Norma Flores Estévez Tesis Doctoral, 2002
Protocolo de aislamiento de BCMV
Procedimiento Extracción cruda: Colectar tejido de hoja (se recomiendan 200g) 181.8g Moler tejido en vaso de licuadora enfriado con: 2X vol:buffer fosfato de potasio 0.5M Ph 7.5 363.6ml 0.2M de EDTA 2.125242g 0.1 % DE TGA ____________ Moler en velocidad alta durante 2 minutos aprox. Agregar 1 vol/peso de CC14 Agregar 0.8 vol/peso de CHC13 Moler en velocidad alta durante 1 minutos Centrifugar en botellas GSA a 3500 rpm durante 5 min. Guardar sobrenadante y filtrar a través de fibra de vidrio Agregar 1 % vol/vol Triton X 100 4% (wt/vol) PEG 8000 0.1 M de NaCl
___________ ___________
_________ ––––––––– _________
Agitar a 4 oC durante 2 horas. Transferir a botellas GSA, centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. GUARDAR PASTILLAS Resuspenderlas bien con 20 mM HEPES (pH7.5) en 1/4 del volumen original Centrifugar en rotor GSA durante 10 min a 8000 rpm. GUARDAR SOBRENADANTES, medir volumen. _________ Agregar lo siguiente: 8% (wt/vol) PEG 8000
___________
0.1 M NaCl Agitar a 4 oC durante 1 horas.
___________
Norma Flores Estévez Tesis Doctoral, 2002
Centrifugar en rotor GSA durante 10 minutos a 8000 rpm GUARDAR PASTILLAS Resuspender pastillas en 6 ml. De HEPES 20 mM (pH7.5)
Purificación del virus en gradiente de CsCl: Preparar solución con CsCl con lo siguiente: 11.6 g CsCl 27.0 mls de HEPES (pH7.5) Agregar a tubos SW 50.1 lo siguiente: 3.5 ml de solución CsCl Agregar solución viral en la superficie de la solución CsCl Centrifugar a 36 000 rpm durante 1012 horas a 4oC. Aislamiento del virus del gradiente de CsCl: La banda viral debe de mostrarse a 1 cm de la base del tubo. Colectar la banda con un aguja no. 18 y jeringa de 1 ml, evitando la banda de "basura" arriba de la viral. Dializar la muestra en Hepes 2 Mm hasta el día siguiente Cuantificación del virus: Volumen de solución viral: ___________ mls Diluir 1:500 ó 1:100 en 500 µl de H2O Registrar absorbancia 260/280 de la dilución:
Abs. 260 nm = ____________ Abs. 280 nm = ____________ 260/280 = ____________ (virus puro 260/280= 1.18). Para estimar la concentración de virus: Abs. 260 nm X Factor de dilución = _______ mg/ml 2.4 Rendimiento = _________mg/ 100g tejido
Norma Flores Estévez Tesis Doctoral, 2002