Ctb-biorreactores2016.pdf

CONCEPTOS y TECNICAS de BIOTECNOLOGIA (FCEyN – UBA ) Biotecnología Industrial Producción industrial de Metabolitos Biorreactores Miryan Cassanello PINMATE – Dep. Industrias, FCEyN-UBA E-mail: [email protected]

Ingeniería Química Química

Biología Bioquímica

Biotecnología AZUL: Aplicación en organismos marinos

Biotecnología ROJA: Aplicación en medicina

Biotecnología AZUL

Biotecnología ROJA

BIOTECNOLOGIA Biotecnología VERDE Biotecnología VERDE: Aplicación en agroalimentos

Biotecnología BLANCA Biotecnología BLANCA (o industrial): Aplicación en la industria en general, productos químicos, nuevos materiales, biocombustibles, etc.

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

Biotecnología : actividad multidisciplinaria que comprende la aplicación de los principios científicos y de la ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos para proveer bienes y servicios. (Definición de la OECD) Agentes biológicos: células microbianas, animales, vegetales y enzimas. Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas, productos medicinales, etc. Servicios: especialmente los relacionados con la purificación de aguas y tratamiento de efluentes.

Bibliografía – libros de texto Kent and Riegel’s Handbook of Industrial Chemistry and Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A. Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007. Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, Fikret Kargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002. Principios de Ingeniería de los bioprocesos, Pauline M. Doran, Editorial Acribia S.A, Zaragoza, España. 1995. (Traducido 1998) •Bioreaction Engineering Principles, John Villadsen, Jens Nielsen, Gunnar Lidén. Springer, 3ra. Ed. (2011). ISBN-10: ISBN 978-14419-9687-9 e-ISBN 978-1-4419-9688-6 •Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F. Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986. •Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour, Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452

Objetivo de la producción industrial de células o de microorganismos

Producir las mismas células o microorganismos (biomasa) en gran escala Producir en gran escala compuestos (intracelulares o extracelulares) resultantes del crecimiento celular (metabolitos)

Metabolitos Primarios

Metabolitos Secundarios

Metabolitos primarios -Moléculas generalmente sencillas, que participan de los caminos metabólicos esenciales. Son casi idénticos en todos los organismos. -Son más baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de “actividad biológica” y frecuentemente son “commodities” 1. Componentes esenciales de las células/microorganismos: proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos (gelanos, xantanos) y poliésteres, ácidos grasos (insaturados), esteroles. 2. Derivados del metabolismo intermedio: azúcares (fructosa, ribosa, sorbosa), ácidos orgánicos (gluconato, ácido láctico, cítrico, acético, propiónico, succínico, fumárico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoácidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucleótidos saborizantes (ácidos inocínico y guanílico), polisacáridos y poliésteres de reserva. Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos

Metabolitos secundarios -Moléculas mas complejas, que participan de caminos metabólicos no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en situaciones de stress. -Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la especie y variedad utilizada para su producción. Se generan en condiciones particulares y son más valiosos y complicados de producir ⇒ alto contenido de “actividad biológica” -Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan en los organismos que los producen como: 1. Armas contra otros microorganismos (antibióticos, toxinas, inhibidores enzimáticos, pesticidas) 2. Factores de crecimiento (hormonas) 3. Ionóforos 4. Agentes de interacción microbiana 5. Efectores externos

PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o FERMENTACIONES Procesos que se llevan a cabo en un “bio”-reactor mediante los cuales se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas) en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin microorganismos, células o enzimas. Biorreactor o Fermentador Operaciones unitarias

Operaciones unitarias

Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial: Fermentación Propagación de los Esterilización cultivos Preparación de medios

Separación Purificación

Tratamiento de efluentes

1) Propagación de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de interés, o de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo. 2) Fermentación: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se siembra un tanque de inóculos cuyo volumen depende de la escala industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).

Principales etapas de un proceso biotecnológico industrial: Fermentación Propagación de los Esterilización cultivos Preparación de medios

Separación

Tratamiento de efluentes

Purificación

3) Separación y purificación: operaciones mecánicas de ruptura de células; separación de insolubles por filtración, centrifugación o sedimentación; separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración; purificación por extracción líquidolíquido, extracción en dos fases acuosas o cromatografía de afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto. 4) No tiene relación directa con el producto pero es una etapa imprescindible por los volúmenes involucrados y para preservar el medio.

Selección (screening) En la selección del microorganismo/célula, se debe tener en cuenta: 1. La cepa a utilizar debe ser genéticamente estable. 2. La velocidad de crecimiento debe ser alta. 3. La cepa debe estar libre de contaminantes. 4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de cultivo de costo reducido. 5. Deben ser de fácil conservación por largos períodos de tiempo sin pérdida de sus características. 6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto. 7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y de fácil recuperación a partir del medio de cultivo.

Los nuevos métodos de “screening” incorporan técnicas de ingeniería genética para crear diversidad.

Preparación de medios de cultivo – Esterilización Los componentes de los medios de cultivo son los “efectores externos” de naturaleza química que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y suministrar energía para el mantenimiento celular. Componentes de un medio de cultivo: 1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes de C, N, S, P, K y Mg 2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o µg/L 3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgánicos que no son sintetizados por las células y de función metabólica específica; se suministran en baja concentración (vitaminas, algunos aminoácidos, etc.)

Preparación de medios de cultivo – Esterilización Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza química de los componentes en: 1. Medios sintéticos o medios químicamente definidos 2. Medios complejos, en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc.) que aportan las sustancias fundamentales pero son químicamente indefinidas y de composición variable. Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente a ponerse en contacto con el inóculo. Esterilizar significa eliminar toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva a cabo por filtración o calentamiento.

Separación y purificación (downstream): (downstream) depende de la eficiencia del proceso y del producto a obtener

Fermentaciones - fermentadores o biorreactores Es el corazón del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores etapas de separación y purificación. discontinuas o batch semicontinuas (fed-batch) Fermentaciones continuas Para el diseño de los biorreactores se debe considerar la cinética del crecimiento de las células o microorganismos (“biomasa”) y la velocidad de formación de los productos deseados. Cinética de crecimiento de biomasa Definiciones Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan Cuantificación de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuación de Monod Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato

Cinética de crecimiento microbiano Sustrato + biomasa →

∑S + X

→

productos mayor cantidad + extracelulares de biomasa

∑P

+

nX

El crecimiento microbiano es un ejemplo de reacción autocatalítica. La velocidad de crecimiento está relacionada con la concentración de células. Velocidad específica neta de crecimiento (h-1): X: concentración másica de células (g/L) t: tiempo (h) Crecimiento

1 dX µ neta ≡ X dt

aumento en el número de células aumento del tamaño de las células

La velocidad específica neta de crecimiento es la diferencia entre la velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparición de biomasa por muerte celular o por metabolismo endógeno:

µ neta = µ g − k d También se puede expresar la velocidad en función de la concentración de número de células en lugar de la concentración másica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere la concentración másica. Formas de medir la concentración de células Se busca un método rápido, fácil de seguir en línea o de respuesta rápida. Directos Métodos Indirectos

Determinación de la concentración másica de células: Métodos directos (en ausencia de otros sólidos en suspensión): •Masa de células secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado) •Volumen de células centrifugadas en condiciones estándar •Absorción de luz por células en suspensión Métodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la velocidad de consumo de un sustrato o de formación de un producto. •Productos: etanol, CO2 •Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N •Propiedades físico-químicas: viscosidad, pH Ejemplo: seguir la concentración de ATP, ≅ proporcional a la masa de células. luciferasa

luciferina + ATP + O 2 → LUZ

Sensible > 10-12 gATP/L

Cinética de crecimiento de un cultivo en batch Etapas: 1) de latencia o inducción 2) de crecimiento exponencial 3) de desaceleración 4) estacionario 5) de muerte o declinación celular 3)4) Desaceleraci ón: velocidad por consumo de un nutriente esencial o generación de Estacionario: de crecimiento nula. Las células aún son 5) Muerte: el númerodel inóculo células, definir el límite con la 1) Latenciabaja : adaptación aldifícil medio. Depende del inóculo 2) Crecimiento exponencial: rápida multiplicación de células subproductos tóxicos crecimiento desbalanceado, las células deben activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibióticos, etapa (edadanterior. y tamaño) y de los(composición nutrientes. Sedepuede adaptar ex-situ. crecimiento balanceado células constante). readaptarse a las condiciones hostiles. hormonas) productos de la desregulación celular

1) Latencia: adaptación del inóculo al medio. Depende del inóculo (edad y tamaño) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ. 2) Crecimiento exponencial: rápida multiplicación de células crecimiento balanceado (composición de células constante). 3) Desaceleración: por consumo de un nutriente esencial o generación de subproductos tóxicos crecimiento desbalanceado, las células deben readaptarse a las condiciones hostiles. 4) Estacionario: velocidad neta de crecimiento nula. Las células aún son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibióticos, hormonas) productos de la desregulación celular 5) Muerte: baja el número de células, difícil definir el límite con la etapa anterior.

Crecimiento balanceado: todos los componentes de las células crecen con la misma velocidad → la composición media de las mismas permanece constante. Es válido para la etapa de crecimiento exponencial. exponencial En este período, la velocidad de crecimiento es independiente de los nutrientes y resulta en una cinética de primer orden porque el valor es aproximadamente constante:

1 dX dX µ neta t µ g ≅ µ neta = ⇒ = µ neta dt ⇒ X = X 0e X dt X Tiempo necesario para duplicar la biomasa:

X = 2X 0

ln(2) ⇒ τd = µ neta

Crecimiento no balanceado: los componentes de las células no crecen con la misma velocidad → la composición media se modifica. Esta situación caracteriza especialmente a la etapa estacionaria El estrés producido por la falta de nutrientes o por la existencia de subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil induce una reestructuración de las células para adaptarse a las nuevas condiciones.

µ g ≠ µ neta = µ g − k d

Puede ocurrir: •La concentración másica de células (X) es constante pero baja el número de células viables. •X baja por lisis de células. Puede aparecer un segundo período de crecimiento, los productos de lisis o las células muertas constituyen un sustrato alternativo (crecimiento críptico). •X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulación celular produciendo metabolitos secundarios.

1 dS  m=  X dt  m

Coeficiente de mantenimiento: se emplea para definir la velocidad específica de consumo de sustrato para energía de mantenimiento.

Energía de mantenimiento: necesaria para mantener la membrana celular activa y el transporte de nutrientes, y para funciones metabólicas esenciales como la movilidad y la reparación de estructuras dañadas. Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducirá pérdida de masa celular (metabolismo endógeno para adaptarse al medio).

Coeficientes de rendimiento: rendimiento se definen en base a la cantidad consumida de otro componente. Rendimiento de formación de células por masa ∆X YX /S = − de sustrato consumida (g células/g S) ∆S YX/S es un valor constante y es máximo en la etapa de crecimiento exponencial. Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea para otros fines:

∆ S = ∆ S formacion + ∆ S formacion de biomasa

de productos

+ ∆ S energia + ∆ S energia para cre cimiento

para man tenimiento

También se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:

∆X ∆P Y ; YP/S = − =− X / O2 ∆S ∆DO

Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aeróbicas en glucosa; para la mayoría de las bacterias y levaduras:

YX /S = 0,4 − 0,6 g / g ; YX/O = 0,9 −1,4 g/g 2

(en condiciones anaeróbicas suelen ser menores) Los rendimientos dependen del medio y de la fuente de C. Para la mayoría de los casos:

YX /S = 1± 0,4 g/g   g biomasa    g de C consumido 

Relación del crecimiento de biomasa con la formación de productos:

∑S

+ X →

∑P

+ nX

1 dP qP = = YP / X µ g X dt

Definimos la velocidad específica de formación de producto, qP Se encuentran 3 situaciones: (a) qP asociada al crecimiento celular, ej: producción de una enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).

q P = α µ g ⇒ α = YP / X

(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleración y estacionaria), ej: fermentación de q = α µ + β P g ácido láctico, xantanos y algunos metabolitos secundarios. (c) q no-asociada al crecimiento P

celular (etapa estacionaria, donde la µg=0) ej.: metabolitos secundarios como antibióticos.

q P = β = cons tan te;

µg = 0

Relación del crecimiento de biomasa con la formación de productos: 1 dP 1 dX qP = = YP / X µ g = YP / X X dt X dt

Asociada

q P = α µg

Parcialmente asociada

q P = α µg + β

Metabolitos primarios

No asociada

qP =β

Metabolitos secundarios

Factores que influyen – Temperatura del medio La velocidad de crecimiento disminuye por encima de la Top

La velocidad de crecimiento aproximadamente se duplica cada ∆T = 10°C

-psicrófilos (Top < 20°C) -mesófilos (20 50°C)

•Por encima de Top ocurre muerte celular → disminuye el número de células viables cuando la velocidad de muerte supera la de crecimiento. •Ambas velocidades siguen una ecuación tipo Arrhenius con

µ'g = A exp( −E a / RT ) Ea ≅ 10–20 kcal/mol

k d = A d exp( −E d / RT ) Ed ≅ 60–80 kcal/mol

La muerte celular es más sensible a T que el crecimiento (importante para la esterilización) •La T también afecta la velocidad de formación de producto pero la Top y la Ea suelen ser distintas. •También influye sobre el YX/S porque para T>Top, la energía de mantenimiento es mayor baja YX/S •Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.

Factores que influyen – pH del medio

Rango de pH óptimo

Variación de la velocidad específica de crecimiento con el pH. Existe un pH óptimo para cada tipo de célula, generalmente próximo a 7. Se puede incrementar el rango adaptando las células por incrementos pequeños.

•El pH óptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la formación de producto. •Los pH aceptables varían en ±1 o 2 unidades respecto del óptimo. •El pH óptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8. - levaduras: 3 – 6 - hongos: 3 – 7 - células vegetales: 5 – 6 - células animales: 6,5 – 7,5 •Algunos organismos pueden regular el pH empleando energía de mantenimiento. •El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N, aminoácidos, CO2)

Factores que influyen – concentración de O2 disuelto (DO): Es un sustrato importante para las fermentaciones aeróbicas. •Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de la velocidad de crecimiento. •La solubilidad del oxígeno en agua depende de la presión, de la temperatura y de las sales disueltas (a presión atmosférica es 7ppm). •La concentración crítica de oxígeno disuelto CO2,critica es aquella por debajo de la cual comienza a controlar la velocidad de crecimiento: • 5–10% de la concentración de saturación para bacterias y levaduras y ≅ 10–50% de la concentración de saturación para hongos (según el tamaño)

Transporte de oxígeno a las células

•El O2 se introduce por burbujeo y su concentración depende de la agitación.

•Velocidad de consumo de oxígeno (O2 uptake rate) OUR = q O 2 X =

µg X YX / O

2

•Velocidad de transferencia (O2 transfer rate) OTR = k L a LG  C*O − C O b  2   2

Factores que influyen – otros factores •Potencial redox: afecta las reacciones de óxido-reducción. Esta relacionado con la concentración de O2, el pH y las concentraciones de otros iones. Potencial de reducción del medio:

( ( ) ( ))

E(mV )= E 0 + 0 ,06 log PO + log H + 2

Se puede reducir bajando la concentración de O2 (burbujeo de nitrógeno) o por agregado de agentes reductores (cisteína, Na2S, HCl). •Concentración de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser tóxica para algunas células y necesaria para otras. Se regula modificando la concentración en la corriente de burbujeo. •Fuerza iónica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el interior de las células. Depende de la concentración y de la carga de los iones en el medio: FI = 12 ∑ ci Zi2 i

Generación de calor por crecimiento microbiano •40–50% de la energía suministrada por las fuentes de C se convierten en ATP (forma en que las células acumulan energía) →el resto se libera como calor. •El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpías de combustión del sustrato y de la biomasa formada:

CO 2 + H 2 O Crecimiento microbiano y respiración 1/YH (kJ/g célula)

+

celulas Combustión de las células ∆Hc (kJ/g)

Ciclo entálpico para calcular el calor generado combustion del sustrato, ∆H S ( kJ / g )

Sustrato + O 2    → CO 2 + H 2 O ∆HS YX /S

1 = ∆H c + YH

⇒ YH =

YX /S ∆HS − YX /S∆H c

•Algunos valores típicos: ∆Hc ~ 20 – 25 kJ/g células YH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol) 0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano) •El grado de oxidación del sustrato afecta fuertemente la cantidad de calor que evoluciona por el metabolismo de las células. •Para células en crecimiento activo, el requerimiento para mantenimiento es bajo →la evolución de calor está directamente relacionada con el crecimiento. •Velocidad total de generación de calor en una fermentación batch se calcula considerando la velocidad de crecimiento. 1 Q generado = µ neta X V YH •En una fermentación aeróbica, se correlaciona con la velocidad de consumo de oxígeno, dado que es el aceptor final de electrones.

Q generado = 0,12 Q O

2

Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa (b) serpentín externo (c) serpentín interno helicoidal (d) serpentín interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo

Reactor batch de escala industrial

Reactor batch de escala laboratorio

Reactor batch de escala banco

Reactores batch de escala piloto

Estequiometría del crecimiento microbiano y formación de productos Procesos complejos →reflejan el transcurso de miles de reacciones intracelulares. Es importante poder comparar el rendimiento y la generación de calor que se obtiene empleando distintos sustratos → la estequiometría de conversión de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se suele representar por ecuaciones pseudoquímicas simples.

CH m O n + a O 2 + b NH 3 → c CH α Oβ N δ + d H 2O + e CO 2 CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato CHαOβNδ representa un mol del material celular La composición del material celular depende del tipo de organismo. Un mol de material biológico es aquel que contiene un átomogramo de C

Por que una fórmula mínima escrita como: CHaObNd ? Composición elemental de la bacteria Escherichia coli Elemento

% en masa seca

C

50

O

20

N

14

H

8

P

3

S

1

K

1

Na

1

Ca

0.5

Mg

0.5

Cl

0.5

Fe

0.2

Otros

0.3

92% de la masa seca total esta formado por C, O, N, H

Componentes minoritarios no se tienen en cuenta en la fórmula mínima

Los coeficientes estequiométricos y la fórmula mínima se calculan planteando balances elementales, la información del cociente respiratorio y un balance de electrones disponibles.

CH m O n + a O 2 + b NH 3 → c CH α Oβ N δ + d H 2O + e CO 2 Balances elementales:

C: H: O: N:

1= c + e m + 3b = cα + 2d n + 2a = cβ + d + 2e 3b = cδ

Los balances para H y O pueden no dar información correcta por la gran masa de agua que tienen las células →se requiere información adicional. ●Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2 producidos por mol de O2 consumido provee una indicación del estado metabólico y puede emplearse para controlar el proceso. moles CO 2 generados e RQ = = moles O 2 consumidos a

●Balance de electrones disponibles: Para las reacciones mas complejas, con formación de productos extracelulares, se agregan componentes hay un coeficiente estequiométrico más y se requiere mayor información. Además, los balances elementales no se relacionan con los cambios de energía involucrados en la reacción. se desarrolló el concepto de grado de reducción, γ, para poder plantear balances de electrones y protones en bioreacciones. Grado de reducción: número de equivalentes de electrones disponibles por átomo-gramo de C. Los electrones disponibles son aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.

∑i,sustratos ν i γ i = ∑i,productos ν i γ i ν i :coef .estequiometri cos ; γ i :grados de reduccion

Cinética de crecimiento microbiano: Modelos productos mayor cantidad Sustrato + biomasa → + extracelulares de biomasa

∑S + X

→

(

∑P

+

nX

)

1 dX µ neta ≡ µ g − k d ≡ X dt µneta: Velocidad específica neta de crecimiento (h-1) µg: Velocidad específica de crecimiento de biomasa (h-1) kd: constante de muerte celular o disminución de masa celular por metabolismo endógeno (h-1) X: concentración másica de células (g/L) t: tiempo (h)

Cuantificación de la cinética de crecimiento: modelos cinéticos Modelos Estructurados Tienden a representar la estructura de las células. Pueden dividir la célula en sus componentes y considerar las reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona de la célula, como respuesta a cambios en el medio. Modelos Segregados Tienen en cuenta que el medio no es homogéneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoquímicas del medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). También permiten considerar la posibilidad de agregación de células. Descripción detallada debería involucrar diferenciaciones en la estructura de la célula y la segregación del medio de cultivo en unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades físico-químicas modelos estructurados-segregados

MAYOR COMPLEJIDAD

No estructurados

Estructurados

Segregados

Segregados

No estructurados

Estructurados

No segregados

No segregados

Son más realistas, pero son complejos y demandantes de tiempo de cálculo.

MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD

El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del objetivo se debe elegir el modelo más simple capaz de representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.

Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados Modelos No-Estructurados Suponen una composición fija de la célula (equivalente a suponer crecimiento balanceado). -Son estrictamente válidos para la etapa de crecimiento exponencial en batch -No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la célula sea rápida y/o las perturbaciones sean leves.

Modelos No-Segregados

Consideran un medio homogéneo.

-Representan adecuadamente muchos casos.

Modelos cinéticos de crecimiento: controlados por sustrato Suponen que la cinética depende solamente de un único sustrato esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no afectan. Más difundido Modelo de Monod

µ g(h-1)

µg =

µm S Ks + S S (µM)

Supone que un único sistema enzimático controla el consumo de sustrato y que dicho sistema determina la velocidad de crecimiento de biomasa. biomasa La premisa es generalmente falsa, pero la ecuación de Monod ajusta una amplia gama de resultados experimentales y es la expresión más empleada para el diseño de fermentadores.

µm: máxima velocidad específica

µg(h-1)

µg =

de crecimiento de biomasa µg = µ m cuando S >> K s

µm S

Ks: constante de saturación o de velocidad media

Ks + S

µg = 12 µ m

cuando S = K s

S (µM) Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de crecimiento y baja densidad de células. Para cultivos concentrados se usan expresiones similares, modificando Ks:

µg =

µm S

K S S0 + S 0

o

µg =

µm S

K s + K s S0 + S 1

0

Nociones de diseño de fermentadores o biorreactores •La elección del tipo de reactor y de la estrategia de operación define la producción a obtener y la pureza del producto (número y tipo de impurezas, reactivos sin convertir). También determina si se puede lograr un producto de calidad constante y una operación confiable. •En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital. Tipos de reactores comúnmente empleados Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos. Continuos (quimiostato): hay alimentacion continua de sustrato y retiro continuo de productos Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso continuo o intermitente de sustratos, sin retiro de productos.

Reactores discontinuos o batch Producción de biomasa o de un producto asociado a crecimiento (metabolito primario): En un batch se observan 4 etapas: 1) Preparación para la nueva operación (limpieza, esterilización, llenado del reactor) 2) Sembrado y período de inducción 3) Período de crecimiento exponencial 4) Recuperación del producto del reactor La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo muerto, tm, a considerar en el diseño del reactor varía con el tamaño del reactor y con el tipo de fermentación pero generalmente es del orden de las horas (3–10 hs) tiempo total de operación para llegar a una concentración final de biomasa Xf :  Xf  1  tc = tm + ln µ neta  X 0 

La concentración final de biomasa, Xf , depende de la cantidad de sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento: kg X f − X 0 = YX / S S0 −S m3

(

)

La mayoría de las fermentaciones operan con una relación Xf/X0 de aproximadamente 10–20. La velocidad de producción de biomasa por operación del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa total que podemos formar por el tiempo que lleva la operación:

rb =

YX / SS0

(1/ µneta )ln(Xf

)

X0 + t m

kg m3s

Una operación continua en condiciones óptimas conduce a una producción significativamente superior porque no hay tiempos muertos. De todos modos, la mayoría de las fermentaciones son procesos discontinuos.

Por qué? • En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento; el crecimiento de las células puede incluso inhibir la producción del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera solo con velocidades de dilución muy bajas, muy por debajo de la que lleva a la óptima productividad de biomasa. Para producción de metabolitos secundarios, la productividad en un batch puede superar significativamente a la de un reactor continuo. • Otra razón importante para que se prefiera la operación discontinua es la inestabilidad genética. Los microorganismos que se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen menor velocidad de crecimiento que las originales. Una operación continua impone una selección severa cuando hay mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad de crecimiento.

Por qué? •Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad de la operación. Los reactores batch conducen a productos con mucha variabilidad genera problemas en las etapas de purificación. Sin embargo en los sistemas continuos una falla mecánica o de control de alguna variable de operación o de la esterilización del proceso puede conducir a problemas severos. Las consecuencias de una falla de operación son mas graves en un sistema continuo y las pérdidas mayores. •La economía de mercado influye en la selección del reactor. Un sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso un único producto. Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeñas cantidades y su demanda es difícil de proyectar. Los sistemas batch son más versátiles, el mismo reactor puede emplearse para distintos productos.

Cultivos continuos se agrega un medio con nutrientes frescos en forma continua, a un volumen de control que contiene las células. Se retiran continuamente productos y parte de las células. -Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen constantes en un dado punto del reactor. -Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para el crecimiento de las células y para la formación de productos calidad uniforme de los productos -Pueden ser una herramienta importante para determinar como un microorganismo responde al medio, y para generar un producto en condiciones óptimas. Sistemas con mezclado Quimiostato perfecto: perfecto Tanques Sistemas para continuos idealmente Turbidistato lograr cultivos agitados (TCIA) continuos Flujo Pistón Ideal (FPI): mezclado radial perfecto y mezclado axial nulo; nulo poco empleado, salvo para inmovilizados

Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las condiciones químicas del medio son constantes.

Turbidistato: la concentración de células en el reactor se mantiene constante. La alimentación se regula mediante el monitoreo de la densidad óptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la turbidez supera un límite prefijado. El volumen se mantiene constante retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega. •Se usa menos que el quimiostato porque es más elaborado y porque el medio cambia. •Puede ser muy útil para seleccionar subpoblaciones que puedan soportar condiciones de stress, porque la concentración de células se mantiene constante.

FPI (Flujo Pistón Ideal): como no hay retromezclado, los elementos de fluido con células activas no pueden inocular elementos de fluido nuevos aguas arriba se requiere el reciclo continuo de células para inoculación continua del medio fresco alimentado.

L(+G,S)

L(+G,S)

•Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posición en el reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch. •Equipos con células inmovilizadas (trickling filters) se asemejan a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en tratamiento de efluentes.

Reactores tubulares de biofilm en columna de burbujeo y rellenas (a) reactor de arrastre para producción biotecnológica de etano, Delft (The Netherlands); (b) reactores de producción de cerveza en Brasil. Fuente: Nicolella C, van Loosdrecht MCM, Heijnen SJ: Particle-based biofilm reactor technology. Trends in Biotechnology 2000

Producción de algas en fotobiorreactor es tubulares (flujo tipo FPI)

Producción de algas en fotobiorreactores tubulares (flujo tipo FPI)

Fotobiorreactor tubular helicoidal de 1000 L (Murdoch University, Australia)

Recuperación de microalgas a partir del medio de cultivo por filtración Cyanotech Corporation (www.cyanotech.com), Hawaii, USA.

Cultivos continuos: Quimiostato ideal Es un tanque agitado que se opera con circulación continua (TCIA) del medio de cultivo. La mayoría requiere control (pH, T y CO2). •Se alimenta medio estéril (X0= 0) a un tanque perfectamente agitado (y aireado si es fermentación aeróbica). Se deja salir la suspensión de células para mantener las concentraciones y el volumen de líquido constante. Fv S0, X0, P0

Burbujeo de gas

Fv S, X, P Las concentraciones a la salida del reactor son iguales a las del interior por la hipótesis de mezclado perfecto Volumen de líquido = volumen de reactor = V

Balances de masa Ecuaciones de diseño Planteando balances de masa para los distintos componentes, se obtienen las ecuaciones de diseño.  Masa que   Masa que   Masa      entra al VC sale del VC  −  +  generada  con los   con los   dentro del      reactivos productos      V.C.

  Masa   Masa       consumida acumulada − =    dentro del   dentro del       V.C. V.C.     

Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO Un quimiostato opera en estado estacionario de acumulación de masa:

se cancela el término

 Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada  =  al V.C. con  +    del V.C. con  +      los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C.     

Quimiostato - ecuaciones de diseño  Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada  =  al V.C. con  +    del V.C. con  +      los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C.     

Fv S0, X0, P0

Fv S, X, P

Balance de masa de células:

FV X = FV X 0 + Vµ neta X

(

)

⇒ FV X = FV X 0 + V µg − k d X

V

FV: caudal volumétrico de medio de cultivo agregado (L/h)

Gas

Definiendo el factor de dilución como caudal/volumen: D = FV/V

(

)

⇒ DX = DX 0 + µg − k d X

(

)

Si se alimenta medio estéril (X0= 0) y el mecanismo endógeno es despreciable

⇒ DX = DX 0 + µg − k d X

⇒ D = µg

Importancia de este resultado: En un quimiostato en D= g EE, alimentado con medio estéril y en condiciones en las que el metabolismo endógeno es despreciable, la velocidad o factor de dilución, D, iguala a la velocidad de crecimiento de células se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parámetro independiente modificando las variables de operación el quimiostato es una herramienta experimental poderosa

µ

Si la velocidad de crecimiento sigue la expresión de Monod

D = µg =

µm S Ks + S

S: concentración de sustrato limitante del crecimiento de biomasa en EE

Si se impone un factor de dilución D > µm , las células no se podrán reproducir lo suficientemente rápido para mantenerse se lavan, o se vacía el quimiostato (“washout”)

BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endógeno):  Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada  =  al V.C. con  +    del V.C. con  +      los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C.     

FVS

1 1 + Vµ g X M + Vq P X YX /S YP /S

Formación de biomasa

=

FVS0

Formación de producto

FV: caudal volumétrico de medio de cultivo agregado (L/h) S: concentración de sustrato limitante del crecimiento (g/L) V: volumen del reactor (L) µg: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h) X: concentración de biomasa (g/L) qP (gP/gcélulas/h): velocidad específica de productos extracelulares YMX/S (g células/gS) : máximo rendimiento de biomasa a partir de S YP/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S

Concentración másica de células en estas condiciones (EE y sin metabolismo endógeno):

(

)

D S0 −S

= X

µg YXM/S

Como además µg = D y si la formación de productos extracelulares es despreciable:

+ X

qP YP /S

(

X = YXM/S S0 −S

M

)

Estrictamente, YX /S depende de la concentración de sustrato y de la velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0

La productividad en un fermentador continuo se obtiene como el producto del factor de dilución por la concentración de células, DX (g/Lh)

Productividad en un quimiostato, suponiendo válida Monod (EE sin metabolismo endógeno ni formación de productos extracelulares): se obtiene del

producto del factor de dilución por la concentración de células, DX (g/Lh):

(

X = YXM/S S0 −S D = µg =

µ mS K s +S

)

⇒ S=

DK s

µm − D

2  D Ks  M   ⇒ DX = YX /S DS0 −   µ − D m  

La velocidad de dilución que maximiza la producción de biomasa se obtiene de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:

 Ks  D op( X ) = µ m 1−  K + S s 0 

   

Normalmente Ks<< S0 ⇒Dop(X) → D = µm , o sea al punto de lavado

Es muy difícil lograr una operación estable para D ≅ µm. Generalmente, se usa un valor de D algo menor que Dop(X) como solución de compromiso para mejorar la estabilidad con buena productividad.

Reemplazando la expresión de Dop en la ecuación que da la productividad de biomasa DX:

 D op K s   DX )op = YXM/SD op  S0 −   µ D − m op   Se obtiene la máxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en un quimiostato en EE, sin metabolismo endógeno y sin formación de productos extracelulares:

 Ks M  DX )op = YX /Sµ m 1−  K S + s 0 

  S + K − K K +S s s s 0  0 

(

(

M

µ

Normalmente Ks<< S0 ⇒DX)op →YX /S mS0

))

Efecto del factor de dilución sobre la concentración de células, D (1/h) S (kg/m ) concentración de sustrato y la productividad. 0.06 0.006 3

1

0.5 3

0.4

0.12 0.24 0.31 0.43 0.53 0.6 0.66 0.69 0.71 0.73

S0

0.8

X (kg/m )

0.3

0.6

0.2

0.4

0.013 0.033 0.04 0.064 0.102 0.122 0.153 0.17 0.221 0.21

X (kg/m3) 0.427 0.434 0.417 0.438 0.422 0.427 0.434 0.422 0.43 0.39 0.352

DX 3

0.1

0.2

3

(kg/h.m 0.3)

S (kg/m ) 0

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8 -1 D (h )

µm

0.2 0.1 0 0

0.2

0.4

-1 0.6 D (h0.8 )

Algunas aplicaciones de los sistemas continuos: - producción de algunas proteínas - tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean microorganismos o enzimas inmovilizadas. - producción de etanol - producción de productos asociados a crecimiento, especialmente en gran escala (por ejemplo, ácido láctico) Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en bioprocesos Quimiostato con reciclo La generación de biomasa es “autocatalitica” mayor concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad de crecimiento. Para lograr en un quimiostato una concentración de biomasa mayor, se pueden reingresar al reactor las células que salen.

Quimiostato con reciclo: el reciclo de células incrementa la productividad y también la estabilidad en algunos sistemas, dado que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes, muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentación). Fv S0,X0,P0

αFv S1,cX1,P1

V Gas

α: relación de reciclo basada en caudales volumétricos. Fv(1+α) c: factor de concentración S1,X1,P1 relación de la concentración de células en la corriente Fv de reciclo sobre la que S1,X2,P1 sale del reactor Separador de células: puede ser por filtración, centrifugación o sedimentación

Balances de biomasa :  Masa que   Masa que   Masa   Masa   Masa   sale del VC   entra al VC   consumida   generada   acumulada   con los  −  con los  +  dentro del  −  dentro del  =  dentro del   productos   reactivos   V.C.   V.C.   V.C.           

(1+ α ) FV X1 −

(FV X 0 + αFVcX1 ) fresca

− Vµ neta X1 = 0

reciclo

En EE: dX1/dt = 0 y si se alimenta medio estéril X0=0 ⇒

(

αFv S1,cX1,P1

Vµ neta X1 = (1+ α ) FV X1 − αFV cX1

µ neta = D(1+ α − cα )

)

V Gas

Fv S0,X0,P0

Fv(1+α) S1,X1,P1 Fv S1,X2,P1

Fv S0,X0,P

αFv S1,cX1,P

0

1

V

µ neta = D[1+ α(1− c)] Fv(1+α) S1,X1,P1 Fv S1,X2,P 1

Gas

Como c > 1 ⇒ α(1-c) < 0

µ neta < D Cuando hay reciclo, el quimiostato puede operar con una velocidad de dilución mayor que la de crecimiento

BM sustrato limitante (en EE):  Masa que sale  Masa consumida  Masa que entra  Masa generada  =  al V.C. con  +    del V.C. con  +      los productos   dentro del V.C.   los reactivos   dentro del V.C.     

1 1 (1+ α )FVS1 + Vµg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + αFVS1 YX /S YP /S Formación de biomasa

Formación de producto

BM sustrato limitante (en EE y en ausencia de productos extracelulares):

1 1 (1+ α )FVS1 + Vµg X1 M + Vq P X1 = FVS0 + αFVS1 YX /S YP /S

(

)

D

YXM/S S0 −S1

1 ⇒ Vµg X1 M = FV S0 + αS1 − (1+ α )FVS1 YX /S

⇒

X1 =

µg

(

Si k d = 0 ⇒ µ g = µ neta = D[1+ α(1− c)] ⇒

) X1 =

(

YXM/S S0 −S1

)

1+ α(1- c )

La concentración de células en un quimiostato en EE con reciclo se incrementa por el factor 1/[1+α(1-c)]

Si es válida Monod y para kd=0 ⇒ S=

K s [1+ α(1- c )]D

µm −[1+ α(1- c)]D

X1,cr X1,sr

µg =

µ mS Ks +S

=

µ neta = D[1+ α(1− c)]

⇒

 K s [1+ α(1- c )]D  S −  X1 = 0 [1+ α(1- c)] µ m −[1+ α(1- c)]D  YXM/S

Velocidad de generación de biomasa

Fv S0,X0,P0

αFv S1,cX1,P1

Fv(1+α) S1,X1,P1

c = 2 ; α = 0.5 V con reciclo

sin reciclo

Gas Fv S1,X2,P1

Quimiostatos múltiples en cascada: en algunas fermentaciones, particularmente para la producción de metabolitos secundarios (ej.: un antibiótico), conviene separar las etapas de crecimiento de biomasa y de formación del producto deseado pues las condiciones óptimas son diferentes con múltiples quimiostatos, se pueden fijar condiciones distintas en cada uno: pH, temperatura, conc. de nutrientes por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener: -Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa -Un segundo tanque donde se promueva la formación de producto(*) (*) el crecimiento será desbalanceado y un modelo no-estructurado no es el más apropiado. Los resultados serán aproximados.

Fv’,S0’,X0’

Quimiostatos múltiples en cascada: Fv,S0,X0

Primer quimiostato S1 =

Fv,X2,S2

Fv,X1,S1

K s D1

µ m − D1

(

X1 = YXM/S S0 − S1

X1 S1

)

X2 S2 V2

V1

en EE, válido Monod y con metabolismo endógeno despreciable Segundo quimiostato BM de biomasa FV X1 − FV X 2 + V2µ neta , 2 X 2 = V2

dX 2 dt

= 0 en EE

 X1   X 2 − X1 = µ neta , 2 X 2 ⇒ µ neta , 2 = D 2 1 −  X  V2 2  FV

(

)

Como X1 < X2 ⇒

µneta,2 < D2

Ejemplo de aplicación de un sistema multietapa con agregado de una corriente: cultivo de células modificadas por ingeniería genética •En general se agregan promotores a los sistemas con células que contienen ADN recombinante para inducir la producción de la proteína de interés. •La presencia del promotor favorece la producción de la proteína pero reduce la velocidad de crecimiento de las células que contienen plásmidos, respecto de las que lo han perdido. un quimiostato de una única etapa tendrá problemas de inestabilidad genética. empleando un sistema de 2 etapas: Primer quimiostato para producción de células (sin promotor) Segundo quimiostato para producción de la proteína (c/promotor): Se logra mantener la estabilidad genética por el continuo agregado de células frescas.

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”: En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar problemas de inhibición por sustrato Xf,Sf,Pf S0,X0,P0 Fv,S0 (X0)

V0 X0,S0,P0 1)Carga

Vf

V

Xf,Sf,Pf 3)Recuperación del producto

X,S,P 2)Realimentación

1) Desde la carga hasta el momento de la realimentación periódica, el sistema se comporta como un batch: X = X + Y M S − S 0

X /S

(0 )

Xm es la máxima X a alcanzar con S0 , que se da ⇒ X m = YXM/SS0 cuando S << S0 y para la cual también X0 << Xm

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”: Cuando X ≅ Xm , se agrega una corriente de Fv,S0 (X0) nutrientes frescos con un caudal volumétrico Fv y de una concentración S0. La variación de volumen es: dV = Fv ⇒ V = V0 + (Fv) t dt V Durante la realimentación, el BM de biomasa X,S,P es: d(VX ) dX dV FV X 0 + Vµ neta X = =V +X 2)Realimentación dt dt dt entra + se genera = se acumula

(

)

(

dX FV X dV dX = X 0 + µ neta X − = DX 0 + X µ neta − D ⇒ ≅ X µ neta − D dt V V dt dt Como el sustrato se consume casi todo ⇒ dX/dt ≅ 0 µneta ≅ D (condición de estado cuasi-estacionario). Luego: Como D ↓ porque ↑ V, µneta va disminuyendo continuamente.

)

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”: BM para el sustrato: Vµg X Vq X d(VS) Fv,S0 (X0) − P = FVS0 − dt YXM/ S YP / S entra − se consume = se acumula Si no consideramos la formación de V productos y dado que la masa de sustrato se mantiene siempre µg (XV ) X,S,P baja y ≅ constante: FVS0 = 2)Realimentación YXM/ S

d(XV ) ⇒ = µ neta (XV ) ≅ FVS0 YXM/ S ⇒ (XV )= X 0 V0 + FVS0 YXM/ S t dt (es igual en ausencia de metabolismo endógeno) Es decir, la masa de células generadas es linealmente proporcional al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.

Operación con alimentación semi-continua “Fed-batch”:

Variación de las concentraciones de biomasa, sustrato y producto, y de la velocidad de crecimiento y volumen del cultivo en función del tiempo, para el primer ciclo de un reactor alimentado (fed-batch):

µ (h-1)

V (mL) 1000 X (g/L) P (g/L)

0.6 V (mL)

800

600

0.4

µ (h ) -1

400

0.2 200 P (g/L)

X (g/L)

0

0 0

0.5

1

1.5

t 2(h)

Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilización de microorganismos tiene aplicación si los productos son extracelulares Ventajas sobre los cultivos con células en solución: •Proveen una alta concentración de células •Las células se usan en forma continua y se eliminan costosos procesos de recuperación y reciclo de células •Se eliminan el problema del “washout” a altas velocidades de dilución •Se pueden lograr altas productividades •Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores rendimientos y una mejor performance del biocatalizador •En algunos casos mejora la estabilidad genética •En algunos casos disminuye el daño por abrasión de las células

Sistemas con microorganismos inmovilizados Desventajas respecto de los cultivos en solución: •El problema más grave es que no se pueden emplear para productos que no sean excretados de las células •La inmovilización generalmente conduce a problemas de limitaciones por transferencia de masa •El sistema se torna muy heterogéneo por las limitaciones de transporte y es difícil de controlar •Si las células están vivas, el crecimiento y la evolución de gases ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte. Los métodos de inmovilización son similares a los que se utilizan para enzimas. Se complica con las células vivas.

Activa: captura o unión de células por Inmovilización métodos físicos o químicos Pasiva: formación de biofilms, crecimiento de múltiples capas de células sobre un soporte sólido •También se pueden emplear reactores de membrana, generalmente tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable. Las células se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los tubos, a los cuales difunde el producto. •Un buen soporte debe ser rígido y químicamente inerte; debe contener a las células firmemente y tener alta capacidad.

Fermentadores: Equipos comúnmente empleados •Tanques agitados •Columnas de burbujeo •Air-lift o reactor de arrastre •Lechos rellenos

H/D~3–6

Esquema de un tanque agitado

Esquema de una columna de burbujeo H/D~1–2

Tanques agitados de escala laboratorio

Tanques agitados de escala laboratorio con células inmobilizadas

Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2-20 litros)

Global Medical Instrumentation – http://www.gmi-inc.com

Fermentadores de escala banco-piloto (V ~ 15-75 litros)

Fermentadores de escala piloto V ~ 100-1000 litros

Biorreactor de escala piloto

Plantas piloto de bioprocesos

Esquema de un tanque agitado de mayor escala

Variables que se controlan en un biorreactor industrial

Esquema de un fermentador tipo tanque agitado de escala industrial (100m3). H ~ 15 m de alto D ~ 4,2 m de diámetro

Tiene líneas de vapor para realizar la esterilización in situ de las válvulas, cañerías y sellos. Se debe esterilizar también el aire que ingresa por filtración o por calentamiento.

Biorreactor de escala industrial

Reactor tanque industrial -generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado. -debe minimizar zonas muertas y permitir la inserción de sensores -relación de aspecto H/D=2.5–3.0 para crecimiento de bacterias porque mejora la transferencia de oxígeno. Para células animales se usan tanques de baja relación de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado -se debe poder vaciar totalmente -si tiene menos de 500L pueden ser de vidrio

Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la agitación que inducen

Agitación inducida por turbinas radiales del tipo Rushton

Agitación inducida por turbinas axiales

Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas

Interior de un tanque agitado

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vórtices que se forman por la agitación. Se los ubica levemente desplazados de la pared para disminuir la formación de zonas estancas.

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L 400rpm – sin baffles

vórtice

400rpm – con baffles

Agitación y distribución de gas en reactores agitados •La determinación de la velocidad de transferencia de oxígeno y el calor liberado son claves para el diseño de los fermentadores. •La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersión de gas, que es función del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al aumentar la velocidad de agitación. > RPM

Influencia de la velocidad de agitación sobre la turbulencia y la dispersión de gas inducida por agitación mecánica en un reactor de laboratorio de 2L.

300 rpm

450 rpm

750 rpm

Fracción gaseosa (adimensional)

Tomografía de una sección del reactor agitado. Jets gaseosos de los inyectores de gas Perfil de velocidades (cm/s) del líquido en un reactor gas-líquido agitado. Se observa la formación del vórtice característico de las turbinas radiales.

Reactor agitado en suspensión de escala banco: 20cm de diámetro y de alto (volumen ~ 8L)

Reactor tanque agitado: Problemas ocasionados por la evolución de espuma: -peligro de contaminación -complica la circulación de gases vórtice -complica el mezclado -cambian las velocidades de transferencia masa y de calor

Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo Columna de burbujeo de escala banco: V~10L

Columnas de burbujeo para el cultivo de algas

Columnas de burbujeo Regímenes de flujo en columnas de burbujeo: depende del caudal de gas y del distribuidor que se emplee

Configuraciones comunes de fermentadores Configuraciones de recirculación interna inducida por el flujo de aire “Air-lift”

Air-lift con inserción de aire en el tubo central

Air-lift con inserción de aire en el anillo y mezclado en el tubo central

Air-lift con inserción de aire en el tubo central y recirculación inducida

Reactor air-lift de laboratorio con entrada de aire en el anillo circular Zona donde se produce la separación entre el gas que se libera hacia el exterior del reactor y el líquido que recircula Riser: zona donde se hace la inyección de aire, el flujo es ascendente y contiene burbujas Downcomer: zona donde el líquido desciende, a lo sumo tiene pequeñas burbujas disueltas

Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles de velocidades, energía cinética y tensión de deformación

Escala banco (0,2 x 2)m

Shear Stress

Kinetic Energy

Reactor de tipo air-lift circulante

Airlifts de forma triangular para el cultivo de algas (planta piloto de cogeneración de energía del MIT)

Airlifts de forma triangular para el cultivo de algas

luz

Alimentación de gas y líquido

Configuraciones comunes de fermentadores Reactores de lecho fijo – uso frecuente en tratamiento de efluentes y en producciones dedicadas Reactores trickle-beds o de lecho a goteo Cocorriente Contracorriente

Columnas de burbujeo rellenas

Inmovilización pasiva (biofilms): Los biofilms son grupos de células que crecen en multicapas sobre soportes sólidos. •El soporte puede ser inerte o biológicamente activo. •La formación de biofilms es común en equipos de fermentación industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos). • La interacción entre las células y el soporte puede ser muy compleja. •Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa. •Las condiciones dentro de un biofilm grueso varían con la posición y afectan la fisiología de las células porque los nutrientes difunden hacia el interior del film y los productos hacia fuera. •El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentración de biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr. Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de biomasa y otro para la formación de productos.

Soportes de biofilms

Soportes de biofilms

Crecimiento del biofilm sobre el soporte

Estrategias de escalado: -Multiplicación -Reglas de uso -Análisis del régimen y escalado hacia menor tamaño La multiplicación implica replicar muchas veces el resultado que se obtiene en un reactor de escala relativamente pequeña, en lugar de llevar a cabo el proceso en un reactor de mayor tamaño.

Producción de ácido glucónico

Producción de gluconato de sodio con A. niger

Producción de antibiótico

Producción de lisina (10000 ton/año) en 20 fermentadores de 250 m3

Producción de vacunas para cólera (Suecia)

Drogas medicinales

Reglas de uso : basadas en análisis dimensional y criterios de similaridad de algunos parámetros % de uso en la industria

Criterio de escalado

30

Potencia/Volumen

30

kLaLG

20

Velocidad en la punta del agitador

20

Concentración de oxígeno

Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; diámetro del agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds

Análisis del régimen y escalado hacia menor tamaño Consideraciones a tener en cuenta en el escalado Factores que influyen en el cambio de escala

Fluidodinámicos

Transporte

régimen de flujo, ∆P/∆Z mezclado, fracción de gas kL, aLG, h

Se debe trabajar en el mismo régimen de flujo en las distintas escalas para que las comparaciones tengan sentido. Para caracterizar el mezclado, se pueden hacer experiencias de DTR (Distribución de Tiempos de Residencia) Se plantean modelos que consideran los distintos factores: fluidodinámica, transporte de masa y calor, cinética simulación del reactor para predecir el comportamiento en distintas condiciones de operación. Se pueden realizar medidas específicas incluso en el reactor en operación (OTR o coeficientes de transferencia).

Análisis del régimen y escalado hacia menor tamaño La concentración de oxígeno es diferente en distintas zonas del reactor. Se puede simular considerando varios reactores con distinta alimentación de oxígeno

Modelo del sistema que supone dos compartimientos con distinta concentración de oxígeno