Aislamiento De Vjt

Laura Silva Rosales Tesis Doctoral, 1995

Protocolo de aislamiento de VJT Reactivos Aproximadamente 40 plantas de tabaco infectadas con VJT. 20mM HEPES  (hcer concentrado de 200 mM o 1M). Esterilizado en autoclave. N­ butanol Sulfito de sodio PEG (PM 8000) NaCl Triton X­100 20 mM Tris (pH8.0) Tubos Corex estériles (15ml) 20 mM Tris ( o 200 mM concentrado) Botellas para rotor GSA, SS34 estériles Procedimiento Extracción cruda: Colectar tejido de hoja (se recomiendan 1000g) ___________ g Moler tejido en vaso de licuadora enfriado con: 2X vol:wt 20 M HEPES (pH7.5)     (1) ___________ ml butanol al 18% (con. final)             (1) x 0.18 =   (2) ___________ ml Sulfito de Sodio al 0.1 %               (1) x 0.001=   (3) ___________ g Moler en velocidad alta durante 1.5 minutos Pasar molido  a través de gasa y exprimir Centrifugar  en botellas GSA a 4500 rpm durante 5 min. Guardar sobrenadante y filtrar a través de fibra de vidrio Combinar todos los sobrenadantes. Precipitación del virus: Medir volumen                                                     (4) ___________ mls Pasar a un vaso grande Agregar Tritón, PEG y NaCl: 1.0 % (wt/vol) Tritón X­100   (4) x 0.01 =      ___________ mls    4%  (wt/vol) PEG 8000        (4) x 0.04 =      ___________ mls

Laura Silva Rosales Tesis Doctoral, 1995

0.1 M NaCl                       (4) x 0.00568 =      ___________ mls Agitar en hielo durante 2 horas. Transferir a botellas GSA, centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. GUARDAR PASTILLAS Resuspenderlas bien con 20 mM HEPES (pH7.5) en 1/4 del  volumen original de (1). Centrifugar en rotor  GSA durante 10 min a 8000 rpm. GUARDAR SOBRENADANTES, medir volumen. (5) ___________ mls Transferir a un vaso pre­enfriado y agregar: 8% (wt/vol) PEG             0.08 x (5) ___________ g 0.1 M NaCl                 0.00568 x (5) ___________ g Agitar a 4 oC durante 2 horas. Centrifugar en rotor GSA durante 10 minutos a 8000 rpm GUARDAR PASTILLAS Resuspender pastillas en  9 mls de HEPES (pH7.5) Purificación del virus en gradiente de CsCl: Preparar solución con CsCl con lo siguiente: 11.6 g CsCl 27.0 mls de HEPES (pH7.5) Agregar a tubos SW 50.1 lo siguiente: 3.5 ml de solución  CsCl Agregar solución viral en la superficie de la solución CsCl Centrifugar a 36 000 rpm durante 10­12 horas a 4oC. Aislamiento del virus del gradiente de CsCl: La banda viral debe de mostrarse a 1 cm de la base del tubo. Colectar la banda con un aguja no. 18 y jeringa de 1 ml, evitando la  banda de "basura" arriba de la viral. Combinar  volúmenes de bandas en tubo Corex de 15 mll Lleva volumen a 12 mls con 20 mM HEPES (pH 7.5) Centrifugar en rotr ss34 durante 10 minutos a 10 000 rpm. GUARDAR SOBRENADANTE

Laura Silva Rosales Tesis Doctoral, 1995

Vaciar a vaso de 50 mls y agregar PEG a 8%  (0.96 g)  Agitar en frío durante 1 hora Centrifugar durante 10 minutos en rotor SS34 a 10000 rpm a 4oC. GUARDAR PASTILLAS Resuspender pastilla final en 1­2 ml de 20 mM Tris (pH8.0) Cuantificación del virus: Volumen de solución viral: ___________ mls Diluir 1:500 ó 1:100 en 500 µl de H2O Registrar absorbancia 260/280 de la dilución:

Abs. 260 nm = ___________ Abs. 280 nm = ___________ 260/280 = ___________  (virus puro 260/280= 1.18). Para estimar la concentración de virus: Abs. 260 nm X Factor de dilución =      _______ mg/ml                      2.4 Rendimiento =     _________mg/  100g tejido