Aislamiento De Prsv

Adaptado por: Susana Ruiz Castro Gonsalves and Ishii, 1980

Protocolo de aislamiento de PRSV

Procedimiento (TODO EN FRIO 4  ˚C) Extracción cruda: Colectar tejido de hoja (se recomiendan 100g)       100 g Moler tejido en vaso de licuadora enfriado con: 2vol (w/v) de buffer fosfato de potasio 0.5M pH 7.5___200ml 0.01 M de EDTA  ___4 ml 0.1 % de sulfito de sodio ___0.2 gr Agregar 0.5 vol de tetracloruro de carbono  ___50 ml 0.5 vol de cloroformo ___50 ml Moler en velocidad alta durante 2 minutos Centrifugar  en botellas GSA a 8000 rpm durante 12 min. Guardar sobrenadante y filtrar a través de gasa esteril Agregar 8 % (w/v) PEG 8000

___32 gr___

Agitar a 4 oC durante 2 horas. Transferir a botellas GSA, centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. GUARDAR PASTILLAS Resuspenderlas en 1/5 del volumen original con buffer PE   40 mls PE (0.1 M fosfato de potasio pH 7.5 y 0.01M de EDTA)  Centrifugar en rotor  SS34 durante 10 min a 8000 rpm. GUARDAR SOBRENADANTES, medir volumen___(40 mls aprox)  Agregar lo siguiente: 5% (w/v) PEG 8000 NaCl 0.3 M      Agitar a 4 oC durante 1 hora.

__2 grs______  ___4 mls____ 

Centrifugar en rotor SS34 durante 10 minutos a 8000 rpm GUARDAR PASTILLAS Resuspender pastillas en 1/50 del volumen original con buffer PE ­­­ 4 mls Agregar a la solución viral 0.15gr deCsS04 por mililitro  Purificación del virus en gradiente de CsSo4: Preparar solución con CsSo4 con lo siguiente: 5.3g de CsSo4 (es un gradiente de 53% de CsSo4) 10 mls de buffer PE Agregar a tubos SW 50.1 lo siguiente: 3.5 ml de solución CsSo4 Agregar 1.5 ml solución viral en la superficie de la solución CsSo4 Centrifugar a 30 000 rpm durante 20 a 6oC. Aislamiento del virus del gradiente de CsSo4: La banda viral debe de mostrarse a 1 cm de la base del tubo. Colectar la banda con un aguja no. 18 y jeringa de 1 ml, evitando la  banda de "basura" arriba de la viral. Dializar la muestra en buffer PE 0.01M y 0.01 M EDTA (Toda la noche con agitación) Cuantificación del virus: Volumen de solución viral:               ___________ mls Diluir 1:500 ó 1:100 en 500 µl de H2O Registrar absorbancia 260/280 de la dilución:

Adaptado por: Susana Ruiz Castro Gonsalves and Ishii, 1980

Abs. 260 nm = ____________ Abs. 280 nm = ____________ 260/280 = ____________  (virus puro 260/280= 1.18). Para estimar la concentración de virus: Abs. 260 nm X Factor de dilución =      _______ mg/ml                      2.4 Rendimiento =     _________mg/  100g tejido