Aislamiento Papmv

Adaptado por:  Susana Ruiz y Anneke Brower Por: Erickson y Bancroft, 1978

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Purificación de PapMV 1.­ Tomar 100g de tejido infectado. 2.­ Poner en una licuadora el material biológico y las siguientes soluciones 2 volúmenes (w/v) de buffer de fosfato de sodio  0.05 M Ph 8______ y EDTA  0.001M________. 3.­ Agregar medio volumen de la cantidad que se agrego de Fosfato de sodio, de butanol_______ y  medio volumen de  cloroformo________. 4.­ Para clarificar agregar 500µl de Triton ­ X100. 5.­ Licuar en el cuarto frió a velocidad alta 2 minutos. 6.­Poner la solución resultante (licuado) en dos botellas de centrifuga estériles de 250 ml. 7.­ Colocar las botellas en hielo y equilibrarlas (con balanza). 8.­Centrifugar en rotor GSA a 10 000 rpm durante 12 minutos a 4 °C. 9.­Decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados estéril previamente enfriado en hielo. 10.­Colocar este sobrenadante en tubos de plástico (de aprox. 40 ml)  y centrifugar en rotor SS­34 a 17 000 rpm por 30  minutos a 4 °C. 11.­Decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados estéril previamente enfriado 12.­ colocar 26 ml de este sobrenadante en un colchón de sacarosa 30% + EDTA 5mM  (sin romper el gradiente de sacarosa) en varios tubo (6) ultra claros Beckman de 25X89 mm, como se indica en la fig.

sol. viral 26ml sol. viral

sacarosa

7ml sacarosa 30% + EDTA 5mM pH 8

13.­ centrifugar los tubos en rotor SW­28 a 27,000 rpm a 15 °C por 3.5 horas. 14.­ desechar el sobrenadante y quedarse con la pastilla 15.­  resuspender la pastilla en 2ml de Tris 0.005M pH 8 (queda una sol. viscosa) 16.­ dializar toda la noche esta solución en 1.8 litros de buffer de fosfato de sodio 0.001M  pH 8 + EDTA 0.001M pH 8. 17.­ recuperar la sol. dializada y guardarla a ­20°C en tubos ependorf.