Le Protocole De Recherche Animé

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES PRODUITS ALIMENTAIRES La prise d’essai: A - cas de produit solide(exemple: fromage). B -cas de produit liquide(exemple: lait pasteurisé).

Références • Norme NF EN ISO 6887-1 relative à la suspension mère et dilutions décimales;1.règle générale. • Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. • Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

A- Cas de produit solide. Peser dans un sachet stérile 3× 25 gr du produit à analyser aseptiquement. 25 gr

BALANCE

La 1ère pesée servira au contrôle bactériologique. La seconde servira à la recherche des Salmonella. La troisième servira à la recherche de Listéria.

La prise d’essai pour une analyse bactériologique classique: Verser le TSE dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR DE TYPE

STOMACHER

TSE 225 ml

(suspension mère) 10ˉ¹

La prise d’essai pour la recherche des Salmonella et des Listéria. Verser l’Eau Peptonée Tamponnée(Salmonella) et le bouillon Fraser(Listéria) dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

225 ml Eau Peptonée tamponnée

225 ml Bouillon Fraser

B – Cas de produit liquide: Faire un mélanger de 3 à 5 unités du produit à analyser. Lait pasteurisé Lait pasteurisé Lait pasteurisé

Lait pasteurisé Lait pasteurisé

+1 Suspension mère

La prise d’essai pour les recherches des Salmonella et des Listéria. Prélever

25 ml

25 ml

2×25 ml de la 5 ml

Suspension mère.

+1

Eau FRASER

Listéria

peptonnée tamponnée

Salmonella

PREPARATION DES DILUTIONS DECIMALES a - cas de produit solide. b - cas de produit liquide.

a - Cas de produit solide: Introduire 1 ml de la suspension 10ˉ¹ dans 9 ml de TSE. Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE.

1 ml

1 ml

10ˉ²

10ˉ¹ Suspension

mère

1 ml 9 ml de TSE

10ˉ³

b - Cas de produit liquide: Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE. Mélanger,puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹ et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE,mélanger, puis prélever 1 ml de la dilution 10ˉ² et l’introduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10³.

1 ml 1 ml

1 ml

9 ml de TSE

9 ml de TSE 10ˉ¹

1 ml 10ˉ³

10ˉ²

+1 suspension Solution mère mère

AZIZI-IPA-2004

PARAMETRES RECHERCHES • • • • • • • •

Recherche et dénombrement des microorganismes totaux (Flore mésophile). Recherche et dénombrement des levures et moisissures. Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et EscherichiaColi. Recherche et dénombrement des Anaérobies Sulfito – Réducteurs à 46°C. Recherche et dénombrement de Clostridium Perfringens à 37°C. Recherche et dénombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles. Recherche de Listéria.

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. Milieu utilisé: Gélose PCA

Références •

• • •

•

Norme NF 08 – 051 relative au dénombrement des micro– organismes – méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C. Norme XP V 08 – 102 relative aux règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats. Norme NF V 08 – 002:Microbiologie alimentaire – Directives générales pour les examens microbiologiques. Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Inoculer les boites de pétri avec 1 ml des différentes dilutions. 1

1 ml

ml

10ˉ¹

1

1 ml

ml

10ˉ²

1

1 ml

ml

10ˉ³

Couler la gélose PCA ≈ 15 ml refroidie ≈ 45°C. Mélanger et laisser solidifier. PCA

PCA

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Couler une deuxième couche de gélose blanche ≈ 5 ml. Laisser solidifier. GELOSE

GELOSE

BLANCHE

BLANCHE

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Incuber les boites couvercle en bas 72 ±3h à 30°C.

Incuber 72h à 30°C

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. 1ère Lecture après 24h d’incubation

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS.

2ème Lecture après 48h d’incubation

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 °C, DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS.

3ème Lecture après 72h d’incubation

Dénombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

Lecture et interprétation: Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300. Appliquer cette formule:

N

∑c 1,1 x d

∑c :

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 de colonies de la 2ème dilution ). d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N

= nombre de

micro-organismes /gr ou ml

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. A- En milieu liquide. (VBL + Cloche) a- Test de présomption.

Références • Norme NF ISO 4831 relative au dénombrement des coliformes – technique du nombre le plus probable après incubation à 30°C. • Norme NF V 08 - 050 relative au dénombrement des coliformes – méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C. • Norme NF V 08 – 017 relative au dénombrement des coliformes fécaux et d’Escherichia coli (annexe à NF V 08 – 015 et NF V 08 -016). • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Introduire 1ml des différentes dilutions dans chaque tube. Chasser le gaz présent dans les cloches avant l’incubation.

1 ml

1 ml

1 ml

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹

10ˉ² 10ˉ² 10ˉ²

10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

Incuber 24 - 48h à 37°C

VBL

VBL

Lecture des coliformes totaux à 37°C: Aspect d’ un tube de milieu VBL + cloche positif.

Acidification du milieu

Gaz +

Noter le nombre de tubes positifs à 37°C et se référer à la table de NPP.

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹

10ˉ² 10ˉ² 10ˉ²

10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

VBL

VBL

VBL

VBL

++ 2

VBL

VBL

+

VBL

+ 2

VBL

VBL

++ + 3

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES THERMO TOLERANTS ET ESCHERICHIA COLI DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. b- Test de confirmation:

Repiquer chaque tube de milieu VBL + sur un autre tube de VBL et un tube d’Eau Peptonée Exempt d’Indole. 2 gouttes

Eau Peptonée Exempt D’Indole

2 gouttes

VBL VBL

Chasser le gaz présent dans la cloche avant l’incubation. Incuber 24h à 44°C.

VBL

Eau Peptonée Exempt D’Indole

-voir acidification du milieu VBL et le dégagement de gaz dans la cloche. -Ajouter le milieu Kovacs au tube d’Eau Peptonée Exempt d’Indole et voir la formation d’un anneau rouge.

Anneau rouge

2 gouttes de Kovacs

Gaz +

Eau Peptonée Exempt D’Indole

VBL

Acidification du milieu

Noter le nombre de tubes positifs pour chaque série de dilutions et se référer à la table de NPP. 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹

10ˉ²10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ² 10ˉ²

10ˉ³ 10ˉ³10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

EAU

EAU

PEPTO-

EAU

EAU

EAU

EAU

EAU

EAU

PEPTO-

PEPTO-

PEPTO-

PEPTO-

PEPTO-

PEPTO-

PEPTO-

NEE

VBL

NEE

VBL

+

VBL

+ 2

NEE

NEE

VBL

NEE

VBL

+

NEE

NEE

VBL

VBL

+ 1

NEE

VBL

+ 2

EAU PEPTO-

NEE

VBL

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORMES THERMOTOLERANTS DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. B – En milieu solide : Désoxycholate 1 ‰.

Inoculer les 2 séries de boites avec 1 ml des différentes dilutions. 1 ml

1ml

1 ml

1ml

1 ml

1ml

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

DESOXYCholate 1‰

Couler une couche de gélose de désoxycholatee 1‰ ≈ 15 ml, refroidie à la température ≈ 45±1 °C. Mélanger et laisser solidifier.

DESOXYCholate 1‰

Incuber une série de boites 24-48 h à 37°C pour la recherche des coliformes totaux. Incuber l’autre série à 44 °C pour la recherche des coliformes thermo tolérants et Escherichia coli.

24-48h à 37°C

24-48h à 37°C

24-48h à 37°C

24-48h à 44°C

24-48h à 44°C

24-48h à 44°C

Test de confirmation en milieu solide: 1 – Dénombrement des coliformes totaux à 37°C. 2 - Dénombrement des coliformes Thermo tolérants et Escherichia coli à 44 °C.

Dénombrer les colonies fluorescentes qui poussent en masse , noter les dilutions et les températures correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300. Colonies fluorescentes

Colonies fluorescentes

Lecture et interprétation: Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) oū le nombre de colonies dénombrées soit : 15 ≤ c ≤ 300. Appliquer cette formule:

N

∑c 1,1 x d

∑c :

c + c (c = nombre de 1 ère 2 1 colonies de la 1 dilution et c = nombre 2 de colonies de la 2ème dilution ). d : le taux de dilution de la 1ère boite retenue.

N

= nombre de

coliformes /gr ou ml

RECHERCHE DES STREPTOCOQUES FECAUX DANS LES LAITS CRUS ET EN POUDRE A - Test de présomption: en milieu Rothe

Ensemencer la série de tubes du milieu Rothe simple concentration. Incuber les tubes 18- 24h à 37°C. 1 ml

ROTHE S/C

ROTHE S/C

1 ml

ROTHE S/C

Dilution 10ˉ¹

ROTHE S/C

ROTHE S/C

1 ml

ROTHE S/C

Dilution 10ˉ²

ROTHE S/C

ROTHE S/C

ROTHE S/C

Dilution 10ˉ³

RECHERCHE DES STREPTOCOQUES FECAUX DANS LES LAITS CRUS ET EN POUDRE B - Test de confirmation: en milieu Eva Litsky

Repiquer 1 à 2 gouttes du milieu Rothe sur le milieu Eva Litsky. 1 à 2 gouttes

+

Trouble microbien

Rothe s/c

EVA Litsky

Incuber à 37°c pendant 24h

LECTURE DU MILEU EVA LITSKY

Voir trouble microbien et un dépôt au fond du tube

Pastille violette ou blanchâtre

Noter le nombre de tubes positifs pour chaque série de dilutions et se référer à la table de NPP.

10ˉ¹ 10ˉ¹ 10ˉ¹

EVA

LITSKY

+

10ˉ² 10ˉ² 10ˉ²

10ˉ³ 10ˉ³ 10ˉ³

EVA

EVA

EVA

EVA

EVA

EVA

EVA

EVA

LITSKY

LITSKY

LITSKY

LITSKY

LITSKY

LITSKY

LITSKY

LITSKY

+ +

+

3

1

+

+

2

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS

Références • Norme NF V 08 6- 052 relative à la méthode de routine pour la recherche des Salmonella. • Norme EN 12824 relative à la recherche des Salmonella. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

A - Cas de produit solide: Verser l’Eau Peptonée Tamponnée dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit. Broyer l’aliment. Verser le contenu dans le flacon d’E.P.Tamponnée.

Eau

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

peptonnée tamponnée

flacon de 225 ml

B - Cas de produit liquide. 25 ml 1

Introduire dans 225 ml d’Eau Peptonée Tamponnée

ml

Prélever 25 ml de la Suspension mère

(+1)

Eau peptonnée tamponnée

+1

Étape de pré enrichissement: Incuber la solution ensemencée d’Eau Peptonée Tamponnée 16-20h à 37°C.

Eau peptonnée tamponnée

INCUBER 16- 20h à 37°C

Étape d’enrichissement: Ensemencer les bouillons de Rappaport Vassiliadis et de sélénite à partir de la solution pré enrichie. 0,1 ml

2 ml

Bouillon

Bouillon

Rappaport

sélénite

Vassiliadis

SFB S/C

RAPPAPORT

Eau

Incuber 18- 24h à 42°C

peptonnée tamponnée

Incuber 18- 24h à 37°C

Solution pré enrichie

Étape d’isolement: Milieux utilisés: Gélose Hektoen Gélose au Vert Brillant et au Rouge de Phénol.

Isoler par des stries : a- Ensemencer une boite de gélose Hektoen à partir du tube SFB. b- Ensemencer une boite de gélose au Vert Brillant et au rouge de phénol à partir du tube de Rappaport Vassiliadis. Anse de platine SFB S/C

37°C

RAPPAPORT

Incuber 24h à 37°C

42°C

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI. Colonies ayant un contour régulier. Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou sans centre noir sur la gélose Hektoen. Colonies de couleur rose sur la gélose V.BR.RP

.

.

.

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI. Stries Anse de platine

faire une piqûre centrale.

Isoler par des stries

Incuber 24h à 37°C

Aspect d’un TSI de Salmonella.

TSI

+ Gaz + H2S

TSI

H2S + Gaz

H2S TSI

Gaz

+

Pente Rouge

Pente Rouge

Pente Rouge

Culot Noir

Culot Jaune

Culot Jaune

Autres Salmonella

S.Typhi

S.Paratyphi A

Ensemencer une mini - galerie biochimique. CITRATE DE SIMMONS

ONPG

.

UREE

TEMOIN LDC

GN

Lecture de la mini - galerie biochimique. ONPG Pas de virage.

ONPG

UREE

TEMOIN

LDC

GN

.

UREE Pas de virage.

TEMOIN

LDC

+

CITRATE

CITRATE DE SIMMONS

+

GN

Lecture de l’indole et de la TDA. UREE 2 gouttes de réactif KOVACS

Pas de formation d’anneau rouge.

INDOLE -

1 goutte de réactif TDA

Pas de virage.

TDA -

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. Milieu utilisé: Gélose Baird Parker

Références •

• • •

•

Norme NF ISO 6888 - 1 relative au dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive(S.aureus et autres espèces) – Partie 1: technique utilisant le milieu gélosé de Baird Parker. Norme NF V 08 – 057 – 1 relative au dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies à 37°C – 1: technique avec confirmation des colonies. Norme NF V 08 – 057 –2 relative au dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies à 37°C –2: technique sans confirmation des colonies. Norme NF ISO 6888 -2 relative au dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive(S.aureus et autres espèces) – Partie 1: technique utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Préparation du milieu Baird Parker: Ajouter au milieu de base Baird Parker 15 ml de la solution jaune d’œuf au tellurite de potassium.

15 ml

JAUNE D’OEUF

au

TELLERUTE

de

POTASSIUM

MILIEU de Gélose BAIRD PARKER

Couler la gélose dans des boites de pétri et conserver à +4°C.

Inoculer les boites avec 0,1 ml des différentes dilutions. 1

1

ml

0,1 ml

10ˉ¹

1

ml

0,1 ml

10ˉ²

ml

0,1 ml

10ˉ³

Étaler les gouttes à l’aide d’une pipette râteau.

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Incuber les boites de Baird Parker couvercle en haut 48h ±2 à 37°C.

Incuber 48h ±2 à 37°C 1ére lecture 24h ±2

Dénombrer les colonies caractéristiques et non caractéristiques et noter les dilutions correspondantes.

Colonies caractéristiques

Colonies non caractéristiques

15 ≤ X ≥ 150 pour 2 dilutions successives.

Recherche de la catalase puis de la coagulase. COAGULASE

CATALASE

Réaction de la catalase: Pipette Pasteur. Déposer 1 goutte d’H2O2 20V. Déposer une partie de la colonie.

.

Apparition de bulles d’air. Observation à l’oeil nu ou au microscope.

Réaction de la coagulase: a- ensemencer un bouillon cœur cervelle.

BOUILLON COEUR CERVELLE

Incuber 20-24h à 37°C

b- recherche de la coagulase libre: 0,1 ml

Plasma de lapin

BOUILLON COEUR CERVELLE

0,3 ml

Incuber 24h à 37°C 1ére lecture après 6h d’incubation.

Le coagulum occupe + des ¾ du volume du liquide initial.

Plasma de lapin coagulé

Réaction

+

Lecture et interprétation: c c nc nc a =b x c + b x c FORMULE :a + nc c AAAAAAAAAAA • Ac • • • • • •

= nombre de colonies caractéristiques repiquées. Anc = nombre de colonies non caractéristiques repiquées. bc = nombre de colonies caractéristiques repiquées à coagulase +. b nc = nombre de colonies non caractéristiques repiquées à coagulase +. cc = nombre total de colonies caractéristiques par boite. c nc =nombre total de colonies non caractéristiques par boite.

Lecture et interprétation. 15≤ a ≤150 Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: N= ∑a N= 1,1 x d ∑ a = a1 + a 2 (a 1 = nombre de staphylocoques à coagulase + de la 1ère dilution retenue et a 2 = nombre de staphylocoques à coagulase + de la 2ème dilution retenue.

Lecture et interprétation. Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: N = ∑

N= F . V . 1,1

F = le taux de la 1ère dilution retenue. V = le volume inoculé.

N = nombre de staphylocoques / gr ou ml.

Exemple:

c

c

nc

nc

A=b x c + b x c a= c nc AAAAAAAAAA c c A = 3; b = 2; c =56 a=

2 x 56

3 c c A = 3; b = 3; c = 3

10ˉ² =

112 3

= 37 10ˉ³

3x3 a= = 3 3 N=

∑a 1,1xVxF

37 + 3 = 1,1x0,1x0,01

= 363x100 = 3,6.10

4

Staph./gr ou ml

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES ANAEROBIES SULFITOREDUCTEURS A 46°C DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. Milieu utilisé: Tryptone Sulfite Cyclosérine

Références • Norme XP V 08 – 061 relative au dénombrement en anaérobiose des bactéries Sulfito – Réductrices par comptage des colonies à 46 °C. Méthode de routine. • Norme V 08- 056 relative au dénombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . • Norme NF V 08 – 019 relative au dénombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Régénérer le milieu de TSC 15’ à +100°C.

100°C

Prélever 1 ml de la dilution 10ˉ¹, l’introduire dans le tube de TSC régénéré additionné d’antibiotiques et refroidi à la T° ≈ 47 ±2°C.

1 ml

0,2 ml

D-

Cyclosérine

TSC

TSE 225 ml

Gélose TSC régénérée

4%

Mélanger doucement par retournement. Laisser solidifier. Incuber le tube 20h à 46° ±2°C.

TSC

Incuber 20h à 46 ±2°C

Dénombrer les colonies caractéristiques de couleurs noires et de 5 mm de diamètre.

ASR

colonie

Lecture et interprétation. 15≤C≤30 C=nombre de 2 tubes retenus. colonies. 1) Formule: N = ∑ C

N=

1

ère

1,1 x d

dilution retenue.

/gr ou ml

15≤C≤30 2) Solution mère ensemencée. D=taux de dilution de la suspension mère.

N=

c D

/gr ou ml

Lecture et interprétation. 3) 1≤C≤15

Formule: Ne = 4) C = 0 Formule: N = moins de

c

/gr ou ml

D

1 D

/gr ou ml

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS PAR COMPTAGE DES COLONIES A 37 °C DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS

Milieu utilisée: Tryptone Sulfite Cyclosérine

Références • Norme XP V 08 – 061 relative au dénombrement en anaérobiose des bactéries Sulfito – Réductrices par comptage des colonies à 46 °C. Méthode de routine. • Norme V 08- 056 relative au dénombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . • Norme NF V 08 – 019 relative au dénombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Inoculer les boites de pétri avec 1 ml des différentes dilutions. 1 ml

1 ml

10ˉ¹

1 ml

1 ml

10ˉ²

1 ml

1 ml

10ˉ³

1 ml

1

ml

10ˉ4

Couler la gélose TSC ≈ 15 ml. Mélanger et laisser solidifier.

TSC

10ˉ¹

10ˉ²

TSC

10ˉ³

10ˉ 4

Couler une deuxième couche de gélose TSC ≈ 10 ml, refroidie ≈ 47 ±2°C. Laisser solidifier.

TSC

10ˉ¹

10ˉ²

TSC

10ˉ³

10ˉ 4

Incuber 20 ±2h à 37°C dans une atmosphère riche en CO 2 .

Jarre

Dénombrer les colonies noires caractéristiques qui poussent en profondeur.

Ensemencer de 1 à 3 colonies suspectes sur le bouillon Thioglycolate.

Couche de paraffine BOUILLON

THIO

glycolate

-

Incuber 20 ± 2h en anaérobiose à 37°C

Repiquer 5 gouttes sur le bouillon Lactose Sulfite + cloche à partir du bouillon Thioglycolate. 2 gouttes

LACTOSE SULFITE

BOUILLON

THIO

glycolate

-

Incuber 24 ± 2h en anaérobiose

Voir un dégagement de gaz dans la cloche et un précipité noir au fond du tube. Dépôt noir

Gaz LACTOSE SULFITE

Lecture et interprétation. Formule: a = b :

b

x

c

A Nombre de colonies caractéristiques +

c : Nombre total de colonies caractéristiques sur la boite. A : Nombre de colonies caractéristiques repiqués. a : Nombre de Clostridium Perfringens identifiés.

Lecture et interprétation. N

=

∑a

/gr ou ml

1,1 d

∑a d :

=

La somme des colonies

+.

Le taux de dilution de la 1ère dilution retenue.

NB: retenir 2 boites de dilutions successives contenant entre 15 et 150 colonies caractéristiques.

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS. Milieu utilisé: Sabouraud au Chloramphénicol

Références • Norme XP V 08 – 059 relative au dénombrement des levures et moisissures par comptage des colonies à 25 °C. • Norme NF ISO 7954 relative au dénombrement des levures et moisissures par comptage des colonies à 25 °C. • Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.

Ensemencer les boites comme l’indique le schéma. 1 1

0,2 ml ml

0,2 ml

ml

1

0,2 ml

1

ml

0,2 ml

TEMOIN

TEMOIN

DILUANT

MILIEU

10ˉ¹

10ˉ²

ml

10ˉ³

Ne pas ensemencer la boite témoin

Étaler les gouttes à l’aide d’une pipette râteau.

Témoin diluant

10ˉ¹

10ˉ²

10ˉ³

Incuber les boites de Sabouraud au Chloramphénicol couvercle en haut 5 jours à 25°C.

Incuber 5 jours à 25°C Lecture tous les jours.

Dénombrer les levures et moisissures et noter la dilution correspondante.

LEVURES

MOISISSURES

Lecture et interprétation. Formule :

n

=

C x 5

1 d n 1 = Nombre de levures ou moisissures par dilution. Calculer de la même manière n

et n 2 3 pour les dilutions correspondantes.

N =

n1 + n2 + n3

3

/ gr ou ml

C: nombre de colonies par boite. N:nombre de levures et de moisissures /gr ou ml.

RECHERCHE DES LISTERIA DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS.

La prise d’essai pour la recherche de Listéria. a - cas de produit solide: Verser le bouillon Fraser dans le sachet stérile contenant 25 gr de produit à analyser. Broyer l’aliment 6 à 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

225 ml Fraser Bouillon ½

b – cas de produit liquide: 25 ml

Prélever 5

25 ml de la

ml

Solution mère.

+1 FRASER

½

Listéria

PREPARATION DU BOUILLON FRASER ½. a – Reconstituer le supplement Fraser ½: 11.25 ml

11.25 ml

SUPPLEMENT

ETHANOL

FRASER

½

EAU DISTILLEE STERILE

Acriflavine+Acide nalidixique+citrate de fer ammoniacal

b- additionner le supplément.

0,1ml 2.25 ml

SUPPLEMENT

FRASER

½

BOUILLON FRASER

½

BOUILLON

FRASER

PREPARATION DE LA GELOSE PALCAM. 5 ml

EAU DISTILLEE

STERILE

2,25 ml

Supplément

PALCAM

Gélose PALCAM

Sulfate de polymyxine B + Ceftazine + Acriflavine

1ère étape: Enrichissement primaire. Incuber le bouillon ensemencé FRASER ½ 18-24h à 30°C.

BOUILLON

FRASER

½

INCUBER 18-24h à 30°C

2ème étape:

BOUILLON

Enrichissement secondaire sur milieu Fraser ½ en tube. 1er Isolement sur gélose Palcam. 0,1ml

BOUILLON

FRASER

FRASER

½

Enrichissement I Incuber 24h à 37°C

FRASER

Incuber 24-48h à 37°C

PALCAM 1

3ème étape: 2ème isolement sur la gélose Palcam. Lecture de la boite Palcam 1.

BOUILLON

FRASER ½

Incuber 24-48h à 37°C

PALCAM 1

PALCAM 2

Colonies caractéristiques de Listéria sur la gélose Palcam.

Identification du genre Listéria: Coloration de gram. Catalase.

Bacilles gram +

Catalase +

Identification de l’espèce: ensemencer une galerie biochimique. • • • • • • • • • • •

Mobilité. Oxydase. Nitrate réductase. Urée. Indole. TDA. VP. RM. ESCULINE. VF : voir type respiratoire (aéro-anaérobie facultatif). TSI : (voir glucose + H2S).

ENSEMENCER UNE GALERIE BIOCHIMIQUE. Esculine VF

Mannitol Mobilité

Bouillon Nitrate

Clark et Lubs

Urée

TSI

Incuber 24h à 37°C.

Lecture de la galerie biochimique. Mobilité + Nitrate –

Esculine

Glucose + H2S – GazEsculine + Urée – IndoleTDA – VP + RM +

Mannitol Mobilité

Bouillon Nitrate

Clark et Lubs

Urée

TSI

Clark et Lubs