, sensitivitas insulin, hiperglikemia, dan ciri-ciri metabolik terkait pada pria dan wanita berusia 30 sampai 55 tahun.13 Peserta direkrut dari Praktek Umum frame pengambilan sampel di wilayah Fenland, Ely, dan Cambridge dari Perawatan Kepercayaan Cambridgeshire Primer di Inggris Raya. Setelah puasa semalam, peserta menjalani Pemeriksaan klinis rinci, dan darah sampel

dikumpulkan. Data hingga 5105 peserta termasuk dalam analisis saat ini. Ely MRC Ely Study adalah kohort berbasis populasi secara acak dipilih dari orang-orang yang tinggal di Ely dan desa-desa sekitarnya (East Anglia, Inggris Raya), seorang etnis homogen Populasi keturunan Eropa. Desain penelitian, metode, dan pengukuran dari 3 fase telah dijelaskan secara rinci elsewhere.14 saat ini analisis termasuk individu berusia 35-79 tahun, dari fase 3. Data dari sampai dengan 1606 peserta termasuk dalam saat analisis. Genoa Genetika Asosiasi Obesitas (Genoa) studi adalah studi kasus-kontrol dengan 1.008 obesitas (BMI> 30) mata pelajaran putih direkrut dari obesitas klinik manajemen berat badan Ottowa dan 991 kontrol putih (BMI
dan serum nonfasting untuk EPIC-Norfolk. MPO ditentukan di GEMS oleh Pathway Diagnostics (Cypress, CA) dengan menggunakan Myeloperoxidase ELISA kit # K6631 dari ALPCO Diagnostik (Salem, NH). CHS dan EPIC-Norfolk baik menggunakan CardioMPO Uji (PrognostiX Inc, Cleveland, OH), Food and Drug Administrasi disetujui roti enzyme-linked immunosorbent assay. Nilai kontrol normal dari usia menengah populasi yang sehat telah dilaporkan <640 pmol / L. Batas deteksi minimum (dihitung menggunakan interpolasi mean ditambah 2 SD) adalah 30 pmol / L, dan dalam waktu-run ketepatan 4,8% itu reported.16 Dalam FHS, kuantitatif ELISA kit digunakan (Oxis, Cat. No. 21013) dan membaca pada Molekul Perangkat VersaMax lempeng pembaca. Minimum Dosis terdeteksi adalah 0,17 ng / mL, kisaran kurva standar adalah 0-25 ng / mL, dan variabilitas intra-assay adalah 3,15%. Fenotipe dianalisis Tabel 1 ciri masing-masing sampel set dianalisis dan daftar semua fenotipe dianalisis dalam analisis awal dari GEMS pengumpulan, replikasi analisis untuk CHS dan FHS, dan analisis profil untuk CoLaus, LOLIPOP, EPIC-Norfolk, Fenland Ely, dan Genoa studi. Tabel 2 mencirikan subkelompok dislipidemia saja. Peserta obesitas diminta untuk memiliki BMI ≥30 kg / m2 dan usia ≥18 tahun. Kontrol ramping diminta untuk memiliki saat BMI yang persentil ≤40th usia dan jenis kelamin mereka kelompok dan sebelumnya tidak dilaporkan memiliki BMI> 25 persentil untuk usia dan jenis kelamin selama lebih dari 2 ruang individu berturut-turut

periode dan usia ≥18 tahun. Subyek dislipidemia adalah dipilih untuk trigliserida tinggi (≥75th persentil) dan rendah Kolesterol HDL (persentil ≤25th) berdasarkan usia, jenis kelamin, dan ambang batas negara. Subyek Normolipidemic dipilih untuk kolesterol HDL yang tinggi (di atas median), trigliserida rendah (di bawah median), dan BMI> 25,6 Genotip CHS Genotip untuk RS612049 dilakukan dengan menggunakan adat IBCv2 genotip Array yang berisi nukleotida tunggal tinggi polimorfisme (SNP) kepadatan penanda dan cakupan LD untuk ? 2100 gen yang berhubungan dengan kardiovaskular, peradangan, hemostasis / koagulasi, dan phenotypes.17 metabolik FHS RS612049, penanda genom studi asosiasi luas, dari array Affymetrix 500K tersedia dan diamati di sempurna linkage disequilibrium dengan RS2859144 di HapMap Sampel CEU. CoLaus dan LOLIPOP RS2859144 itu genotipe dalam koleksi CoLaus seluruh dan 6565 mata pelajaran putih Eropa dari LOLIPOP yang koleksi di KBiosciences menggunakan teknologi Kaspar (Hoddeson, Inggris). EPIC, Ely, Fenland, dan EPIC-Norfolk RS612049 itu genotipe di laboratorium MRC Cambridge menggunakan Teknologi Sequenom (2 plexes). Genoa

RS2859144 dinilai dalam koleksi ini dengan imputasi. Haplotype referensi (NCBI Build 36) dari sequencing studi (n = 3983) yang diperhitungkan dalam kasus (810) dan kontrol (830) dari koleksi Genoa dengan Affymetrix 6.0 Array data menggunakan BEAGLE18 dengan pengaturan default. RS2859144 baik diperhitungkan dengan r2 = 0,898 imputasi. Metode statistik Analisis awal dari varian diidentifikasi oleh sekuensing untuk MAPK14 dan MAPK11 gen untuk GEMS dan subset Sampel CoLaus dilakukan dengan menggunakan aditif genetik Model dengan linear atau regresi logistik dan sampai 40 kardiovaskular dan metabolisme sifat. Sebuah alam log-transformasi diaplikasikan untuk sifat kuantitatif dengan non-normal distribusi setelah outlier yang winsorized di persentil 99.9th dari distribusi. Analisis sifat kuantitatif didasarkan pada residual normal setelah disesuaikan untuk kovariat signifikan termasuk status dislipidemia, usia, jenis kelamin, situs koleksi, pinggang dan lingkar pinggul untuk studi GEMS dan usia, jenis kelamin, BMI (jika ada), merokok, aktivitas fisik, dan penggunaan alkohol untuk studi CoLaus. Sifat biner dianalisis dengan dan tanpa penyesuaian kovariat yang relevan. SNP dengan setidaknya 10 salinan alel minor dianalisis secara individual, sedangkan SNP putatively fungsional dengan frekuensi alel minor <0,5% adalah aggregated.19 Ada 7 (MAPK11) ditambah 15 (MAPK14) varian dianalisis secara individual dalam GEMS, dan 6 (MAPK11) ditambah 13 (MAPK14) varian di CoLaus. Tiga Tes agregat dilakukan untuk masing-masing gen: (1) semua langka

varian yang menyebabkan perubahan dalam urutan asam amino (Nonsynonymous, omong kosong, readthrough, dan situs sambatan varian), (2) semua langka, amino acid berubah varian yang diprediksi akan fungsional merusak oleh SIFT atau PolyPhen, dan (3) varian dalam (2) ditambah varian langka tambahan di sangat dasar posisi kekal (phyloP ≥2). Analisis dilakukan dalam semua mata pelajaran dan GEMS dislipidemia hanya mata pelajaran). Ambang batas signifikansi Bonferroni-dikoreksi menyesuaikan jumlah varian diuji di kedua gen, sejumlah sifat, dan jumlah sub kelompok dianalisis ditetapkan pada P = 0,05 / (389 (22 + 6) 92) = 2,35910? 5 untuk GEMS dan P = 0,05 / (409 (19 + 6)) = 5,0910? 5 untuk studi CoLaus, masing-masing. Hubungan genetik analisis varian genotipe (Rs2859144 atau kuasanya) untuk set lengkap CoLaus, LOLIPOP, EPIC-Norfolk, Ely, Fenland, studi CHS, dan FHS dilakukan dalam setiap studi (setelah transformasi seperti yang dijelaskan sebelumnya) di bawah model genetik aditif menggunakan linear atau logistik regresi, dan linier campuran-efek atau umum estimasi model persamaan di FHS untuk menjelaskan korelasi keluarga. Untuk mengakomodasi ketidakpastian genotipe diperhitungkan, alel dosis dalam studi Genoa dianalisis sebagai kontinyu variabel dalam linear / regresi logistik. Obesitas-only dan dyslipidemichanya analisis subkelompok dilakukan untuk mengaktifkan replikasi beberapa hasil studi-konteks tertentu. Dalam Studi CoLaus, 330 subjek dihapus dari analisis karena kekerabatan genetis (PI_HAT> 0,125) berdasarkan identitas

oleh keturunan (IBD) berbagi diperkirakan dari Plink menggunakan yang sudah ada Data Affy500K. Ringkasan statistik dari semua studi yang meta-analisis dengan menggunakan varians terbalik method.20 P Nilai ambang batas untuk replikasi dari asosiasi MPO di CHS dan FHS ditetapkan pada P = 0,05. Untuk kardiovaskular diperluas dan profil metabolik, makna Bonferroni-dikoreksi ambang batas yang digunakan untuk meta-analisis, menyesuaikan untuk sifat dievaluasi (P = 0,05 / 40 = 0,00125). GEMS inflamasi Penanda Metode yang digunakan untuk pengukuran lipid plasma dan glukosa dalam serum telah dijelaskan previously.6 Semua tambahan biomarker diukur oleh Pathway Diagnostics (Cypress, CA) baik menggunakan plasma atau serum. Serum beku dan beberapa aliquots spesimen plasma EDTA diterima di Pathway Diagnosa pada es kering. Spesimen disimpan di? 70 ° C sampai dicairkan untuk pengujian. Karena itu tidak mungkin logistik untuk melakukan semua dari banyak tes untuk suatu subjek tertentu pada hari yang sama, Aliquot plasma tidak menggenang. Sebaliknya, individu aliquot serum dan plasma yang dicairkan seperlunya dan diuji seefisien mungkin; yaitu, sebanyak tes individu sebagai praktis dijalankan dengan dicairkan aliquot dalam 8 jam setelah dicairkan. Sementara minor heterogenitas antara aliquots mungkin, metode ini diminimalkan risiko stabilitas spesimen yang mungkin memiliki terjadi jika spesimen disimpan dalam waktu lama pada 2 sampai 8 ° C atau melalui beberapa siklus freeze / thaw. Setelah dicairkan, plasma telah dihapus untuk setiap uji dan diencerkan (jika perlu,

tergantung pada uji) dengan menggunakan buffer-assay spesifik. Adiponektin diukur dengan menggunakan uji ELISA (R & D Sistem, Minneapolis, MN); CRP dan insulin diukur menggunakan tes chemiluminescent (Diagnostik Produk Corp, Los Angeles, CA); LDL partikel ukuran diukur dengan menggunakan LipoPrint kit dari Quantimetrix Corporation (Redondo Beach, CA); leptin dikuantifikasi dengan menggunakan ELISA (Lab Amerika Produk Perusahaan, Windham, NH) dan apo B diukur menggunakan uji immunoturbidometric (Polymedco). PAI-1 adalah dievaluasi dengan menggunakan PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor, Tipe 1) ELISA kit # EL504 dari Dakocytomation (Carpinteria, CA). MPO ditentukan dengan menggunakan ELISA Myeloperoxidase kit # K6631 dari ALPCO Diagnostics (Salem, NH). MMP9 adalah diukur dengan menggunakan MMP9 yang (Total) Quantikine ELISA kit # DMP900 dari R & D Systems (Minneapolis, MN). Teroksidasi LDL dievaluasi dalam serum menggunakan LDL teroksidasi (Ab) EIA kit # 04-BI-20032 dari ALPCO Diagnostics. Pengujian Multiplex interleukin (IL) -1a, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, monosit chemotactic protein 1 (MCP1), adhesi sel vaskular larut molekul, larut molekul adhesi intraseluler, dan tumor necrosis factor a dilakukan dengan menggunakan kit disesuaikan dibeli dari Beckman Coulter (Fullerton, CA) untuk penentuan menggunakan pembaca Beckman Coulter A-SquareTM. Prothombin F1 + 2 dan Fibrinogen ditentukan dengan menggunakan Prothombin F1 + 2 ELISA kit #REFOWVVII dari Dade Behring(Newark, DE) dan Fibrinogen (Clauss) kit # 0008469110 oleh Instrumen Laboratorium (Milan, Italia), masing-masing. Instruksi

disediakan oleh produsen diikuti untuk setiap test kit. Semua penentuan kolorimetri dibuat menggunakan Tecan Genios ProTM (Grödig, Austria) plat pembaca dan dianalisis menggunakan software MagellanTM kecuali untuk multipleks Tes yang dilakukan dengan menggunakan Beckman Coulter ASQUARE TM reader dan Fibrinogen, yang dievaluasi ACL AdvanceTM (Beckman Coulter). Sementara plasma sitrat adalah matriks yang lebih disukai untuk penentuan protrombin F1 + 2 dan Fibrinogen, hanya EDTA plasma yang tersedia untuk pengujian. Sebuah studi perbandingan kecil dilakukan pada Pathway Diagnostik EDTA plasma dibandingkan sitrat plasma dari sukarelawan sehat dilakukan dan menghasilkan hasil yang sama. Atas permintaan GSK, Prothrombin F1 + 2 dan Fibrinogen dilakukan pada spesimen EDTA. hasil Resequencing The (ekson, batas intron-exon, dan daerah belum diterjemahkan) dari MAPK14 dan MAPK11 gen (7844 bp Total) di 14 002 subyek beragam etnis termasuk subyek yang phenotyped dari GEMS (n = 1579) dan CoLaus (n = 2086) koleksi telah dijelaskan previously.4 Dalam ke-14 002 subyek, kami mengidentifikasi 232 dan 157 SNP, termasuk 2.822 dan 27 perubahan asam amino dan situs sambatan, serta 135 dan 78 SNP di wilayah diterjemahkan, masing-masing. Untuk MAPK14, varian termasuk varian sambatan (RS200906391) umum (MAF> 0,5%) di semua etnis dan tambahan coding varian hadir hanya di Afrika Amerika (S64Y). Selain itu, ada 2 diprediksi fungsional

(PHYLOP> 2) frekuensi rendah varian L250F (26 operator) dan D343G (35 operator) ditemukan terutama di Eropa. Sisa varian fungsional diperkirakan sangat jarang, sebagian besar mutasi swasta. Untuk MAPK11, kami mengamati 1 umum varian nonsynonymous di semua etnis (R275H) dan hanya E177K diperkirakan akan fungsional (PHYLOP> 2) dan tidak swasta di Eropa. Varian diidentifikasi dalam MAPK11 yang dan gen MAPK14 dilaporkan previously.4 Gambar 2 meringkas variasi yang ditemukan dalam 12 514 putih Eropa, 594 Afrika Amerika, dan 567 mata pelajaran Asia Selatan untuk Gen MAPK14 dan Gambar 3 untuk gen MAPK11. Variasi umum dan langka di MAPK14 dan MAPK11 gen dan daerah mengapit dianalisis untuk asosiasi dengan kardiovaskular, metabolisme, dan sifat-sifat biomarker inflamasi tersedia dalam GEMS (n = 1579) dan subset diurutkan dari CoLaus (n = 2086). Dalam GEMS, analisis untuk MAPK14 dan Gen MAPK11 termasuk 15 dan 7 umum (MAF> 0,5%) varian individual, sedangkan analisis agregat termasuk 12 dan 6 varian langka, masing-masing. Di CoLaus, satu-varian analisis untuk MAPK14 dan MAPK11 gen termasuk 13 dan 6 SNP umum, sementara analisis agregat termasuk 10 dan 5 varian langka, masing-masing. Analisis dilakukan di koleksi GEMS pada semua sampel (38 sifat) dan dalam subyek dislipidemia (35 sifat) dan dalam koleksi CoLaus pada semua sampel (40 sifat). Dari babak awal analisis ini, a hubungan yang signifikan tercatat untuk SNP frekuensi rendah, RS2859144 (1,5% MAF) di MAPK14 dengan MPO dalam

subyek dislipidemia (P = 2,3910? 6) di GEMS. Asosiasi ini diilustrasikan pada Gambar 4. SNP ini berada di linkage ketat disequilibrium (r2 = 1) dengan sinonim SNP RS2815805 (H253H) dan keduanya memiliki frekuensi alel minor yang sama. Lihat Gambar 5 untuk skema gen. Menariknya, RS2859144 adalah tidak terkait dengan MPO di GEMS keseluruhan dan lebih dekat inspeksi, efek alel terpantau berada berlawanan kontrol normolipidemic dibandingkan dengan dislipidemia yang kasus (interaksi P = 1,7910? 6). Gambar 6 merangkum hasil untuk semua ciri-ciri dalam GEMS (Gambar 6A-dislipidemia dan normolipidemic gabungan) dan CoLaus koleksi (B) untuk MAPK14, serta MAPK11 (Gambar 6C melalui 6E), termasuk P-nilai minimum untuk SNP umum dan pvalue untuk agregat analisis untuk varian langka. Ambang batas untuk analisis yang disorot dalam grafik dan ditetapkan dalam legenda angka. Tidak ada hubungan yang signifikan secara statistik lain (Umum atau agregat SNPs) yang tercatat dalam MAPK14 dan MAPK11 gen; Namun, nominal yang signifikan asosiasi (P = 0,016) diamati antara varian langka di MAPK14 dan IL-6 tingkat (Gambar 7), sebuah farmakodinamik dikenal penanda losmapimod. Seperti interaksi tersebut sering hasil dari kebetulan, kami dicari replikasi dalam kohort tambahan di mana MPO dan fenotipe dislipidemia yang tersedia. RS2859144 Baik atau RS2815805 hadir pada platform genotip umum untuk CHS dan FHS studi, tetapi penanda lain tinggi linkage disequilibrium (r2 = 1) yang tersedia (RS612049).

Meskipun frekuensi yang rendah, varian ini dengan baik ditandai oleh genom lebar SNP studi asosiasi. Kami memperoleh genotipe Data SNP dari CHS dan FHS mana RS612049, puasa lipid, dan MPO yang tersedia dalam sampel populasi. Kriteria dislipidemia dan normolipidemic dari GEMS adalah diterapkan pada 2 kohort berbasis populasi, dan analisis adalah dilakukan pada mereka subkelompok. RS612049 juga genotipe dalam sampel EPIC-Norfolk di mana tingkat MPO adalah diukur dalam pasien yang tidak berpuasa dalam sebuah kardiovaskular studi kasus-kontrol bersarang (kasus n = 1.138 dan kontrol n = 2237) .21 Sebagai kasus insiden yang diperkaya untuk tinggi Tingkat MPO, mengingat hubungan antara arteri koroner Penyakit dan MPO diamati dalam sampel ini, 21 kami hanya memasukkan kontrol dalam meta-analisis. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 8A, yang CHS dan FHS penelitian, tetapi tidak kontrol EPIC, asalkan bukti tambahan menunjukkan hubungan dengan tinggi Tingkat MPO dalam kelompok dislipidemia (meta-P = 7,56910? 6) dan tidak ada hubungan dalam subkelompok normolipidemic (meta-P = 0,62) pada Gambar 8B. Rata-rata ukuran efek dalam kelompok dislipidemia adalah cukup besar, dengan masing-masing tambahan salinan alel minor sesuai dengan peningkatan rata-rata dari 0,47 SD di tingkat MPO. Nilai replikasi P dihitung oleh meta-analisis FHS, CHS, dan EPIC kontrol yang signifikan, P = 0,009 (0,31 SD rata-rata kenaikan) untuk dislipidemia yang kelompok. Varian dikaitkan dengan peningkatan tingkat MPO kemudian dianalisis untuk hubungan dengan sampai 40 kardiovaskular dan

sifat metabolisme dalam CoLaus, LOLIPOP, EPIC Norfolk, Ely, Fenland, dan Genoa studi untuk memberikan pemahaman lebih lanjut ke dalam hubungan yang diamati. RS612049 diketik di Ely dan Fenland, dan RS2859144 telah diperhitungkan di Genoa studi kasus-kontrol dan mengetik LOLIPOP dan sisa Sampel CoLaus untuk memberikan data tambahan. Meskipun tidak signifikan setelah disesuaikan untuk analisis 40 sifat (P = 0,00125), ada beberapa asosiasi nominal yang yang terarah konsisten (Angka 9 dan 10). Dalam keseluruhan populasi (Gambar 10A), alel yang sama terkait dengan MPO lebih tinggi dalam mata pelajaran dislipidemia muncul untuk menganugerahkan sedikit GFR lebih rendah (Gambar 9A, b? 0,086, P = 0,002) serta sebagai peningkatan risiko obesitas (Gambar 9B, rasio odds 1,25, P = 0,005). Asosiasi nominal juga diamati untuk asam urat tinggi (Gambar 9C, P = 0,01), meskipun ini hanya tersedia dalam beberapa studi. Dalam subkelompok dislipidemia (Angka 9 dan 10B), asosiasi nominal diamati dengan sistolik lebih rendah (Gambar 9D, P = 0,002) dan darah diastolik tekanan (Gambar 9D, P = 0,01) serta lebih rendah HOMA-B (Gambar 9E, P = 0,03) dan glukosa puasa lebih tinggi (Gambar 9F, P = 0,04). Selain itu, ada banyak lagi inflammationlinked spidol tersedia dalam GEMS dari yang tersedia di penelitian lain dan orang-orang, RS2859144 juga nominal terkait dengan teroksidasi-LDL pada kelompok dislipidemia (b ? 0,4, P = 0,03). Diskusi Kami berusaha untuk mengkarakterisasi variasi gen di MAPK11 / 14 gen

pada individu yang phenotyped untuk mengidentifikasi varian genetik yang dapat digunakan untuk memprediksi efek obat dan menghasilkan hipotesis sekitar indikasi alternatif untuk MAPK-a / b inhibitor termasuk Losmapimod, sebuah p38 peta kinase inhibitor dalam pembangunan untuk sindrom koroner akut. Sequencing komprehensif dimaksudkan bahwa 94% dari alel varian dengan frekuensi alel kecil 0,01% di Eropa itu sampel setidaknya sekali. Varian hadir dalam koleksi GEMSand CoLaus dikarakterisasi menggunakan fenotipe kardiovaskular, metabolisme, dan biomarker. Kami mengidentifikasi sebuah asosiasi RS2859144 di MAPK14 dengan MPO pada populasi dislipidemia (GEMS, P = 2,3910? 6). Ini varian RS2859144 (atau kuasanya) secara konsisten terkait dengan MPO di FHS dan CHS studi (replikasi meta-P = 0,003), menyebabkan nilai meta-P dari 9,96910? 7 di 3 dislipidemia kelompok. Varian atau kuasanya kemudian diprofilkan dalam tambahan kohort berbasis populasi (hingga total 58 930 subjek) termasuk CoLaus, Ely, Fenland, EPIC, LOLIPOP, dan Genoa mempelajari obesitas kasus-kontrol untuk 40 kardiovaskular dan ciri-ciri metabolik menyoroti SNP yang sama, yang juga nominal terkait konsisten dengan GFR (P = 0,002) dan risiko obesitas (BMI≥30 kg / m2, P = 0,004) dalam analisis secara keseluruhan. BMI sebagai sifat kontinyu tidak nominal signifikan (P = 0,052) dan tidak signifikan dalam konsorsium GIANT, 22 menunjukkan baik ini adalah positif palsu atau khusus untuk lebih Bentuk ekstrim obesitas. Dalam sequencing diidentifikasi hanya 1 frekuensi rendah coding varian dalam MAPK11 (rs33932986, R275H, MAF = 0,02) dan

tidak ada orang lain dengan lebih dari beberapa salinan. Kami mengamati hanya 1 frekuensi rendah coding sambatan varian dalam MAPK14 (Rs200906391, Eropa MAF = 0,0067), dan hanya 2 lainnya Varian yang hadir dengan lebih dari beberapa eksemplar dalam Eropa (L250F dan D343G). Fungsi dari 2 langka varian diamati dalam studi ini (L250F dan D343G) belum diteliti, meskipun skor PHYLOP dari> 2 menunjukkan bahwa mereka evolusi dilestarikan. Tidak ada asosiasi yang kuat diamati dengan ini 2 varian, meskipun secara nominal Asosiasi varian langka signifikan diamati dengan IL-6 tingkatan dalam GEMS (Gambar 11). Pengobatan dengan SB681323 (a back-up P38 MAPK inhibitor) menunjukkan kecenderungan untuk mengurangi IL-6 produksi 2 hari setelah percutaneous sebuah intervention1 dan juga secara signifikan mengurangi IL-6 di rheumatoid pasien arthritis setelah dose.23 tunggal 3-frekuensi rendah varian dalam disequilibrium linkage tinggi yang ditemukan terkait dengan MPO serta obesitas dan GFR belum fungsional ditandai. Dua varian ini berada dalam MAPK14, RS2859144 dalam Wilayah dan RS2815805 30untranslated dalam ekson 9, RS612049 adalah 50 sampai MAPK14 dan juga jatuh dalam pertama ekson dari SLC26A8, yang dituangkan dalam berlawanan arah (Gambar 4). SLC26A8 adalah transporter anion dinyatakan hanya dalam testes24 dan karena itu tidak mungkin untuk menjelaskan efek yang diamati di sini. Kami mencari ENKODE Data melalui portal25 RegulomeDB untuk melihat apakah ada bukti fungsi pengaturan SNP tersebut. RS281505

menunjukkan bukti mengikat hanya minimal berdasarkan transkripsi Faktor mengikat dan adanya puncak DNase. Dengan demikian, fungsi yang mendasari asosiasi ini tetap menjadi ditentukan. Terakhir, menurut asosiasi genom lebar mempelajari pusat, RS612049 dan lainnya SNP di linkage disequilibrium dekat dengan genome-wide signifikan (minimal P = 3910? 8) untuk tinggi only.26 Hubungan tingkat MPO dan varian MAPK14 memberikan pemahaman yang berharga tentang aksi MAPK-a / b inhibitor. Tingkat MPO tinggi merupakan prognostik yang penting penanda dalam memprediksi kejadian koroner di individuals21 sehat dan patients16,27 penyakit arteri koroner dan dengan demikian aligned baik dengan hasil yang diperoleh dalam penelitian SOLSTICE mana pengurangan intervensi kejadian koroner perkutan pascadiamati pada pasien Losmapimod.3 Selain itu, ada beberapa preseden untuk ketergantungan pada kolesterol HDL, seperti MPO telah diamati untuk memprediksi stenosis karotis hanya pada latar belakang HDL rendah cholesterol.28 MPO adalah leukocytederived sebuah enzim yang mengkatalisis pembentukan sejumlah spesies oksigen reaktif, yang berkontribusi terhadap kerusakan jaringan selama inflamasi. Selektif memodifikasi apolipoprotein A-I, menghasilkan kolesterol HDL disfungsional dengan gangguan Kegiatan penghabisan kolesterol serta menghasilkan pro-aterogenik bentuk LDL dimodifikasi cholesterol.29 A penentu utama perkembangan plak koroner atau tingkat regresi adalah keseimbangan antara kolesterol serapan dibandingkan jalur penghabisan, dan kelebihan MPO akan cenderung merusak kedua proses. Itu

hubungan antara MPO dan p38 peta kinase adalah lebih didukung oleh tren pengurangan MPO pasca-perkutan intervensi dengan pasien SB681323 diobati dibandingkan dengan peningkatan pada pasien plasebo (Gambar 11) .1 Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan adanya hubungan mekanistik antara P38 peta kinase dan MPO, sehingga memberikan bukti untuk mendukung Indikasi saat sindrom koroner akut untuk Losmapimod. Kita juga bisa berhipotesis bahwa pasien dengan HDL rendah dan / atau tingkat MPO tinggi mungkin manfaat lebih dari Losmapimod pengobatan daripada mereka yang tidak level tersebut. Set yang sama penanda genetik yang dikaitkan dengan MPO juga menunjukkan beberapa asosiasi sugestif dengan lainnya ciri-ciri dalam sampel secara keseluruhan. Lebih rendah GFR dan peningkatan risiko obesitas sebagai sifat biner dipamerkan terarah konsisten asosiasi di 6 dataset, meskipun ini tidak secara statistik signifikan. Hubungan antara peradangan dan obesitas mapan; Oleh karena itu, tidak mengherankan untuk mengamati peningkatan risiko obesitas terkait dengan alel yang sama terkait dengan tinggi MPO, meskipun kurangnya asosiasi BMI di Konsorsium GIANT mungkin mengatakan bahwa ini adalah positif palsu atau terkait dengan parameter obesitas lebih ekstrim. GFR adalah umum digunakan ukuran klinis fungsi ginjal, dan ada bukti untuk peran patogenik penting bagi p38 MAPK aktivasi di glomerulonephritis.30 manusia Selanjutnya, perlindungan dari fungsi ginjal yang diberikan oleh p38 peta kinase inhibitor telah diamati dalam model praklinis hipertensi. 31 Dengan demikian, inhibitor p38 peta kinase akan diprediksi tidak

hanya memiliki efek kardioprotektif, tetapi juga pelindung efek pada ginjal dan bahkan mungkin menghasilkan beberapa berat badan kerugian, meskipun yang terakhir akan tidak mungkin dengan penggunaan jangka pendek. Terakhir, kadar asam urat tinggi bisa diartikan sebagai Indikator spesifik dari peningkatan risiko kardiovaskular, yang tidak dianggap dalam dirinya sendiri causal.32,33 Variabel nominal terkait dengan MAPK14 yang varian dalam subkelompok dislipidemia perlu ditafsirkan dengan hati-hati karena sederhana tingkat signifikansi dan kecil jumlah operator, namun disediakan untuk tujuan deskriptif. Jika mereka dikonfirmasi dalam ukuran sampel yang lebih besar, mereka akan menyarankan metabolik sindrom fenotipe sedikit lebih buruk di operator dibandingkan dengan noncarriers. Keterbatasan yang lebih umum laporan ini meliputi berikut ini: relatif kecil jumlah operator karena frekuensi rendah dari varian, kekuasaan terbatas untuk mendeteksi asosiasi dengan varian langka kecuali efek besar, data dibatasi untuk populasi Eropa asal, dan fakta bahwa varian kausal yang sebenarnya tidak diketahui. Kesimpulannya, dengan sequencing kita telah menentukan penuh berbagai variasi exonic, hadir pada individu dari Eropa keturunan, dalam MAPK14 dan MAPK11 dan diuji untuk asosiasi dengan berbagai sifat dan kondisi. Kita kemudian ditindaklanjuti temuan yang paling menjanjikan dalam hingga 58 930 subyek. Asosiasi yang paling konsisten diamati adalah dengan varian di MAPK14 dan MPO pada HDL-C rendah latar belakang dan juga asosiasi yang lebih marjinal dengan risiko obesitas dan fungsi ginjal dalam analisis secara keseluruhan. Ini

Hasil penelitian juga menggambarkan bagaimana pertambangan variasi frekuensi rendah dapat mengungkapkan alat yang berguna untuk menghubungkan gen dengan fenotipe menarik, ketika variasi umum belum informatif. Penelitian ini juga menggambarkan nilai memiliki baik antara fenotipe dan bagaimana ekstrim sampling, seperti dalam kasus GEMS, dapat mengungkapkan asosiasi-konteks tertentu tidak diamati dalam semua pendatang. Namun, variasi frekuensi rendah tidak memerlukan akses ke sampel tindak lanjut substansial untuk mengevaluasi konsistensi data, terutama dalam kasus ini di mana efek genetik itu sebagian tergantung konteks. Terakhir, sequencing di beberapa kelompok etnis menunjukkan bahwa subyek asal Afrika akan kepentingan tertentu untuk ditindak lanjuti, sebagai penanda RS2859144 dan istimewa adalah jauh lebih umum di Afrika-Amerika (MAF 14%) sebagai dibandingkan dengan subyek asal Eropa. Ucapan Terima Kasih Kami berterima kasih kepada tim persiapan sampel GSK, dan D. Fraser untuk data persiapan, dan K. Johansson untuk diperiksa persetujuan. Kami berterima kasih kepada GEMS Penyidik studi: Philip Barter, PhD; Y. Antero Kes € aniemi, PhD; Robert W. Mahley, PhD; Ruth McPherson, FRCP; dan Scott M. Grundy, PhD. Kami juga berterima kasih kepada Dr Waeber MD, yang CoLaus PI Peter Vollenweider, MD dan Gerard Waeber, MD, yang LOLIPOP PI, Jaspal Kooner, MD dan John Chambers, MD, serta peserta dalam semua studi. AKU M ingin mengucapkan terima kasih Vincent Mooser atas dukungannya untuk pekerjaan ini dan diskusi ilmiah yang berharga. Sumber Pendanaan The genotip dan analisis di University of Cambridge itu

didukung sebagian oleh dana dari GlaxoSmithKline di bawah perjanjian kerjasama. Penelitian GEMS disponsori di sebagian oleh GlaxoSmithKline. Studi CoLaus didukung oleh hibah dari GlaxoSmithKline, Swiss Sains Nasional Yayasan (Grant 33CSCO-122661), dan Fakultas Biologi dan Kedokteran Lausanne. Framingham Heart Study (FHS) Penelitian ini dilakukan di bagian menggunakan data dan sumber daya dari National Heart, Lung, dan BloodInstitute (NHLBI) dan Boston University School of Medicine. Analisis mencerminkan intelektual masukan dan pengembangan sumber daya dari para peneliti FHS berpartisipasi dalam SNP Kesehatan Association Sumber Daya (SAHAM) proyek. Karya ini sebagian didukung oleh NHLBI (kontrak tak ada. N01-HC-25195) dan kontraknya dengan Affymetrix untuk Layanan genotip (kontrak no. N02-HL-6-4278). Bagian A Penelitian ini memanfaatkan Linux Cluster untuk Analisis Genetik (Lingga-II) yang didanai oleh Robert Dawson Evans Endowment of Departemen Kedokteran di Boston University School of Obat-obatan dan Boston Medical Center.