Tp Cpg15

1. Introduction : La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une classe de chromatographie dans laquelle la phase mobile est un gaz- L'échantillon qui est souvent un liquide à la température'ordinaire est vaporisé aussitôt injecté dans la colonne. Chronologiquement la (CPG) est apparue après la chromatographie en phase liquide. Dans les premières méthodes proposées, la phase stationnaire était un adsorbant solide. Par la suite les phases stationnaires liquides développées par MARTIN et SYNGE ont pris une extension considérable. La discussion qui suit concerne uniquement la chromatographie de partage gaz liquide. 2. Description de l’appareil : C’est une méthode de séparation de composés susceptibles d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition). La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption. Elle permet :  la microanalyse (du µg au mg)  la séparation de mélanges complexes  une analyse qualitative et quantitative aisée  des analyses dans de nombreux domaines d’applications. Ses limites d’applications : elle ne convient pas pour les produits  qui se décomposent à chaud (thermolabiles)  qui sont peu volatils  ionisés.  Schéma d’appareillage Un appareil de CPG comprend schématiquement 3 modules spécifiques : un injecteur(1), une colonne contenue dans une enceinte thermostatée (four)(2) et un détecteur (3) relié à un intégrateur ou un ordinateur (4) sur lequel apparaît le chromatogramme . Le mélange à analyser est injecté sous forme d’un fluide et est vaporisé dans l’injecteur. Le gaz vecteur l’entraîne dans la colonne de séparation thermostatée. Les composés se répartissent différemment dans les 2 phases, se déplacent donc à des vitesses différentes puis sortent à des temps

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1 1

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Gaz vecteur

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différents. A leur sortie, ils sont détectés et un pic apparaît sur l’enregistreur. 1. Injecteur Il permet : l’introduction de l’échantillon, son évaporation et son entraînement par le gaz vecteur vers la colonne : un volume précis est injecté dans l’injecteur qui va vaporiser le liquide et permettre le transfert de l’échantillon vaporisé vers la colonne de chromatographie. Cette injection est faite dans un tube chauffé. Le gaz vecteur arrive par l’une des extrémités du tube et entraîne les solutés vaporisés vers la colonne raccordée à l’autre extrémité. a) L’injection : se fait par le biais d’une seringue de faible volume (microseringue de 1 à 10 µL). Elles posent deux problèmes :  Mauvaise reproductibilité des volumes injectés certains appareils sont donc pourvus d’injecteur automatique.  Chauffage brutal du contenu de l’aiguille de la seringue lorsqu’on l’introduit dans l’injecteur, qui entraîne une injection en 2 temps visible sur le chromatogramme. la solution consiste à mesurer le volume désiré puis reculer le piston de façon à aspirer le contenu de l’aiguille, ainsi lorsque l’aiguille sera introduite dans l’injecteur, elle sera vide !, puis il faut injecter rapidement. L’aiguille de la microseringue entre dans l’injecteur en traversant un septum (une pastille d’élastomère siliconé) qui évite les fuites de gaz au niveau de l’entrée. L’état du septum doit régulièrement être contrôlé. b) Température de l’injecteur : L’injecteur est thermostaté à une certaine température de manière à ce que le solvant et les différents solutés de l’échantillon soient vaporisés. Pour éviter la condensation des produits injectés  T°injecteur = T°produit le moins volatil + 20°C c) Différents types d’injecteurs : Selon les types de colonnes reliées aux injecteurs, les caractéristiques des injecteurs et leur mode d’injection sont différentes de façon à optimiser la qualité de la séparation :  Injecteur à vaporisation directe : pour les colonnes remplies et les colonnes capillaires de gros diamètre. Tout l’échantillon introduit par la seringue est entièrement entraîné dans la colonne Pb. : Pour les colonnes capillaires à faible débit, les quantités de composés dans la colonne doivent être très petites pour éviter la saturation des colonnes.

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Les volumes injectés doivent être très faibles (saturation même pour des v injectés = 0,1µL). Or les volumes injectés ne peuvent être inférieurs à 0,1 µL et l’utilisation de solutions très diluées entraîne des perturbations dues à l’excès de vapeur de solvant. Il existe donc différents injecteurs permettant de résoudre ce problème :  Injecteur avec système de fuite : Une grande partie de l’échantillon injecté , vaporisé et mélangé au gaz vecteur est éliminée de l’injecteur par une vanne de fuite. Ainsi, une petite fraction du mélange pénètre dans la colonne. Il existe deux modes selon que l’on injecte vanne de fuite ouverte (mode split) ou vanne fermée pendant environ 1 minute après l’injection(mode splitless)  Injecteur à température programmable (PTV) : Le mélange est introduit liquide dans l’injecteur à froid puis l’injecteur est chauffé en mode split ou splitless pour vaporiser les composés 

Injection à froid dans la colonne : le mélange est injecté directement froid et liquide dans la colonne

2. Four Les colonnes sont placées dans des enceintes chauffées appelées four dont la température peut-être régulée au 1/10ème de °C près. La température du four peut-être : − stable et identique du début à la fin de la manipulation (= conditions isothermes) − programmée par palier successif (= en gradients) 3. Colonnes Elles contiennent la phase stationnaire. Elles se présentent sous forme de tubes fins enroulés. Il existe deux types de colonnes : 1. Les colonnes remplies Diamètre de 2 à 6 mm et longueur de 1 à 3 m. Elles sont en tubes d’acier ou verre. Elles sont remplies d’un support poreux et inerte sous forme de grains sphériques ( d’environ 0,2 mm de diamètre) sur lequel est imprégnée la phase

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stationnaire. Moins résolutives que les colonnes capillaires. Exemple de supports : Chromosorb® ; Sphérosil® ; Porapak® 2. Les colonnes capillaires (à tube ouvert) Diamètre de 0,1 à 0,53 mm et longueur de 10 à 100 m. Elles sont en tubes d’acier inoxydable ou en silice fondue ; La phase stationnaire est directement déposée sur la paroi interne de la colonne sur une épaisseur de 0,05 à 5 µm. revêtement extérieur silice fondue phase stationnaire On distingue les colonnes − WCOT (Wall Coated Open Tubular) : où la phase stationnaire forme une pellicule liquide à l’intérieur du tube. − PLOT (Porous Layer Open Tubular) : où la phase stationnaire forme une couche d’adsorbant solide. •

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3. Recommandations d’utilisation des colonnes Avant sa première utilisation : il faut la débarrasser des traces de solvant et des produits volatils qu’elle peut contenir en la maintenant au moins 12 h au voisinage de sa température limite d’utilisation sans brancher le détecteur pour éviter son encrassement maturation Après une longue période d’utilisation : remettre la colonne à maturation pendant 2h. Stockage : avec des bouchons (évite l’oxydation, l’humidification,…) Une colonne doit toujours être parcourue par le gaz vecteur 4. Phases

.1. Phase mobile Elle constitue le gaz vecteur. Il s’agit d’un gaz inerte et pur tel que l’hélium, le diazote ou le dihydrogène. La nature du gaz ne modifie pas de manière significative la séparation des composants du fait de l’absence d’interaction entre le gaz et les solutés, seul le facteur température est important.

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.2. Phase stationnaire a) Choix de la phase stationnaire • Une phase apolaire retiendra d’autant plus un composé qu’il sera apolaire (et inversement) Exemple : Squalane (apolaire) ; Carbowax (polaire) • Une phase apolaire retiendra les composés dans l’ordre de leur température d’ébullition (donc sortie des composés dans l’ordre de leur température d’ébullition croissante) • Une phase phénylée retiendra mieux un composé aromatique Ex. : phases OV225 ; DC550 • Une phase fluorée retiendra mieux les cétones Ex. : phase QF1 On définit le taux d’imprégnation : la masse de phase stationnaire pour 100g de support b) Différentes phases stationnaires Les phases les plus courantes sont formées de deux principaux types de constituants : • Les polysiloxanes (« huiles et gommes de silicones ») : correspondant à la répétition d’un motif de base de type : O CH3 O Si O Si O CH3 n • Les polyéthylèneglycols (PEG) : polymères polaires (composés des colonnes Carbowax®) de type : O

CH2

CH2 n

• les phases stationnaires solides constituées de matériaux adsorbants divers tels que de la silice ou de l’alumine désactivée par des sels minéraux, verres ou polymères poreux, carbone graphité (Chromosorb®100, Porapak®) 5. Détecteurs 1. Généralités Ils peuvent être plus ou moins spécifiques des composés à détecter.

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S'il n’y a pas de spécifications sur la notice de l’appareil  T°détecteur = T°produit le moins volatil + 20°C On détermine : • Sa quantité minimale détectable (QMD) • Sa sensibilité : correspond au rapport entre signal / concentration (mg/mL) ou entre signal / débit (mg/s) Il existe différents types de détecteurs comme le montre le tableau ci-dessous : DETECTEU R

Gaz vecteur

Linéarit é

Catharomètre FID

H2/He He/N2

105 107

Capture d’e-

N2

104

Thermoioniq ue Photométrie de flamme

N2

104

N2/H2

103

QMD

Sélectivit é (spécificit é) 1 à 10 ng NS 20 à 100 NS pg 0,1 pg S

Applications

P :1 pg / N :10 pg P : 10 pg S : 1 ng

Tous composés Composés organiques Composés halogénés Composés avec N ou P Composés avec S ou P

S S

2. Principes des principaux détecteurs a) détecteur à ionisation de flamme (FID) Le plus utilisé pour les composés organiques et de grande sensibilité. Les composés (gazeux) qui sortent de la colonne pénètrent dans la flamme du détecteur. Leur combustion entraîne la formation d'ions et de particules chargées qui sont alors collectés par 2 électrodes. Le courant très faible qui en résulte est fortement amplifié et transformé en une tension mesurable par un électromètre. L'air du pic reflète la quantité de composé élué. b) détecteur à conductibilité thermique (TCD) Détecteur universel mais de sensibilité moyenne; Il est formé d'un catharomètre composé de 2 thermistors (= filaments chauffés) dont un est balayé par le gaz vecteur seul et l'autre par le gaz en sortie de colonne; Quand un courant gazeux passe sur les filaments, ils sont refroidis en fonction de la température, du débit et de la nature du gaz; la température et le débit sont les mêmes pour le gaz arrivant sur les 2 filaments mais la présence d'1 composé en sortie de colonne modifie la nature du gaz qui alors refroidi moins le 2ème filament. Il en résulte une variation de résistance proportionnelle à la concentration du composé.

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c) détecteur thermoionique (NPD) (détecteur catharomètre)

Spécifique aux composés azotés ou phosphorés. Un petit cylindre en céramique est chauffée par une résistance électrique à 800°C et est alimenté par un mélange air/hydrogène. Les composés contenant N et P sont décomposés en ions négatifs qui sont recueillis par une électrode collectrice reliée à un électromètre qui traduit le courant obtenu en un signal. d) détecteur à capture d'électrons (ECD) Spécifique des dérivés halogénés et très sensible. Une source radioactive émet des particules β génère des électrons au contact d'un courant d'azote. Ces électrons produisent un courant constant qui diminue lors du passage de composés contenant un halogène (F, Cl, Br) car ces composés captent une partie des électrons; la diminution du courant se traduit par un pic. e) autres • détecteur à photométrie de flamme: sélectif pour S et P • détecteur à photo-ionisation: envoi de photons (lampe UV) sur les composés entraîne leur ionisation. • Détecteur à émission atomique • Couplage de plusieurs détecteurs en série.

Chromatographe 6. Identification et mesure quantitative des pics :

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C'est le temps de rétention qui permet d'identifier n'importe quelle substance émergeant sur le chromatogramme, par rapport à des étalons de nature connue. Mais cette approche est plutôt incertaine dans la mesure où un grand nombre de substances peuvent avoir le même temps de rétention. En variant les condition expérimentales (changement de phase mobile et de phase stationnaire), on peut contribuer à identifier positivement une substance si son temps de rétention est toujours le même que celui de l'étalon. La meilleure méthode est de coupler un chromatographe avec un spectromètre de masse. Ce dernier peut, après fragmentation de la masse d'une molécule, de détecter et d'identifier chaque soluté de l'échantillon à analyser. La méthode de l'étalon interne consiste à ajouter à l'échantillon à analyser un étalon interne en quantité connue. Celui- ci subit les purifications et traitements chimiques imposés à la prise d'essai, il s'incorpore à toutes les phases de la chromatographie et émerge sous forme d'un pic isolé. La fraction éventuellement perdue renseigne sur la quantité globale des pertes solubles par tous les autres constituants du mélange. On applique ainsi une correction standardisée. La mesure quantitative des pics se fait soit : * En découpant et en pesant les pics. * En mesurant la hauteur du pic, ou en mesurant la surface en multipliant la hauteur par la largeur du pic à mi- hauteur. * Par un intégrateur mécanique ou électronique, faisant partie de F enregistreur. Cette méthode étant la plus précise. Modalités pratiques : L'idéal en (CPG) serait d'obtenir un tracé comportant autant de pics qu'il y a se composés à analyser. Tous ces pics doivent être nettement séparés et symétriques, se rapprochant le plus possible des courbes Gauss. Pour obtenir ces conditions, il est nécessaire, en plus des connaissances théoriques, d'acquérir une certaine expérience en chromatographie,  Chois de la température: La température influe sur la mobilité et sur la détection. Dans sa version simple, la technique de chromatographie est isotherme. Cependant, pour certains mélanges, il est parfois difficile de concilier les exigences de chacun des constituants. Si on choisit la température la plus favorable à la sortie de la substance la moins retenue par la colonne, il en résulte pour les autres temps de rétention élevés ; donc des pics tardifs, larges et qui peuvent traîner. Inversement si on choisit une température convenant aux substances sortant les dernières, il en résulte une sortie beaucoup plus rapide des premiers pics qui ne sont pas ou sont mal séparés. La programmation de température est, dans ce cas, une solution efficace aux problèmes de la séparation.  L’échantillon : L'introduction d'une quantité d'échantillon supérieure à la capacité de

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travail de la colonne est à proscrire, il en résulte une largeur des pics. La rapidité d'introduction et de vaporisation de l'échantillon doit se faire telle que la vaporisation soit immédiate. Lorsque les solutés à analyser sont directement volatilisables, le traitement de l'échantillon ne se pose pas. Mais si les solutés ne sont pas volatils ou se décomposent à la température de travail, il faut les transformer avant l'analyse en dérivés volatils stables.  Choix du gaz vecteur : Ce choix est conditionné par F efficacité de la séparation et la sensibilité du détecteur. Le gaz vecteur doit être choisi de manière à être le moins miscible avec la phase stationnaire ; des gaz tels que N2 ou CO^, ayant une faible diffusibilité sont préférables.  Chois de la phase stationnaire : La phase stationnaire est, selon les cas, un hydrocarbure, un silicone, un ester ou un polyol, phase stationnaire polaire retient d'autant plus une substance que celle ci elle même plus polaire- II en est de même pour une phase apolaire vis à vis des substances peu polaires. Pour des substances de constitution et polarité voisines et pour une phase stationnaire donnée, les pics sortent de la même colonne par ordre de point de fusion croissant Pour augmenter ou diminuer la polarité de la colonne, on peut, non seulement, changer de phase stationnaire, mais encore agir sur le taux d'imprégnation du support. 3. Principe de base : La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode de séparation très utilisée. Elle est composée de plusieurs partie (appareillage) et dont la plus importante est la colonne, lieu de séparation des différents composés. Le choix de la colonne est dicté par la nature des composés à éluer. Chaque composé injecté est caractérisé par son temps de rétention, sachant que ce dernier est le temps qui s'écoule entre l'injection et le maximum du pic considéré. La seule différence entre la CPG et les autres techniques chromatographiques réside dans l'utilisation d'un gaz comme phase mobile. Dans une cavité métallique se trouve un filament inconstant (à base de platine ou de tungstène). Il est sensible à la température et au même temps il est conducteur de courant. Ce filament est placé dans un flux gazeux de gaz vecteur, l'arrivée d'un soluté modifie la conductibilité thermique du milieu gazeux, ce qui va se traduire par un signal électrique, et donc un pic. 4. But du T.P : Le but de notre travail consiste à analyser l’Hexane par chromatographie en phase gazeuse, de déterminer leur temps de rétention. 5. Conditions opératoires : II est indispensable de déterminer les conditions opératoires qui influent sensiblement sur le temps de rétention de l’élément à analyser. Pour ce travail, on utilise un chromatogramme a gaz équipé d'un détecteur à

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ionisation de flamme (FID).  La température du détecteur est Tdet = 220°C, elle est généralement plus proche ou égale à celle de la chambre d'injection qui est Tinj = 200°C.  La colonne est de type Se30 : (OV101) comme phase stationnaire qui est apolaire est analyse des composés apolaires.  La température de la colonne est de 62°C  Longueur de la colonne : L = 27m  Le diamètre de la colonne est :D=0.25mm.  Le gaz vecteur utilisé est l'azote à un débit de : 10 ml/min.  Le papier du chromatogramme a une vitesse de déroulement de : 10 mm/min.  La colonne est remplie de SE30 6. Mode opératoire : a- On fixe les températures des compartiments et on règle l'appareil. b- on prend l’échantillon a analysé et avec une micro- seringue, on l'injecte dans la chambre d'injection. Il est a signaler que cette opération nécessite une extrême rapidité, de plus il faut utiliser la quantité adéquate. Cette étape est délicate, il faut donc prendre des précautions et laver la seringue après chaque utilisation pour éviter l'apparition de plusieurs pics. c- A chaque apparition de pic sur le papier du chromatogramme, il faut prendre les mesures de distances de rétention. Le chromatogramme Obtenue est le suivant :

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7. Expression des résultats : L’échantillon analysé est l’hexane, on a trouvé dans le chromatogramme 4 pic dont :  Le pic N° 1 a un temps de rétention TR=1.637s et il représente

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92.5765% du total de l’échantillon analysé.  Le pic N° 2 a un temps de rétention TR=1.729s et il représente 6.9555% du total de l’échantillon analysé.  Le pic N° 3 a un temps de rétention TR=1.827s et il représente 0.3519% du total de l’échantillon analysé.  Le pic N° 4 a un temps de rétention TR=2.593s et il représente 0.1161% du total de l’échantillon analysé. Le premier pic représente l’Héxane, et les autre son des impurté 8. Influence de la température : La température à laquelle se fait la séparation dépend beaucoup des conditions expérimentales, un bon choix initial est une température de chromatographie a quelques degrés au dessous du point d’ébullition du constituant principal Si toutes les substances du mélange ont sensiblement la même température d’ébullition, la séparation dépendra surtout de la nature de la phase stationnaire. Si on augmente la température, les pics chromatographiques se rapprochent entre eux et la distance qui les sépare diminue. En tenant compte des faits expérimentaux, on choisi en définitif la température entraînant la séparation désirée dans un laps de temps satisfaisant voir partie théorique). Il est recommandé d'utiliser initialement une température inférieure de quelques degrés au point d'ébullition ou du principal constituant puis la faire augmenter jusqu'à avoir un bon chromatogramme lisible et en tenir compte de la résistance de l'appareil vis à vis des températures élevées.  On remarque que l’évolution de la température en fonction du temps de rétention varie inversement, autrement dis plus la colonne est chauffé, plus le composé se volatilise rapidement et il est vite dégager.  D’une manière générale les composés les plus volatils sont rapidement entraînés vue leur importance de leur tension de vapeur, toute fois si la température est trop élevée, la séparation entre les phases ne peut s’établir et au delà, apparaissent presque tous en même temps.  D’autre part si la température est trop bas, la vitesse d’échange étant lente donc diffuse trop vite. Le temps de rétention de certaines substance devient trop long et les pics correspondant sont déformés ; pour cela il faut faire plusieurs essai avant de trouver la température qui donne la meilleure séparation des pics. Lorsque l’écart entre les points d’ébullition des constituant du m élange à analysé est très grand, il est préférable d’augmenter la température du four, afin d’obtenir une bonne séparation des pics. Dans le cas ou le débit est suffisant, l’augmentation de température est nécessaire pour améliorer la qualité de la séparation. Application : Détermination de la composition en acide gras dans le Blé :

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1/ Préparation de l’échantillon : Cette étape consiste a la transformation des acides gras en esters méthylique ; la méthode utilisée est celle décrit dans : (Tranchant 1982). Mode Opératoire :  Introduire deux gouttes (environ 40mg) de huile dans un tube en verre.  Ajouter 1ml d’hexane, agiter 2 second.  Introduire ensuite à l’aide d’une pipette 0.2 ml de soude 2N dans du méthanol.  Boucher le tube, agiter 2 second.  Porter 20second en bain marie à 50°C, agiter 10 second.  Ajouter 0.2ml d’acide chlorhydrique 2N dans du méthanol.  Agiter et laisser décanter.  La phase surnagent constitue les esters méthyliques dont le prélevement pour l’injection dans le chromatographe se fera dans cette phase. 2/ Analyse des esters méthylique d’acide gras par CPG (AFNOR NF T60 234) L’analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d’acide gras a été réalisé a l’aise d’un chromatogra mme GOW MAV serie 600 avec peak simple Data systeme avec détecteur a ionisation de flamme (FID) 3/ les conditions opératoire :  Colonne capilaire OV-17 (moyennement polaire) de 30m de longueur et 0.25mm de diamètre interne.  Température de colonne = 100°C pendant 8 minutes puis 100 à250°C avec 7°C / min (T° de programmation).  T° d’injection=250°C (avec mode d’injection split).  Température de détecteur=290°C  Gaz vecteur : l’azote N2  Quantité de la prise d’essai injecté est de 1.5µl. L’identification des acides gras et l’etude qualificatif est réalisé en utilisant un étalon interne qui est l’acide stéarique C18 :0.

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Conclusion : D’après ce TP, on a constaté que la chromatographie en phase gazeuse est une technologie de pointe car elle peut séparé et détecté des substance a l’échelle de quelque µl, on a pu déterminer le pourcentage de la substance a analysé qui est l’hexane dans la solution et on a met en évidence la présence d’impureté, donc c’est une méthode fiable, rapide et très délicate.

Référence bibliographique

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[1] Valorisation du germe de blé par extraction de huile à froid et sa caractérisation pour l’obtention d’un complément alimentaire (2003/2004).

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