954_penuntun Praktikum Pbf.docx

PENUNTUN PRAKTIKUM PENGUJIAN BAHAN FARMASI

Tim Penyusun:

Arsyik Ibrahim, S.Si., M.Si., Apt M. Arifudin, S.Si., M.Si., Apt. Viriyanata Wijaya, S.Farm., M.Farm., Apt. Akhmad Jaizzur Rijai, S.Farm., M.Si., Apt

PROGRAM STUDI SARJANA (S1) FARMASI LABORATORIUM KIMIA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MULAWARMAN 2019 KATA PENGANTAR Buku penuntun ini disusun agar para praktikan dapat lebih memahami maksud serta cara-cara praktikum yang akan dilakukan, maka setiap praktikan sebelum acara praktikum dimulai harus mengikuti membaca penuntun ini. Praktikum Pengujian Bahan Farmasi pada Program Studi strata satu (S1) Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman, diberikan dalam 1 mata kuliah yang terintegrasi dengan mata kuliah teori 2 sks yang disajikan pada semester genap setiap semester. Praktikum

Pengujian

Bahan

Farmasi

dimaksudkan

memberikan

mahasiswa suatu keterampilan tentang dasar-dasar yang diperlukan untuk mengetahui dan memahami pengujian bioaktivitas ekstrak dari bahan alam hayati serta cara menganalisis hasil praktikum dan menarik kesimpulan dari pengujian tersebut. Praktikum ini diharapkan dapat menjadi modal dasar pengetahuan bagi mahasiswa dalam rangka persiapan pemilihan judul penelitian khususnya kepada mereka yang memiliki keinginan penelitian di bidang pengujian bioaktivitas bahan farmasi.

Samarinda, Februari 2019

Penyusun

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

2

DAFTAR ISI

i SAMPUL.....................................................................................................................

KATA

ii

PENGANTAR...................................................................................................... iii

DAFTAR ISI.................................................................................................................. I.

PENGUJIAN TOKSISITAS EKSTRAK BAHAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY

II.

TEST.....................................................................................................................……... 1 PENGUJIAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK BAHAN ALAM METODE SPEKTROFOTOMETRI…………………………………………………………..…………………………………...

III.

PENGUJIAN ANTIMITOSIS EKSTRAK BAHAN ALAM TERHADAP PEMBELAHAN SEL 6 TELUR BABI ………

IV. PENGUJIAN AKTIVITAS IMUNOGLOBULIN M (IgM) EKSTRAK BAHAN ALAM (UJI MITOSIS SEL) V.

………….. 10 UJI BIOAKTIVITAS ANTIMIKROBA EKSTRAK BAHAN ALAM DENGAN METODE SKRINING

DAN

KROMATOGRAFI

LAPIS

TIPIS

(KLT)

BIOAUTOGRAFI............................................................................................................... 14 VI. PENGUJIAN AKTIVITAS MUCOLITIK EKSTRAK BAHAN ALAM MENGGUNAKAN MUCUS USUS SAPI....................................................................................................................... LAMPIRAN..............................................................................................................................

19

24

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

3

28

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

4

PRAKTIKUM I PENGUJIAN TOKSISITAS EKSTRAK BAHAN ALAM METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST (BSLT)

A. TEORI UMUM Uji toksisitas sebagai skrining awal dapat dilakukan dengan berbagai metode antara lain adalah metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Metode BSLT adalah suatu metode uji guna menentukan toksisitas suatu senyawa bahan alam dengan cepat, murah dan cukup akurat untuk penapisan ekstrak bahan aktif dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach. yang berumur 48 jam. Metode BSLT juga digunakan untuk mendeteksi kebeadaan senyawa toksik dalam proses isolasi senyawa dari bahan alam yang berefek sitotoksik dengan menentukan harga LC50 dari senyawa aktif. Metode BSLT dapat digunakan untuk berbagai sistem uji seperti: uji pestisida, mikotoksin, polutan, anastetik, komponen seperti morfin, karsinogenik dan ketoksikan dari hewan dan tumbuhan laut serta senyawa beracun dari tumbuhan darat. Metode ini kemudian berkembang menjadi salah satu skrining awal metode bioassay dalam rangka mencari dan mengisolasi senyawa aktif termasuk antikanker yang terdapat dalam suatu ekstrak tanaman atau hewan. Pembuktian kebenaran metode ini adalah telah dilakukannya uji BSLT dari beberapa obat antikanker yang sudah digunakan secara klinik seperti podofilotoksin (Mayer, 1982) dan adriamisin (Gu, 1995), (Carballo,2002) juga melaporkan bahwa terdapat korelasi yang baik antara metode BSLT dengan uji sitotoksik menggunkan kultur sel kanker. B. TUJUAN PERCOBAAN Untuk menentukan Median Lethal Concentration (LC50) dari ekstrak bahan alam terhadap larva dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) terhadap larva udang (Artemia Salina Leach). C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN Percobaan ini merupakan percobaan pendahuluan dalam rangka menemukan senyawa sitotoksik yang diharapkan dalam perkembangan selanjutnya dapat digunakan sebagai obat antikanker. D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan, Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

5

pemapaaran bahan kimia terhadap organisme tingkat rendah seperti bakteri dan kultur sel-sel dan mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia. Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat dilakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan suatu cara yang cepat dan murah untuk uji aktivitas farmakologi dan ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia Salina Leach. Uji aktivitas BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) berhubungan dengan materi kuliah pengujian bahan farmasi dengan menggunakan teknologi bahan alam yang memberi pengetahuan tentang bahan alam sebagai bahan baku obat (metabolit primer dan metabolit sekunder) dan kontrol kualitas bahan alam. E. METODE PRAKTIKUM 1. Alat dan Bahan Alat-Alat yang digunakan : Aerator, Erlenmeyer, Gelas ukur, Keranjang, Mikro pipet 1, 10, 50, 100, 1000 µl, Pipet tetes, Seperangkat alat penetas larva : (Toples, Plastik, karet, selang plastik), Timbangan analitik, Seperangkat alat penerangan : lampu 40 atau 60 watt, Statif, dan Vial/flakon Bahan – bahan yang digunakan : Air laut, Aquadest, Larva udang (Artemia salina Leach), Makanan ikan atau ragi Saccharomices cereviceae, Pelarut organik : etanol 98 %, Sampel uji : obat / ekstrak 2. Prosedur Kerja a. Penyiapan Larva Udang Telur udang (Artemia salina Leach) sebanyak 0,5 atau 1 gram direndam dalam wadah penetasan yang berisi air laut 1 liter pada kondisi pH 78 dibawah cahaya lampu pijar 40 atau 60 watt pada suhu kamar (25 oC), yang dilengkapi dengan aerator (jarak sinar lampu dengan wadah penetasan ± 20 cm). Telur akan menetas selama 24 jam menjadi larva. Setelah larva berumur 48 jam larva udang siap diujikan. b. Pembuatan Konsentrasi Sampel 1) Sampel Uji Ekstrak a) Ekstrak ditimbang sebanyak 50 mg. Kemudian dilarutkan dalam pelarut organik yang sesuai sebanyak 10 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 5 mg/ml sebagai larutan stok. b) Stok dipipet masing-masing 1 µl, 10 µl, 100 µl dan 1000 µl dengan mikro pipet, dimasukkan ke dalam vial-vial. Masing-masing konsentrasi dibuat 5 replikasi.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

6

c) Dibuat satu kontrol negatif untuk semua konsentrasi uji dengan konsentrasi 1000 µg/ml (v/v) menggunakan pelarut organik yang digunakan. d) Larutan sampel uji dan kontrol kemudian diuapkan hingga pelarut menguap sempurna pada suhu kamar (pelarut dikatakan telah menguap sempurna jika tidak berbau pelarut lagi). e) Kemudian ditambahkan air laut sebanyak 5 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml. c. Sampel Obat Sampel obat yang ditimbang adalah dosis maksimumnya, kemudian dilarutkan dengan pelarut yang sesuai (yang dapat melarutkan sampel uji). Dibuat pula kontrol negatif. Konsentrasi sampel uji dan kontrol, pembuatan dan perlakuannya seperti cara pembuatan dan perlakuan sampel uji ekstrak (no. 1 di atas). d. Pengujian Aktivitas a) Larva udang (Artemia salina Leach) sebanyak 10 ekor dimasukkan ke dalam masing-masing vial yang berisi ekstrak/sampel obat uji. b) Ke dalam vial-vial tersebut dimasukkan 1 tetes makanan ikan/ragi sebanyak 3 mg/5 ml air laut sebagai pakan. c) Vial-vial uji kemudian disimpan di tempat yang cukup mendapat sinar lampu. d) Setelah 24 jam diamati jumlah larva yang mati pada masing-masing vial. e) Catat jumlah larva yang mati. f) Hitung LC50 dengan menggunakan Analisa Probit atau Analisis ReedMuench 3.

TABEL PENGAMATAN a) Analisis Probit Jumlah mati pada konsentrasi sampel (ppm) Replikasi Sampel a µg/ml b µg/ml c µg/ml d µg/ml 1 2 3 Total penghambatan % penghambatan Harga Probit Log Konsentrasi (X) m µg/ml n µg/ml

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

Harga Probit (Y) Q R 7

o µg/ml p µg/ml

S T

b) Analisis Reed-Muench Konsent rasi (%)

Log Konsentrasi (%)

KE1 KE2 KE3 KE4 KE5

Jumlah

Terakumulasi

Mat i

Hidu p

Mati (x)

F

K

F

G H I

L M N

J

O

f+g f+g+h f+g+h+i f+g+h+i+ j

Hidup (y)

Rasio mati : total Terakumulas i x:(x+y)

Mortalita s (%) Rasio x 100

k+l+m+n+ o l+m+n+o m+n+o n+o O

Untuk mendapatkan nilai LC50 dan LC90, analisis data menggunakan rumus: ℎ=

50%− 𝛼 𝑏− 𝛼

dan

ℎ=

90%− 𝛼 𝑏− 𝛼

𝑖 = 𝑙𝑜𝑔

𝑘 𝑠

g= hxI y = g + log s

LC50 dan LC90 = log y Keterangan : h = Jarak proporsi i = Logaritma pertambahan konsentrasi a = Presentase kematian lebih kecil dari 90% b = Presentase kematian lebih besar dari 90% k = Konsentrasi yang lebih besar dari 90% kematian s = konsentrasi yang lebih kecil dari 90% kematian g = Hasil kali jarak proporsi dengan logaritma pertambahan dosis y = Persamaan

4. SOAL-SOAL a. Soal Pre-test 1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja? 2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam praktikum? b.

Soal Post-test

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

8

1. Uraikan cara kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas BSLT? 2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari air laut, aquadest, larva udang, dan ragi yang diberikan? 3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan: a. Perlunya penyiapan larva udang b. Dilakukan pembuatan konsentrasi sampel c. Dilakukannya pengujian aktivitas 4. Hitunglah LC50 dari masing-masing konsentrasi yang diujikan dengan analisis probit dan Reed and Muench? 5. Apa perbedaan dari analisis probit dan analisis Reed and Muench dalam menghasilkan data pengujian berupa LC50? 6. Jelaskan mengapa perbedaan tersebut terjadi pada hasil analisis dalam data pengujian yang sama? 7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

9

PRAKTIKUM II PENGUJIAN ANTIOKSIDAN EKSTRAK BAHAN ALAM METODE SPEKTROFOTOMETRI A. TEORI UMUM Perubahan pola konsumsi makanan sebagai dampak dari kemajuan sains dan teknologi menyebabkan semakin meningkatnya masyarakat yang menderita penyakit degeneratif seperti liver, hepatitis, jantung koroner, hipertensi, kanker, diabetes dan aterosklerosis. Pada dasarnya penyakit degeneratif tersebut diakibatkan karena proses metabolisme tubuh yang menghasilkan radikal bebas berlebihan sehingga mengakibatkan kerusakan pada fungsi sel-sel tubuh (Helliwel dan Gutteridge, 1989). Senyawa radikal bebas tersebut timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernapas, metabolisme sel, olahraga yang berlebihan, peradangan atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan seperti asap kendaraan bermotor, asap rokok, bahan pencemar, dan radiasi matahari. Makanan tertentu seperti makanan cepat saji (fastfood), makanan kemasan, makanan kalengan juga berpotensi meninggalkan racun dalam tubuh karena kandungan lemak, pengawet serta sumber radikal bebas. Tubuh memerlukan antioksidan yang dapat membantu melindungi tubuh dari serangan radikal bebas dengan meredam dampak negatif senyawa ini (Indrayana, 2008). Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam (Ilham dan Sunardi). B. TUJUAN PERCOBAAN Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak bahan alam terhadap uji perendaman radikal DPPH (2,2-Diphenyl-1-Picrylhidrazyl) berdasarkan nilai IC50. C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN Percobaan ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak bahan alam secara cepat, mudah, dan sensitif dengan

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

10

menghitung nilai IC50 dalam rangka pengembangan selanjutnya dibuat menjadi produk-produk farmasi. D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI Percobaan ini berhubungan dengan pengujian bahan farmasi terutama dalam bidang kimia farmasi. Percobaan ini menggunakan instrumen farmasi untuk pengujian aktivitas antioksidan. Instrumen farmasi yang digunakan dapat menentukan panjang gelombang maksimum suatu senyawa dan penetapan absorbansi senyawa. E. METODE PRAKTIKUM 1. ALAT DAN BAHAN Alat –alat yang dibutuhkan : wadah kaca (toples kaca, timbangan analitik, gelas kimia, labu takar, pipet mikro, pipet volume, pipet tentukur (gondok) dan lain-lain. Bahan – bahan yang dibutuhkan : ekstrak bahan alam, aquadest, methanol, Vitamin C, Tissue, Kertas label dan lain-lain. 2. PROSEDUR KERJA a) Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak 1) Pembuatan larutan induk Kristal DPPH ditimbang sebanyak 4 mg untuk dilarutkan dalam 100 mL metanol didalam labu ukur gelap atau labu ukur cokelat, diperoleh larutan DPPH konsentrasi 0,004 % atau 40 ppm (part per million) yang digunakan pada pengujian. Larutan disimpan pada tempat tertutup rapat dan terlindung dari cahaya. 2) Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH Dipipet sebanyak 2 mL larutan DPPH 0,004 % dan ditambahkan dengan 2 mL metanol. Setelah dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap serapan larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515 - 520 nm untuk mendapatkan panjang gelombang maksimum. 3) Pembuatan seri konsentrasi ekstrak, dan kontrol positif Dibuat larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm (10 mg ekstrak kering dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL). Selanjutnya dibuat derek konsentrasi uji dengan teknik pengenceran (misalnya 20, 30, 40, 50 dan 60 ppm dst). Masing-masing konsentrasi dilakukan 3 (kali) ulangan pengukuran. Disiapkan larutan kontrol negatif yaitu larutan DPPH dan metanol (tanpa penambahan ekstrak) dan larutan kontrol positif vitamin C dengan 5 (lima) seri konsentrasi, yaitu 1,2; 1,6; 2; 2,4 dan 2,8 ppm. 4) Uji antioksidan 1. Disiapkan larutan sampel uji, dan larutan kontrol 2. Dipipet 2 mL dari masing-masing larutan uji, ditambah 2 mL larutan DPPH 40 ppm. Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

11

3. Campuran tersebut dihomogenkan dan dibiarkan pada suhu kamar di tempat gelap selama 30 menit 4. Dilakukan pengukuran absorbansi masing-masing konsentrasi sampel uji pada panjang gelombang maksimum. 5. Dihitung persen (%) inhibisi (peredaman) menggunakan rumus : %

Aktivitas

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 – 𝐴𝑏𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

Antioksidan

=

x 100%

6. Hitung nilai konsentrasi penghambatan sampel uji (IC50) 3. TABEL PENGAMATAN Nilai antioksidan dianalisis dengan regresi linear. Tabel Penentuan Nilai IC50 sebagai berikut : Tabel Penentuan Nilai IC50 Absorbansi Sampel Konsentrasi Persamaan Regresi % AA (y) Ekstrak (x) 1 Linier 2 3 Rata-rata K1 K2 K3 y = bx + a K4 K5 Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis metode regresi dengan menghubungkan konsentrasi ekstrak (x) terhadap % aktivitas antioksidan (y), maka didapat nilai intersep (a) dan slop (b), serta resultan (r). Kemudian nilai a dan b tersebut dimasukkan ke dalam persamaan garis regresi linier berikut : y = bx + a Nilai IC50 dapat diperoleh dengan memasukkan nilai y = 50 ke dalam persamaan di atas dan nilai x dinyatakan sebagai nilai IC50 ekstrak. 4) SOAL-SOAL a. Soal Pre-test 1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja? 2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam praktikum? b. Soal Post-test 1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas antioksidan menggunakan spektrofotometri.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

12

2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari DPPH, metanol, aquades, dan vitamin C. 3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan: a. Pembuatan larutan induk b. Penentuan panjang gelombang maksimum c. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak dan kontrol positif d. Pengujian aktivitas antioksidan 4. Hitunglah IC50 dari masing-masing konsentrasi yang diperoleh dari ekstrak dan kontrol positif. 5. Jelaskan fungsi dari nilai IC50 yang diperoleh dan hubungannya dengan kekuatan aktivitas antioksidan! 6. Jelaskan mengapa digunakan metode analisis regresi linear dalam menentukan IC50! 7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan tujuan percobaan!

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

13

PRAKTIKUM III PENGUJIAN ANTIMITOSIS EKSTRAK BAHAN ALAM TERHADAP AKTIVITAS PEMBELAHAN SEL TELUR BULU BABI

A. TEORI UMUM Bioassay merupakan metode pengujian aktivitas suatu senyawa dari bahan alam maupun sintetik menggunakan mahluk hidup. Bioassay terdiri dari banyak metode diataranya yaitu uji toksisitas, uji antimitotik, uji daya hambat, dll. Berdasarkan hasil bioassay tersebut dapat dilakukan isolasi senyawa alam atau disebut Bioassay Guided Isolation), (Mayer, B.N, 1982) Antimitosis disebut juga inhibitor mitotik atau antimikrotubular merupakan senyawa obat yang menghambat pertumbuhan sel dengan cara menghentikan pembelahan sel. Banyak bahan obat antikanker yang telah diisolasi dari sumber alamiah, khususnya dari mikroorganisme dan tumbuhan. Zat antimitosis ini bekerja dengan menghambat pembelahan sel pada metaphase (tingkat kedua dari mitosis), jadi merintangi pembelahan inti dengan mencegah masuknya belahan kromosom ke dalam anak inti. Inhibitor mitotik, aktivitasnya terutama disebabkan karena efeknya terhadap protein mikrotubular sehingga terjadi penghentian metaphase dan inhibisi mitosis, (Sudoyo A.W., 2006). Beberapa antimitosis yang secara klinis merupakan obat antikanker penting termasuk alkaloid Vinca (vinblastin, vinkristin, dan vinorelbin) yang diperoleh dari Vinca rosea, Podofilin (serta derivatnya etoposida dan tenoposida) yang diperoleh dari tanaman Podophyllum pellatum dan obat dari kelompok taxaoida (peclitaxel dan docetaxel), yang diperoleh dari kulit pohon cemara Taxus brevifolia (Tjay, HT, 2002). B. TUJUAN PERCOBAAN Untuk mengetahui aktivitas antimitosis dari sampel uji terhadap pembelahan sel pada proses pembuahan C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN Percobaan ini dilakukan untuk memperoleh data aktivitas antimitosis sampel uji yang menunjukkan kemampuan sitotoksik sebagai dasar untuk menunjang pengembangan penelitian pemanfaatan bahan alam yang berpotensi dalam bidang farmakologi dan mikrobiologi khususnya sebagai antikanker. D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

14

Uji aktivitas antimitosis berhubungan dengan materi kuliah pengujian bahan farmasi khususnya di bidang farmakologi dan mikrobiologi yang akan memberi pengetahuan tentang bahan alam sebagai bahan baku obat (metabolit primer dan metabolit sekunder) dan aktivitas bahan baku sebagai sitotoksik yang menjadi awal penelitian antikanker. E. METODE PRAKTIKUM 1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM Alat-alat yang dibutuhkan : aerator, aquarium, seperangkat alat ekstraksi, batang pengaduk, corong pisah, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, magnetik stirrer, mikroskop kamera, objek glass, sentrifuge, vortex mixer, mikropipet, oven, timbangan analitik, tabung eppendorf, vial. Bahan-bahan yang dibutuhkan : Ekstrak bahan alam, Aqua destilata, Air laut bebas protozoa, beberapa pelarut organik (metanol, heksan, etil asetat), DMSO (dimetil sulfoksida), baku antikanker (vinkristin). 2. PROSEDUR KERJA 1. Penyiapan sampel dan Pengolahan sampel Sampel berupa ekstrak kasar atau fraksi ekstrak dari tumbuhan disiapkan, selanjutnya dibuat deretan konsentrasi uji menggunakan pelarut aguadest (jika larut) atau dimetil sulfoksida (DMSO). 2. Uji Aktivitas dengan Metode Uji Antimitosis Sel Telur Bulu babi a) Penyiapan Sel Telur dan Sperma Bulu babi Bulu babi jantan dan betina diinduksi dengan menyuntikkan 1 ml KCL 10% ke dalam bagian gonad. Sperma yang berwarna putih susu dan sel telur yang berwarna kuning keemasan masing-masing ditampung pada gelas kimia yang berbeda (dapat dimasukkan dalam lemari pendingin bila tidak langsung digunakan). Fertilisasi dilakukan dengan cara 1 ml sperma dan 4 ml sel telur difertilkan dalam gelas kimia yang berisi 50 ml air laut bebas protozoa selama 30 menit. b) Pelaksanaan Uji 1. Ditimbang ekstrak uji sebanyak 5 mg, ditambahkan 20 µL dimethyl sulfoksida, kemudian dicukupkan dengan air laut hingga 5 mL dan diperoleh konsentrasi 1 mg/mL sebagai stok. 2. Dari larutan stok ini dipipet masing-masing : 1 µL, 10 µL, dan 100 µL ke 3. Dalam tabung eppendorf yang masing-masing telah berisi 899 µL, 890 µL, dan 800 µL air laut bebas protozoa. 4. Masing- masing tabung pada no. 2 di atas ditambahkan zygot sebanyak 100 µL yang diperoleh setelah 30 menit terjadi fertilisasi dan diperoleh konsentrasi 1, 10, dan 100 µg/mL. Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

15

5. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali tiap sampel uji dan kontrol. 6. Campuran sampel uji didiamkan selama 2 -3 jam, selanjutnya diambil sedikit dan diletakkan di atas objek glass dan ditutup cover glass dan diamati dengan mikroskop sesuai pembesaran yang diinginkan 7. Kontrol negatif menggunakan 1000 µL air laut, dan DMSO dengan konsentrasi 10 µL/mL air laut. 8. Kontrol positif menggunakan bahan baku obat antikanker dengan konsentrasi 0,01 µg/mL, 0,1 µg/mL dan 1 µg/ml yang dilarutkan menggunakan Aquadest. 9. Dihitung prosentase jumlah sel yang mengalami penghambatan pembelahan dari masing-masing konsentrasi uji, dengan rumus (lihat lampiran ) 10. Dihitung nilai probit (y) sebenarnya dari masing-masing konsentrasi uji menggunakan Rumus (lihat lampiran) 11. Dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear 3. TABEL PENGAMATAN Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dihitung Inhibit concentration (IC) 50 %, dan diolah menggunakan analisis probit. Jumlah Log. Nilai Kont. Sel Tidak Total Prosentase Konst Probit a b Uji Membela Sel (%) (x) (y) h a ppm

1

x ppm ke n

N

4. SOAL-SOAL a. Soal Pre-test 1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja? 2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam praktikum? b. Soal Post-test 1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas antimitosis? 2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari air laut bebas protozoa, aquades, DMSO dan KCl 10%? 3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan: a. Pembuatan seri konsentrasi pada sampel b. Penyiapan sel telur dan sel sperma dari bulu babi Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

16

4. 5. 6. 7.

c. Dilakukannya pengujian aktivitas antimitosis Hitunglah IC50 dari masing-masing konsentrasi yang diujikan dengan analisis probit? Jelaskan mengapa digunakan analisis probit dalam menentukan IC50? Jelaskan fungsi dan arti dari nilai IC50 dandalam hasil pengujian aktivitas antimitosis? Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

17

PRAKTIKUM IV PENGUJIAN AKTIVITAS IMUNOGLOBIN M (IgM) EKSTRAK BAHAN ALAM A. TEORI UMUM Imunoglobulin adalah glikoprotein yang diproduksi oleh sel plasma (sel B) yang dihasilkan dalam bentuk fraksi globulin y pada serum, yang mampu menetralkan sejumlah mikroorganisme penyebab infeksi. Molekul ini dibentuk oleh sel B dalam 2 bentuk yang berbeda yaitu sebagai reseptor permukaan untuk antigen dan sebagai statisti yang disekresikan ke dalam cairan ekstraseluler. Antibodi yang disekresikan dapat berfungsi sebagai adaptor yang mengikat antigen melalui binding site-nya yang spesifik sekaligus merupakan jembatan yang menghubungkan antigen dengan sel-sel sistem imun atau mengaktivasi komplemen. Antibodi yang terbentuk sebagai reaksi terhadap salah satu jenis antigen mempunyai susunan asam amino yang berbeda dengan statisti yang dibentuk terhadap antigen lain dan masing-masing hanya terikat pada statisti yang relevan. Klasifikasi immunoglobulin dalam serum manusia terdiri atas 5 kelas utama yaitu IgG, IgM, IgA, IgD dan IgE. IgG adalah immunoglobulin mayor, hal ini ditunjukkan dengan jumlahnya yang lebih besar dan tersusun dari gobulin Y. IgG adalah satu – satunya immunoglobulin yang dapat melewati plasenta. IgM adalah sebuah statisti yang memiliki berat molekul terbesar dibandingkan kelas imunoglobulin yang lain. IgM merupakan tipe immunoglobulin yang paling banyak dan seringkali tidak eksklusif, disekresi selama respon primer statisti. IgA adalah immunoglobulin yang banyak ditemukan dalam cairan sekret statisti itu sering disebut immunoglobulin sekretoris. IgD adalah immunoglobulin dengan kadar yang rendah dalam sirkulasi. Peran bologiknya sebagai statisti dalam reaksi hipersensitifitas terhadap penisilin. IgE ditemukan dalam serum dengan kadar yang rendah dan mengikat pada penyakit alergi asma. IgE merupakan immunoglobulin dengan jumlah yang paling sedikit dalam serum tetapi efeknya sangat efisien. B. TUJUAN PERCOBAAN Untuk memperoleh data aktivitas immunoglobulin M (IgM) sampel uji dengan mengamati pengenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah domba. C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN Dapat menjadi acuan bagi farmasi veteriner dalam menciptakan suatu produk obat imunostimulan dari suatu ekstrak bahan alam. Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

18

D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI Percobaan ini berhubungan dengan pengujian bahan farmasi terutama pemanfaatan bahan alam yang menggunakan teknologi bahan alam dan penggunaan hewan coba sebagai obyek. E. METODE PRAKTIKUM 1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM Alat-alat yang dibutuhkan : Seperangkat alat ekstraksi, gelas kimia, gelas ukur, labu tentukur, needle, spoit injeksi, pengaduk elektrik, sumur mikrotitrasi (Wheel plate 96 lubang), Sentrifuga, Timbangan analitik, timbangan gram O’haus, Timbangan hewan. Bahan-bahan yang dibutuhkan : Air suling, pelarut statisti, betadin, ekstrak sampel uji, kapas, Larutan koloidal Na.CMC 1%, hewan uji mencit jantan, Sel Darah Merah Domba (SDMD) 2%, v/v, larutan PBS (Phosphat Buffered Saline). 2. CARA KERJA 1. Disiapkan alat dan bahan praktikum 2. Dibua larutan koloidal Na. CMC 1 % 3. Dibuat larutan/ suspensi ekstrak uji dengan berbagai tingkat konsentrasi uji 4. Dibuat suspensi sel darah merah domba (SDMD) (lihat cara pembuatan) 5. Dibuat dapar Phosfat (lihat cara pembuatan) 6. Disiapkan hewan uji 7. Perlakuan dan pengujian aktivitas immunoglobulin terhadap hewan uji 1. PENYIAPAN BAHAN PRAKTIKUM a. Pembuatan Larutan Koloidal NaCMC 1 % b/v Sebanyak 1 gram Na.CMC dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam wadah berisi 50 ml air suling panas (70oC) sambil diaduk dengan pengaduk elektrik hingga terbentuk larutan koloidal dan cukupkan volumenya hingga 100 ml dengan air suling. b. Penyiapan Suspensi Sel Darah Merah Domba (SDMD) 2 % v/v. 1) Ditampung darah domba dalam tabung bersih dan kering yang berisi serbuk EDTA sebagai antikoagulan. Untuk 1 ml darah domba, diperlukan 1 mg EDTA. 2) Dipisahkan SDMD dari plasmanya dengan cara disentrifuga 1500 rpm. 3) Selanjutnya SDM dicuci dengan menambahkan PBS (Phosphat Buffered Saline) dalam jumlah besar dan tabung berisi statisti tersebut dibolak balik beberapa kali dan disentrifuga kembali.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

19

4) Pencucian dilakukan paling sedikit 3 kali. Selanjutnya, PBS dibuang dan diperoleh SDMD 100%. Kemudian ke dalam SDMD 100% ditambahkan PBS dengan volume sama banyak, hingga diperoleh SDMD 50%. 5) Disiapkan antigen yang akan digunakan dengan mengencerkan 0,4 ml statisti SDMD 50% dengan 9,6 Ml PBS sehingga diperoleh 10 Ml statisti antigen (SDMD 2% v/v). c. Penyiapan Phosphat Buffered Saline (PBS) PBS disiapkan dengan terlebih dahulu membuat larutan A yaitu larutan NaH2PO4 1,38 g/L dan NaCl 8,3 g/L; dan larutan B yaitu larutan NaH2PO4 1,42 g/L dan NaCl 8,5 g/L. Selanjutnya 280 ml larutan A ditambahkan pada 720 ml larutan B untuk mendapatkan larutan PBS dengan Ph 7,2. d. Pemilihan Hewan Uji dan Penyiapan Hewan uji Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan (Mus musculus) yang sehat dan aktivitas normal, dengan bobot badan statis 25 – 30 gram. Selanjutnya disiapkan hewan uji sebanyak 12 ekor mencit yang dibagi atas 4 kelompok. Tiap kelompok masing – masing 3 ekor. 2. PERLAKUAN DAN PENGUJIAN AKTIVITAS IgM PADA HEWAN UJI a. Perlakuan pada hewan uji 1) Kelompok I (Kontrol ) Mencit uji diberi Na.CMC 1 % dengan volume 1 ml/gBB secara oral setiap hari selama 6 hari. Setelah 6 hari, mencit uji diimunisasi dengan SDMD 2% dengan volume 0,1 ml/ekor secara intraperitonial (ip). Selanjutnya pada hari ke 5 setelah imunisasi, darah mencit diambil secara intrakardial. 2) Kelompok II (Uji) Mencit uji diberi ekstrak sampel sesuai konsentrasi uji masingmasing kelompok uji dengan volume 1 ml/gBB secara oral setiap hari selama 6 hari . Setelah 6 hari, mencit uji diimunisasi dengan statisti SDMD 2% dengan volume 0,1 ml/ekor secara intraperitonial (ip). Selanjutnya pada hari ke 5 setelah imunisasi, darah mencit diambil secara intrakardial. b. Pengujian Aktivitas IgM pada Hewan uji 1) Pengambilan Sampel Darah Hewan Uji Pada hari ke -5 setelah imunisasi, darah diambil secara intrakardial, kemudian dibiarkan membeku/menggumpal pada suhu kamar sela 1 -2 jam, selanjutnya disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan diambil serumnya (supernatannya). 2) Uji Hemaglutinasi Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

20

Serum yang diperoleh selanjutnya diencerkan secara ‘double dilution’: 1/4 ; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512 dengan PBS sebanyak 50 µL untuk setiap sumur mikrotitrasi, selanjutnya pada setiap sumur ditambahkan 50 µL statisti SDMD 2% v/v, diaduk rata (digoyanggoyangkan) selama 5 menit. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit dan didiamkan semalam pada suhu kamar. Dilakukan pengamatan perngenceran tertinggi dari serum darah mencit yang masih dapat mengaglutinasi sel darah merah domba (SDMD). 3. TABEL PENGAMATAN Untuk menentukan peningkatan aktifitas imunoglobulin M (IgM), data diperoleh dari pembacaan titer antibodi pada reaksi hemaglutinasi dimana pengumpulan data dilakukan dengan cara mengukur konsentrasi antibodi dengan cara titrasi pengenceran bertingkat. Angka hasil pembacaan titer yang berupa deret ukur dimasukan ke dalam deret hitung dengan rumus [2 (log titer) + 1]. Tabel Titer Antibodi dari Serum Darah Tikus Putih. 1 No

2

log Pengenceran

2 Angk a Titer

2

log Pengenceran

3 Angka Titer

2

log Pengenceran

Angka Titer

𝜇

𝛴𝜇

I II Ke-n

Keterangan: 2 log Pengenceran Angka Titer

I sampai V µ Σµ

: Pengenceran bertingkat dari serum yang masih dapat beraglutinasi. : Ditentukan dari pengenceran tertinggi dari serum tikus putih yang masih dapat beraglutinasi dengan sel darah merah kambing. : Kelompok pelakuan. : Rata-rata angka titer. : Jumlah nilai dari angka titer.

4. SOAL-SOAL a. Soal Pre-test 1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja? 2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam praktikum? b. Soal Post-test 1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas immunoglobulin? Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

21

2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari larutan koloidal NaCMC 10%, sel darah merah domba (SDMD), dan Phospat Buffered Saline (PBS)? 3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan: a. Pembuatan larutan koloidal NaCMC 10% b. Penyiapan sel darah merah domba (SDMD) c. Penyiapan Phospat Buffered Saline (PBS) d. Penyiapan dan pemilihan hewan uji e. Perlakuan hewan uji (kontrol dan hewan uji) f. Pengujian aktivitas IgM pada hewan uji meliputi pengambilan sampel darah hewan uji dan uji hemaglutinasi 4. Hitunglah angka titer dari masing-masing kelompok perlakuan? 5. Jelaskan fungsi dari nilai angka titer dan hubungan angka titer dengan peningkatan aktivitas imunoglobulin? 6. Jelaskan mengapa digunakan titrasi pengenceran bertingkat dalam menentukan angka titer? 7. Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

22

PRAKTIKUM V UJI BIOAKTIVITAS ANTIMIKROBA EKSTRAK BAHAN ALAM DENGAN METODE SKRINING DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) BIOAUTOGRAFI

A. TEORI UMUM Antimikroba ialah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba yang merugikan manusia. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KBM. Saat ini penyakit infeksi masih menjadi masalah serius di Indonesia, ditambah lagi dengan semakin meluasnya resistensi mikroba terhadap obat-obatan antibiotika yang telah tersedia. Hal tersebut mendorong pentingnya penggalian sumber obat-obatan antimikroba lain dari bahan alam. Tanaman obat diketahui potensial untuk dikembangkan lebih lanjut pada pengobatan penyakit infeksi, namun masih banyak yang belum dibuktikan bioaktivitasnya secara ilmiah (Hertiani, 2003). B. TUJUAN PERCOBAAN Untuk memperoleh data aktivitas antimikroba sampel uji sebagai dasar untuk menunjang pengembangan penelitian pemanfaatan bahan alam khususnya di bidang mikrobiologi. C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN Dapat digunakan sebagai pengembangan ilmu mikrobiologi dan Kimia bahan alam. Sampel yang dipakai yaitu ekstrak bahan alam yang dapat diketahui bioaktivitasnya dengan menggunakan kombinasi teknik kromatografi dan difusi agar. D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI Percobaan ini berhubungan dengan pemanfaatan bahan alam dari tumbuhan sebagai obat, maka perlu dilakukan percobaan untuk menguji aktivitas antimikroba ekstrak bahan alam terhadap beberapa mikroba uji dengan metode Skrining dan KLT Bioautografi sebagai dasar pengembangan penelitian di bidang farmasi khususnya bidang Bahan Alam-Mikrobiologi.

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

23

E. METODE PRAKTIKUM 1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM Alat-alat yang dibutuhkan : autoklaf, batang pengaduk, cawan petri, chamber, corong pisah, enkas, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, inkubator, lampu spiritus, lampu UV 254 nm, dan 366 nm, mikropipet, oven, ose bulat, pinset, pipa kapiler, penangas air, spektofotometer UV, spoit, tabung reaksi, timbangan analitik, timbangan kasar dan vial. Bahan-bahan yang dibutuhkan : aqua destilata, alkohol 70%, beberapa biakan murni mikroorganisme (bakteri dan jamur), DMSO (dimetil sulfoksida), ketokenazol, kloramfenikol, lempeng TLC G60 F254, larutan NaCl fisiologis 0,9%, medium GNA (Glukosa Nutrien Agar), medium GNB (Glukosa Nutrient Broth), dan beberapa ekstrak sampel uji. 2. PROSEDUR PRAKTIKUM a. Penyiapan sampel dan pengolahan sampel Sampel berupa bagian dari tumbuhan/tanaman disiapkan, selanjutnya dibuat simplisia berupa potongan kecil, kemudian dikeringkan/diangin-anginkan. b. Ekstraksi dan partisi Simplisia berupa bagian tumbuhan/tanaman yang telah dikeringkan, ditimbang sebanyak yang diinginkan kemudian ekstraksi sesuai metode yang cocok dengan sampel uji. Ekstrak cair yang diperoleh diuapkan dengan cara diangin-anginkan hingga diperoleh ekstrak kental, selanjutnya ekstrak dapat dipartisi dengan menggunakan corong pisah. Ekstrak awal maupun ekstrak hasil partisi dapat digunakan sebagai sampel uji. c. Sterilisasi alat-alat Alat-alat yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu. Khusus alat-alat yang terbuat dari kaca dicuci dengan deterjen sintetik menggunakan air bersih kemudian dibilas dengan air suling. Alat-alat dikeringkan dengan posisi terbalik di udara terbuka. Selanjutnya dibungkus dengan kertas perkamen, lalu disterilkan dalam oven pada suhu 180⁰C selama 2 jam. Alatalat yang mempunyai skala dan alat-alat plastik disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121⁰C selama 15 menit. Ose dan pinset disterilkan dengan cara dipijarkan langsung pada lampu spiritus. d. Penyiapan mikroba uji 1) Peremajaan mikroba uji Bakteri/jamur diambil dari biakan murni masing-masing satu ose kemudian diinokulasikan pada medium NA untukmiring dengan cara digoreskan secara aseptis. Masing-masing biakan bakteri diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37⁰C sedangkan jamur diinkubasi selama 3 x 24 jam pada suhu kamar. 2) Pembuatan suspensi mikroba uji Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

24

Mikroba hasil peremajaan, disuspensikan dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% sampai diperoleh transmitan 25% untuk bakteri dan 75% untuk jamur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 580 nm sebagai blanko digunakan larutan NaCl fisiologis 0,9%. e. Pengujian skrining antimikroba 1) Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 10 mg. 2) Kemudian dimasukkan ke dalam vial steril dan dilarutkan dengan 200 µl (0,2 ml) DMSO dan 9,8 mL medium GNA, sehingga diperoleh konsentrasi 1 mg/ml, kemudian dihomogenkan. 3) Campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat. Setiap cawan petri dibagi tiga zona untuk masing-masing mikroba uji. 4) Setelah media memadat ditambahkan 20 µL suspensi mikroba uji, selanjutnya bakteri disebarkan menggunakan drigle sky secara merata. 5) Diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam untuk bakteri dan 27⁰C selama 72 jam untuk jamur. 6) Kemudian diamati pertumbuhan mikroba uji pada media. Ekstrak dikatakan aktif jika tidak adanya pertumbuhan mikroba uji pada permukaan medium. f. Pengujian Potensi Antimikroba Untuk pengujian potensi antimikroba, digunakan bakteri-bakteri uji yang memperlihatkan penghambatan/pembunuhan sampel uji terhadap mikroba-mikroba uji pada pengujian skrining antimikroba. i.Uji Kadar Hambat Minimum (KHM) Sampel ditimbang dalam vial steril dengan konsentrasi yang dikehendaki dalam pengujian. Konsentrasi yang buat sebaiknya dibuat dalam skala deret ukur, selanjutnya dilarutkan dengan 0,5 ml DMSO hingga homogen. Kemudian ditambahkan 4,5 ml medium GNB ke dalam vial yang telah berisi sampel dan dihomogenkan. Kemudian setelah homogen dimasukkan ke dalam masing-masing tabung dimasukkan suspensi bakteri uji. Kemudian ke dalam masing-masing tabung dimasukkan suspensi bakteri uji. Kemudian diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam dan konsentrasi terendah yang menunjukkan larutan tetap jernih adalah harga KHM-nya. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap bakteri yang lain. ii.Uji Kadar Bunuh Minimum Hasil inkubasi pada uji KHM kemudian digoreskan pada media GNA pada cawan petri lalu diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam. Konsentrasi terendah ekstrak uji yang membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroba uji merupakan Kadar Bunuh Minimumnya. iii.Pemisahan senyawa secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

25

Ekstrak uji dipisahkan secara KLT dengan menggunakan campuran eluen yang memperlihatkan partisi senyawa yang terbaik. Kemudian kromatogram yang dihasilkan diamati bercaknya di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm serta penampak bercak H2SO4 10%. iv.Pengujian secara KLT-Bioautografi Ke dalam cawan petri dituang medium GNA sebanyak 10 ml dan ditambahkan suspensi bakteri uji sebanyak 20 µL lalu dihomogenkan. Kromatogram hasil pemisahan senyawa secara KLT kemudian diletakkan di atas permukaan medium yang agak memadat. Setelah 60 menit, lempeng (kromatogram) diangkat dan dikeluarkan. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37⁰C. Diamati daerah hambatan yang terbentuk. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap bakteri uji lainnya. 3. TABEL PENGAMATAN No.

Sampel

UV 254 nm

UV 366 nm

Rf H2SO4 10%

KLT Bioautografi

4. SOAL-SOAL a. Soal Pre-test 1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja? 2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam praktikum? b. Soal Post-test 1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian bioaktivitas antimikroba dengan metode skrining dan KLT bioautografi? 2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari larutan NaCl fisiologis 0,9%, medium GNA dan GNB, DMSO, lempeng TLC 60 GF 254, penampak bercak H2SO4 10%? 3. Uraikan fungsi teknik atau cara kerja yang digunakan setiap percobaan: a. Sterilisasi alat-alat Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

26

4. 5. 6.

b. Penyiapan mikroba uji c. Pengujian skrining antimikroba d. Pengujian potensi antimikroba Hitunglah nilai Rf masing-masing skrining dan KLT Bioautografi? Jelaskan fungsi dari nilai Rf dan hubungan nilai Rf dengan pemisahan senyawa? Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh yang disesuaikan dengan tujuan percobaan?

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

27

PRAKTIKUM VI PENGUJIAN AKTIVITAS MUCOLITIK EKSTRAK BAHAN ALAM MENGGUNAKAN MUCUS USUS SAPI

A. TEORI UMUM Salah satu penyakit yang kerap diobati dengan pengobatan tradisional adalah batuk. Batuk dapat dibedakan menjadi batuk berdahak dan batuk tidak berdahak. Batuk tidak berdahak yang disebut juga batuk kering terjadi apabila tidak ada sekresi saluran pernapasan, iritasi pada tenggorokan sehingga timbul rasa sakit. Batuk berdahak yaitu batuk yang terjadi karena adanya dahak pada tenggorokan dan lebih sering terjadi pada saluran napas yang peka terhadap paparan debu, lembab berlebihan dan sebagainya (Moelyono,1999). Sekresi mukus (dahak) adalah bagian dari bentuk perlawanan dari saluran pernapasan dengan jumlah yang disekresi bervariasi. Mukus berfungsi untuk menahan bakteri, partikel asing, dan senyawa iritan. Hipersekresi mukus dapat terjadi bila terdapat penyakit pada saluran pernapasan seperti bronkhitis, penyakit paru obstruktif kronis, dan asma sebagai bentuk respon inflamasi. Adanya gangguan pada saluran pernapasan merangsang pengeluaran mukus sehingga mukus yang berlebihan dapat mengakibatkan terganggunya fungsi saluran pernapasan (Leboe, 2015). Senyawa kimia yang memiliki kemampuan meluruhkan/mengencerkan dahak disebut mukolitik, yaitu obat yang bekerja dengan mengurangi kekentalan dahak sehingga diharapkan dahak tersebut menjadi lebih mudah dikeluarkan. Seiring dengan kemajuan teknologi dan ilmu pengetahuan telah banyak dilakukan pencarian sumber bahan baku dan pengembangan obat khususnya obatobat yang dapat meluruhkan atau mengencerkan dahak. B. TUJUAN PERCOBAAN Untuk mengetahui aktivitas mukolitik dilihat dari perubahan viskositas mukus usus sapi sebelum dan sesudah inkubasi serta konsentrasi terbaik ekstrak uji yang memberikan efek mukolitik. C. KEGUNAAN PERCOBAAN DALAM ILMU KEFARMASIAN Dapat menjadi acuan bagi farmasis dalam pencarian bahan baku obat dari bahan alam yang berkhasiat sebagai mukolitik. D. HUBUNGAN PERCOBAAN DENGAN MATERI KULIAH TEORI Percobaan ini berhubungan dengan materi pengujian bahan farmasi terutama di bidang farmasi fisika. Viskositas dan rheologi berhubungan erat dengan ilmu farmasi fisika. Viskositas adalah suatu cara untuk menyatakan berapa Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

28

daya tahan dari aliran yang diberikan oleh suatu cairan. Prinsip dasar penerapan viskositas digunakan dalam sifat alir zat cair atau rheologi. Rheologi terlibat dalam pembuatan, pengemasan atau pemakaian, konsistensi, stabilitas dan ketersediaan hayati sediaan. Prinsip percobaan ini adalah kemampuan ekstrak bahan alam dalam mengencerkan mukus usus sapi secara in vitro dengan membandingkan hasil viskositas mukus usus sapi sebelum dan sesudah inkubasi. E. METODE PRAKTIKUM 1. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM Alat-alat yang dibutuhkan : Batang pengaduk, cawan porselin, botol vial, timbangan analitik, gelas kimia 100 ml dan 250 ml, gelas ukur 10 ml dan 100 ml, labu ukur 10 ml dan 25 ml, piknometer, pipet tetes, stopwatch, dan viskometer Ostwald. Bahan-bahan yang dibutuhkan : Ekstrak bahan alam, metanol, etil asetat, heksan, aquadest, mukus usus sapi, dapar Posfat (Na2HPO4, NaH2PO4), asetilsistein 0,1% dan kertas label. 2. PROSEDUR PRAKTIKUM a. Pembuatan dapar Posfat pH 7 1) Larutan A (Na2HPO4 0,1 M) Ditimbang 8,885g Na2HPO4.2H2O, dimasukan pada gelas kimia 100 mL dengan penambahan aquadest sedikit demi sedikit aduk hingga bahan larut kemudian masukan kelabu takar 500 mL, ditambah lagi aquades sampai tanda batas. 2) Larutan B (NaH2PO4 0,1 M) Ditimbang 3,4445g NaH2PO4.H2O; dimasukan pada gelas kimia 100 mL dengan penambahan aquades sedikit demi sedikit aduk hingga bahan larut kemudian masukkan kelabu takar 250 mL, ditambah lagi aquades sampai tanda batas. Kedua larutan diatas masing-masing dipipet gondok, untuk larutan A 305,5 mL dan larutan B 194,3 mL lalu dihomogenkan kemudian dicek pH dengan menggunakan kertas lakmus (pH = 7,0). b. Pembuatan mukus sapi 20% dalam dapar fosfat Diambil 20 gram mukus sapi kemudian dilarutkan dalam dapar fosfat pH 7 hingga volume 100 mL. c. Pengujian Mukolitik 1. Disiapkan bahan dan alat praktikum 2. Dibuat beberapa seri konsentrasi sampel uji dalam botol vial (jumlah seri konsentrasi disesuaikan dan konsentrasi kontrol positif (obat Asetilsistein 0,1 %) dan kontrol negatif (disesuaikan pelarut yang digunakan). Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

29

3. 4.

5. 6.

7. 8. 9.

Dalam gelas kimia dimasukkan masing-masing botol vial yang berisi sampel uji sesuai konsentrasi uji, kontrol positif dan negatif. Selanjutnya dimasukkan larutan mukus usus sapi 20% pada masingmasing gelas kimia (perlakuan no.2). dengan menggunakan perbandingan 1:9 (misalnya 10 ml larutan uji : 90 ml larutan mukus) Diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit. Dilakukan pengukuran viskositas mucus awal sebelum inkubasi menggunakan Viskometer Ostwald, hitung waktu alir dari masing-masing (larutan uji, kontrol positif dan negatif) Selanjutnya dilakukan pengukuran berat jenis mukus (kerapatan) dengan piknometer. Dihitung viskositasnya dengan mengalikan waktu alir dan kerapatan. Tentukan konsentrasi terbaik ekstrak uji yang memberikan efek mukolitik dengan metode analisis data Regresi Linier, Anova, dan uji t.

3. TABEL PENGAMATAN Perhitungan Berat Jenis dan Pengukuran Waktu Alir Perhitungan berat jenis untuk semua larutan menggunakan rumus : Berat pikno berisi cuplikan – Berat pikno kosong BJ = Volume piknometer Tabel Berat Jenis dan Waktu Alir T (s) Sebelum Perlakuan inkubasi I II Air Suling Kontrol Positif

Sesudah inkubasi I II

Berat Jenis (g/mL) Pikno Berat + Pikno Jenis sampel

Kontrol Negatif Konsentras ix% Konsentras i ke-n%

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

30

Perhitungan viskositas untuk semua larutan dilakukan dengan rumus : rata-rata t larutan uji x BJ larutan uji Viskositas = x viskositas kontrol negatif rata-rata t kontrol negatif x BJ kontrol negatif dimana : t = waktu yang dibutuhkan oleh cuplikan untuk mengalir (detik) BJ = berat jenis (gram/mL)

Tabel Viskositas Sebelum Inkubasi Konsentrasi

Larutan uji Kontrol positif Kontrol negatif

Replikasi perubahan viskositas mukus (Cp) R1 R2 R3

Total (Cp)

Ratarata (Cp)

Replikasi perubahan viskositas mukus (Cp) R1 R2 R3

Total (Cp)

Ratarata (Cp)

X% ke-n % 0,1% 10%

Tabel Viskositas setelah Inkubasi Konsentrasi

Larutan uji Kontrol positif Kontrol negatif 4.

x% ke-n% 0,1% 10%

SOAL-SOAL a. Soal Pre-test 1. Uraikan prosedur kerja praktikum dengan menggunakan skema kerja? 2. Buatlah perhitungan pembuatan konsentrasi yang digunakan dalam praktikum? b. Soal Post-test 1. Uraikan prosedur kerja yang anda lakukan pada pengujian aktivitas mukolitik. 2. Uraikan kegunaan atau fungsi dari mukus sapi, asetilsistein 0,1%, dan dapar fosfat. 3. Uraikan fungsi dari perlakuan yang digunakan dalam percobaan: a. Pembuatan dapar fosfat pada pH 7 b. Pembuatan mukus sapi dalam dapar fosfat

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

31

4. 5. 6. 7. 8.

c. Pembuatan seri konsentrasi sampel, kontrol positif, dan kontrol negative d. Inkubasi pada suhu 37⁰C selama 30 menit e. Pengukuran viskositas sebelum dan sesudah inkubasi Mekanisme kerja asetilsistein sebagai obat batuk? Hitunglah nilai perubahan viskositas mukus (Cp) pada masing-masing kelompok perlakuan! Jelaskan fungsi dari nilai Cp dan hubungannya dengan konsentrasi ekstrak dalam menghasilkan aktivitas mukolitik! Jelaskan perbedaan analisis data dengan metode anova dan uji t terkait percobaan ini! Simpulkan hasil percobaan yang diperoleh sesuai dengan tujuan percobaan!

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

32

LAMPRAN METODE- METODE ANALISIS PERHITUNGAN DAN PELAPORAN 1. TABEL PENGAMATAN UJI BSLT Jumlah mati pada konsentrasi sampel (ppm) Replikasi Sampel a µg/ml b µg/ml c µg/ml d µg/ml 1 2 3 Total penghambatan % penghambatan Harga Probit Tabel Perhitungan Log Konsentrasi (X) m µg/ml n µg/ml o µg/ml p µg/ml

Harga Probit (Y) q r s t

1. Dari data di atas dapat dihitung nilai intersep (a) dan slop (b) serta resultan (r) dengan persamaan regresi linear : y = a + bx menggunakan Kalkulator atau rumus Statistik. 2. Jika nilai a dan b telah di peroleh, maka nilai LC50 dapat diperoleh dengan memasukkan nilai (y) = jumlah replikasi, sehingga nilai (x ) dapat pula diperoleh. 3. Jika nilai (x) telah diperoleh maka gunakan rumus : LC50 = anti log x

4. Jika nilai LC50 telah diketahui maka dapat diketahui pula konsentrasi dimana 50 % hewan uji mati. Tambahan: * Beberapa metode analisis perhitungan nilai LC50 yang dapat digunakan : 1. Metode Analisa Probit 2. Metode Reed and Muench 3. Metode Grafik 4. Metode Perhitungan Matematika

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

33

RUMUS PERHITUNGAN PROBIT UJI ANTIMITOSIS 1. Prosentase jumlah sel yang mengalami penghambatan pembelahan : ∑ TM % TM

=

x 100 ∑ ST

Keterangan : % TM = % sel tidak membelah ∑ TM = jumlah sel tidak membelah ∑ ST = jumlah sel total 2. Nilai probiy (y) rata-rata yang sebenarnya : (Npb - Npa) x C y = Npa 1

Keterangan : Npa = nilai tabel probit hasil persentase rata-rata Npb = nilai tabel probit satu angka lebih besar dari probit rata-rata C = angka/nilai desimal dari kelebihan perhitungan persentase rata-rata 2. TABEL ANALISIS REED & MUENCH. Konsent rasi (%)

Log Konsentrasi (%)

KE1 KE2 KE3 KE4 KE5

Jumlah

Terakumulasi

Mat i

Hidu p

Mati (x)

F

K

F

G H I

L M N

J

O

f+g f+g+h f+g+h+i f+g+h+i+ j

Hidup (y)

Rasio mati : total Terakumulas i x:(x+y)

Mortalita s (%) Rasio x 100

k+l+m+n+ o l+m+n+o m+n+o n+o O

Untuk mendapatkan nilai LC50 dan LC90, analisis data menggunakan rumus: ℎ=

50%− 𝛼 𝑏− 𝛼

dan

ℎ=

90%− 𝛼 𝑏− 𝛼

𝑖 = 𝑙𝑜𝑔

𝑘 𝑠

g= hxI y = g + log s

LC50 dan LC90 = log y Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

34

Keterangan : h = Jarak proporsi i = Logaritma pertambahan konsentrasi a = Presentase kematian lebih kecil dari 90% b = Presentase kematian lebih besar dari 90% k = Konsentrasi yang lebih besar dari 90% kematian s = konsentrasi yang lebih kecil dari 90% kematian g = Hasil kali jarak proporsi dengan logaritma pertambahan dosis y = Persamaan

3. TABEL ANALISIS OF VARIAN (ANOVA) Sumber keragaman Db JK KT Fhitung

Ftabel

keteranga n

Perlakuan Galat Total Dimana : Db KT JK

= Derajat bebas = Kuadrat tengah = Jumlah kuadrat

Perhitungan Anava a. Menghitung FK 𝐹𝐾 =

𝑇𝑖𝑗 2 𝑛.𝑡

b. Menghitung JK total JK total = T(yij2) – FK c. Menghitung JK perlakuan 𝐽𝐾 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 =

𝑇𝐴2 𝑛

− 𝐹𝐾

d. Menghitung JK galat JK galat = JK total - JK galat e. Menghitung derajat bebas 1) db total = (n.t) – 1 2) db perlakuan = t – 1 3) db galat = db total – db perlakuan f. Menghitung kuadrat tengah (KT) 1) 𝐾𝑇 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 =

𝐽𝐾𝑃 𝑑𝑏𝑝

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

35

𝐽𝐾𝐺

2) 𝐾𝑇𝑔𝑎𝑙𝑎𝑡 = 𝑑𝑏𝐺

g. Menghitung harga F hitung 𝐾𝑇𝑃

𝐹 ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 = 𝐾𝑇𝐺

Bila F hitung > F Tabel (X = 0,01), maka Ha diterima artinya ada pengaruh pemberian variasi dosis ekstrak buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) terhadap aktivitas imunoglobulin M (Ig M) terhadap tikus putih (Rattus Norvegicus). Bila F hitung < F Tabel (a = 0,01), maka H0 diterima artinya tidak ada pengaruh pemberian variasi dosis ekstrak buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) terhadap aktivitas imunoglobulin M (Ig M) terhadap tikus putih (Rattus Norvegicus). Apabila hasil anova signifikan uji dilanjutkan dengan menghitung koefisien keseragaman (KK). 𝐾𝐾 =

√𝐾𝑇𝐺 𝑥 𝑌

100%

Dari hasil Anava, diperoleh nilai KK (Koefisien Keragaman), maka untuk pengujian lanjutan disesuaikan dengan persentase dari nilai KK yaitu : 1. Jika hasil KK lebih besar (minimal 10% untuk perlakuan homogen) dan (minimal 20 % untuk hetrogen) digunakan uji Duncan dimana uji ini merupakan uji yang paling teliti. 2. Jika hasil KK (antar 5-10% untuk perlakuan homogen) dan (antara 10-20% untuk hetrogen) digunakan uji BNT dimana uji ini merupakan uji yang memiliki ketelitian sedang. 3. Jika hasil KK (maksimal 5% untuk perlakuan homogen) dan (maksimal 10% untuk perlakuan hetrogen) digunakan uji BNJ dimana uji ini kurang teliti. 4. TABEL UJI t Perlakuan Analisa K

E

Simpangan Baku

S1

S2

Varians

S12

S22

Waktu kematian cacing Ascaridia galli

Rata-rata

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

36

t= Keterangan : = rata-rata kematian Acaridia galli untuk pirantel pamoat = rata-rata kematian Acaridia galli untuk ekstrak kulit buah Mangga gadung (Mangifera indica. L). S1 = simpangan baku untuk pirantel pamoat S2 = simpangan baku untuk ekstrak kulit buah Mangga gadung (Mangifera indica. L) S1 2 = varians untuk pirantel pamoat S1 2 = varians ekstrak ekstrak kulit buah Mangga gadung (Mangifera indica. L).

Penuntun Pengujian Bahan Farmasi Semester Genap 2018/2019

37