Aislamiento De Mdmv

PURIFICACION DE MDMV

Adaptado por:  Fulgencio Espejel Carrasco por W. Lamgenberg Plant Virology, Protocols  Volumen 81, Foster y Taylor Complementado por Susana Ruiz 15/04/08

Este método fue desarrollado originalmente por W. Lamgenberg, quien reportó que la adición de HCL guanidina 2M en las etapas  1­6 aumenta significativamente la producción de virus. Preparar los reactivos un día antes!! BUFFERS PARA LA PURIFICACION DE MDMV o SCMV __1. Buffer A: Citrato de amonio 0.1 M, dibásico, a pH 6,0 ajustado con KOH sólido. Preparar una solución stock 1.0 M. __2. Buffer B: Es Buffer A conteniendo 1% de Polivinyl pirrolidona (PM 40,000) y 0,5% 2-ß-mercaptoetanol (Buffer de molienda) __3. Buffer C: Buffer A conteniendo 0.5% de 2- ß-mercaptoetanol __4. Buffer D: Buffer C conteniendo 20% (w/v) sacarosa __5. Buffer E: Buffer A conteniendo 10, 20, 30 y 40% de sacarosa (w/v) para la preparación del gradiente de sacarosa. Procedimiento: 1.- Colectar 1500 g de tejido infectado y moler en una licuadora grande preenfriada y con un mínimo de 1 – 1.5 volúmenes (p/v con respecto al tejido inicial) de buffer B _____. Tamizar el contenido a través de diversas capas de gasa, exprimiendo la savia hasta donde sea posible en un vaso de vaso de precipitado de 2 litros. 2.- Adicionar tetracloruro de carbono al 5% (v/v) ______y mezclar por 5 s (hacerlo en campana de extracción) y repartir la savia en cuatro botellas de centrífuga de 500 ml cada uno (poner en hielo) 3.- Centrifugar a 7000 rpm por 10 min a 4°C usando el rotor JA10. 4.- Recuperar con cuidado el sobrenadante (cuidando de no llevarse el tetracloruro de carbono!, de preferencia usar lana de vidrio estéril y un embudo) y ponerlo en otro vaso de vaso de precipitado de 2 litros para adicionarle Triton X-100 a una concentración final de 0.25% ______ y adicionar PEG sólido a una concentración final de 6%______. Agitar hasta disolver (alrededor de 1 h) hacerlo en el cuarto frío. Repartir el sobrenadante en botellas de centrífuga de 500 ml. 5.- Centrifugar la solución por 20 min. a 10000 – 15000g (7000 rpm en JA14) a 4ºC, descartar el sobrenadante. Resuspender la pastilla en aprox 1/10 volúmenes de buffer C ____ (con respecto al buffer B utilizado en el punto 1) y clarificar por centrifugación 10 min. a 8000 rpm. GUARDAR EL SOBRENADANTE. 6.- En un tubo Beckman ultra claro de 35 ml 25x89mm (ubicado en el cajón #10), agregar 8 ml del buffer D y 25 ml del sobrenadante y centrifugar por 90 min. a 100 000 g ( 27000 rpm usando el rotor SW 28 ) a 4°C. (pesar las fundas del rotor SW28 y equilibrarlas con el peso del tubo con el buffer D y sobrenadante igualando sus pesos). Resuspender las pastillas en aproximadamente 1/5 del volumen anterior ____ ml de buffer A (dependerá de la cantidad de tubos que uno guste procesar) y pasarla a tubos eppendorf para centrifugar a 12 000 rpm por 10 min a 4°C.

7.- En otro tubo Beckman ultra claro (ubicado en el cajon #10) de 5.0 ml (13x51mm) agregar el gradiente de densidad de sacarosa del 10- 40% (buffer E) y posteriormente el sobrenadante, Centrifugar por dos horas a 100 000 g. ( 27000 rpm usando el rotor SW55Ti )

8,- Fraccionar la columna centrifugada tomando muestras desde la parte superior hasta la inferior de 500 µl en cada fracción y colectar la fracción de alta abs leídas a longitud de onda de 254 nm. 9.- Dializar la fracción que contiene al virus toda la noche contra diversos cambios de buffer A o simplemente diluir la fracción y centrifugar a alta velocidad para concentrar el virus.