The Comet Assay.docx

The Comet Assay, also called single cell gel electrophoresis (SCGE), is a sensitive and rapid technique for quantifying and analyzing DNA damage in individual cells. As such, this is one of the techniques used in the area of cancer research for the evaluation of genotoxicity and effectiveness of chemoprevention. Swedish researchers Östling & Johansson developed this technique in 1984.1 Singh, et al., later modified this technique, in 1988, as the Alkaline Comet Assay.2 The resulting image that is obtained resembles a "comet" with a distinct head and tail. The head is composed of intact DNA, while the tail consists of damaged (single-strand or double-strand breaks) or broken pieces of DNA. While most of the applications of the Comet Assay have been to study animal eukaryotes, there have been reports of successful application in the study of plant cells. Individual cells are embedded in a thin agarose gel on a microscope slide. All cellular proteins are then removed from the cells by lysing. The DNA is allowed to unwind under alkaline/neutral conditions. Following the unwinding, the DNA undergoes electrophoresis, allowing the broken DNA fragments or damaged DNA to migrate away from the nucleus. After staining with a DNAspecific fluorescent dye such as ethidium bromide or propidium iodide, the gel is read for amount of fluorescence in head and tail and length of tail. The extent of DNA liberated from the head of the comet is directly proportional to the amount of DNA damage. The Comet Assay can be used to detect DNA damage caused by double strand breaks, single strand breaks, alkali labile sites, oxidative base damage, and DNA cross-linking with DNA or protein. The Comet Assay is also used to monitor DNA repair by living cells. The Comet Assay, juga disebut gel sel elektroforesis tunggal (SCGE), adalah teknik sensitif dan cepat untuk mengukur dan menganalisa kerusakan DNA pada sel-sel individual. Dengan demikian, ini adalah salah satu teknik yang digunakan dalam bidang penelitian kanker untuk evaluasi genotoxicity dan efektivitas kemoprevensi. Peneliti Swedia Östling & Johansson mengembangkan teknik ini di 1.984,1 Singh, et al., Kemudian dimodifikasi teknik ini, pada tahun 1988, sebagai Alkaline Comet Assay.2 gambar yang dihasilkan yang diperoleh menyerupai "komet" dengan kepala dan ekor yang berbeda. Kepala terdiri dari DNA utuh, sementara ekor terdiri dari rusak (istirahat untai tunggal atau untai ganda) atau patah potongan DNA. Sementara sebagian besar aplikasi dari Comet Assay telah mempelajari eukariota hewan, ada laporan dari aplikasi yang sukses dalam studi sel tanaman. Sel-sel individual yang tertanam dalam gel agarosa tipis pada slide mikroskop. Semua protein seluler kemudian dikeluarkan dari sel-sel dengan melisiskan. DNA diperbolehkan untuk bersantai di bawah basa / kondisi netral. Setelah unwinding, DNA mengalami elektroforesis, yang memungkinkan fragmen DNA yang rusak atau DNA yang rusak untuk bermigrasi jauh dari inti. Setelah pewarnaan dengan pewarna fluorescent-DNA tertentu seperti ethidium bromida atau iodida propidium, gel dibaca untuk jumlah fluoresensi di kepala dan ekor dan panjang ekor. Luasnya DNA dibebaskan dari kepala komet berbanding lurus dengan jumlah kerusakan DNA. The Comet Assay dapat digunakan untuk mendeteksi kerusakan DNA yang disebabkan oleh istirahat ganda untai, istirahat untai tunggal, situs labil alkali, kerusakan oksidatif dasar, dan DNA silang menghubungkan dengan DNA atau protein. The Comet Assay juga digunakan untuk memantau perbaikan DNA oleh sel-sel hidup

The concept of microgel electrophoresis was first introduced in 1984 by Ostling and Johansons a method to measure DNA single-strand breaks that caused relaxation of DNA supercoils. A modified version was published by Singh and colleagues in 1988, which used alkaline conditions. The idea was to combine DNA gel electrophoresis with fluorescence microscopy to visualize migra- tion of DNA strands from individual agarose-embedded cells. If the negatively charged DNA contained breaks, DNA supercoils were relaxed and broken ends were able to migrate toward the anode during a brief electrophoresis. If the DNA was undamaged, the lack of free ends and large size of the fragments prevented migration. Determination of the relative amount of DNA that migrated provided a simple way to measure the number of DNA breaks in an individual cell. Although equally sensitive methods for the detection of DNA single-strand breaks were introduced in the mid 1970s, three facts (in addition to the obvious appeal of ‘seeing’ the damaged DNA) made this method attractive. First, only about a thousand cells were required. Second, the cells did not need to be tagged with a radioisotope, thus allowing measure- ment of damage in any nucleated cell. Perhaps most important, the method could be used to measure variations in response to DNA damaging agents between cells of the same exposed population. Konsep microgel elektroforesis pertama kali diperkenalkan pada tahun 1984 oleh Ostling dan Johanson1 sebagai metode untuk mengukur DNA istirahat untai tunggal yang menyebabkan relaksasi dari superkoil DNA. Sebuah versi modifikasi diterbitkan oleh Singh dan rekan pada tahun 1988, yang digunakan conditions2 basa. Idenya adalah untuk menggabungkan gel elektroforesis DNA dengan mikroskop fluoresensi untuk memvisualisasikan tion migra- untai DNA dari sel-agarosa tertanam individu. Jika bermuatan negatif DNA yang terkandung istirahat, superkoil DNA yang santai dan rusak ujungnya mampu bermigrasi menuju anoda selama elektroforesis singkat. Jika DNA adalah rusak, kurangnya ujung bebas dan ukuran besar fragmen dicegah migrasi. Penentuan jumlah relatif DNA yang bermigrasi menyediakan cara sederhana untuk mengukur jumlah istirahat DNA dalam sel individu. Meskipun metode sama sensitif untuk mendeteksi DNA istirahat untai tunggal diperkenalkan pada pertengahan 1970s3,4, tiga fakta (selain daya tarik yang jelas dari 'melihat' DNA yang rusak) membuat metode ini menarik. Pertama, hanya sekitar seribu sel yang diperlukan. Kedua, sel-sel tidak perlu dengan radioisotop tag, sehingga memungkinkan pemerintah pengukuran kerusakan di setiap sel berinti. Mungkin yang paling penting, metode ini dapat digunakan untuk mengukur variasi dalam menanggapi agen merusak DNA antara sel-sel dari populasi terpapar sama. n 1990, a modification of the original method of Ostling and Johanson was introduced and named the “comet assay” after the appearance of the DNA from an individual cell5. The comet head containing the high-molecular-weight DNA and the comet tail containing the leading ends of migrating fragments were mea- sured in real time from digitized images using software developed for this purpose6. Tail moment, a measure of both amount of DNA in the tail and distribution of DNA in the tail, became a common descriptor along with tail length and percentage of DNA in the tail. Pada tahun 1990 , modifikasi dari metode asli Ostling dan Johanson diperkenalkan dan bernama " uji komet " setelah munculnya DNA dari sebuah cell5 individu. Kepala komet mengandung DNA dengan berat molekul tinggi dan ekor komet mengandung ujung terkemuka migrasi fragmen yang diukur secara real time dari gambar digital menggunakan perangkat lunak yang dikembangkan untuk purpose6 ini . Ekor saat, ukuran baik jumlah DNA dalam ekor dan distribusi DNA di bagian ekor , menjadi deskriptor umum bersama dengan panjang ekor dan persentase DNA di bagian ekor

Prosedur PROCEDURE Agarose preparation 1. 2. 3.

1| Equilibrate two water baths: one at 40 C and one at 100 C. 2| Prepare 1% low-gelling-temperature agarose by mixing powdered agarose with distilled water in a glass beaker or bottle. 3| Place bottle in the 100 C water bath for several minutes. Alternatively, carefully microwave bottle at low power for short

intervals (avoid vigorous boiling of the agarose and ensure that all agarose is dissolved) 4| Place bottle with agarose into a 40 C water bath. If the cell sample contains red blood cells or hemoglobin, add 2% DMSO to the agarose and/or alkaline lysis solution to avoid damage by ironcatalyzed reactive oxygen species, which can cause strand breaks.

persiapan agarosa 1 | Menyeimbangkan dua mandi air : satu di 40 ° C dan satu di ~100 ° C . 2 | Siapkan 1 % agarose - gel - suhu rendah dengan mencampur bubuk agarosa dengan air suling dalam gelas gelas atau botol . 3 | Botol tempat di 100 ° C bak air selama beberapa menit . Atau , hati-hati microwave botol pada daya rendah untuk pendek interval ( menghindari didih yang kuat dari agarose dan memastikan bahwa semua agarosa dibubarkan ) 4. Tempat botol dengan agarose ke dalam bak air 40 ° C . Jika sampel sel mengandung sel darah merah atau hemoglobin , tambahkan 2 % DMSO ke agarosa dan / atau alkali solusi lisis untuk menghindari kerusakan oleh besi - katalis spesies oksigen reaktif , yang dapat menyebabkan untai istirahat .