Aislamiento De Bcmnv

Norma Flores Estévez Teis Doctoral, 2002

Protocolo de aislamiento de BCMNV

Procedimiento Extracción cruda: Colectar tejido de hoja (se recomiendan 200g)        ___________ g Moler tejido en vaso de licuadora enfriado con: 2X vol:buffer fosfato de potasio 0.5M Ph 7.5 0.2M de sulfito de sodio  200mM de DIECA

Moler en velocidad alta durante 1 minutos Agregar 1 vol/peso de CC14  Agregar 0.8 vol/peso de CHC13 Moler en velocidad alta durante 1 minutos Centrifugar  en botellas GSA a 3500 rpm durante 5 min. Guardar sobrenadante y filtrar a través de fibra de vidrio Agregar: 6%  (wt/vol) PEG 8000 0.25 M de NaCl

___________ ___________ ___________

___________ ___________

––––––––– _________

Agitar a 4 oC durante 2 horas. Transferir a botellas GSA, centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. GUARDAR PASTILLAS Resuspenderlas bien con fosfato de potasio0.5M, pH7.5 en 1/4 del  volumen original  Centrifugar en rotor  GSA durante 10 min a 8000 rpm. GUARDAR SOBRENADANTES, medir volumen. _________  Agregar lo siguiente: 8% (wt/vol) PEG 8000

___________ 

0.1 M NaCl 

___________

Agitar a 4 oC durante 1 horas.

Centrifugar en rotor GSA durante 10 minutos a 8000 rpm

Norma Flores Estévez Teis Doctoral, 2002

GUARDAR PASTILLAS Resuspender pastillas en 6 ml. De HEPES 20 mM (pH7.5)

Purificación del virus en gradiente de CsCl: Preparar solución con CsCl con lo siguiente: 11.6 g CsCl 27.0 mls de HEPES (pH7.5) Agregar a tubos SW 50.1 lo siguiente: 3.5 ml de solución  CsCl Agregar solución viral en la superficie de la solución CsCl Centrifugar a 36 000 rpm durante 18 horas a 4oC. Aislamiento del virus del gradiente de CsCl: La banda viral debe de mostrarse a 1 cm de la base del tubo. Colectar la banda con un aguja no. 18 y jeringa de 1 ml, evitando la  banda de "basura" arriba de la viral. Dializar la muestra en Hepes 2 Mm hasta el día siguiente  Cuantificación del virus: Volumen de solución viral:               ___________ mls Diluir 1:500 ó 1:100 en 500 µl de H2O Registrar absorbancia 260/280 de la dilución: Abs. 260 nm = ____________ Abs. 280 nm = ____________ 260/280 = ____________  (virus puro 260/280= 1.18). Para estimar la concentración de virus: Abs. 260 nm X Factor de dilución =      _______ mg/ml                      2.4 Rendimiento =     _________mg/  100g tejido