Seminario 1 - 2006

Seminario 1 Introducción, biología viral y metodología de estudio de los virus

Postulados de Koch Cómo saber que un agente infeccioso es responsable de una enfermedad determinada?

i.El agente debe estar presente en todos los casos de la enfermedad. ii.El agente debe ser aislado desde el huésped y crecer in vitro. iii.La enfermedad debe ser reproducida cuando desde un cultivo puro del agente se inocule a un huésped susceptible. iv.El mismo agente debe ser recuperado una vez más desde el huésped experimentalmente infectado.

¿Cómo definimos a un virus? Parásito genético intracelular obligado de tamaño sub-microscópico. Carecen del potencial bioquímico y genético para generar su propia energía

Fundamentos sobre la estructura viral 1.CAPSIDE constituye la cubierta proteica que recubre y protege al ácido nucleico, constituida por unidades estructurales. 2.CAPSOMEROS son las unidades morfológicas que representan a las unidades estructurales. 3.La cápside en estrecha asociación con el ácido nucleico recibe el nombre de NUCLEOCAPSIDE. 4.La nucleocápside puede estar cubierta por una ENVOLTURA de tipo lipoproteica que contiene proteínas del huésped y del virus. 5.VIRION es la partícula viral completa y dotada de capacidad infectante. 6.PROTEINA ESTRUCTURAL es aquella que codificada por el virus se encuentra formando parte del virión; las NO ESTRUCTURALES son requeridas para la replicación, pero no están en el virión.

Las cosas por su nombre... •Viroides son pequeñas moléculas de RNA (200-400 nt), circulares con estructura secundaria semejante a la del círculo rodante, no poseen cápside ni envoltura y se asocian con enfermedades de plantas. Son también parásitos intracelulares obligados para su replicación. •Virusoides son moléculas satélite, semejantes a los viroides auqnue algunos más grandes (ej. aproximadamente 1000nt) los cuales dependen de la replicación de un virus para multiplicarse, aparecen como pasajeros dentro de la cápside viral. •Priones son agentes infecciosos de enfermedades definidas que se cree,consisten en un tipo simple de proteína sin presencia de ácido nucleico. La proteína y el gen que la codifica se encuentran en células sanas, no infectadas. Estos agentes están asociados con enfermedades humanas tales como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, scrapie en ovejas y la encefalopatía bovina espongiforme (BSE) en ganado vacuno.

Virus = veneno

Tamaño comparativo de los virus

Simetría viral Icosaédrica

Helicoidal

Mixta

Compleja

Bacteriofago T4 Viuela Ebola

HIV

Influenza

Adenovirus

ADENOVIRUS

VIRUS PAPILOMA

HERPESVIRUS

PICORNAVIRUS

VIRUS DE HEPATITIS B

VIRUS INFLUENZA

Virus DNA relevantes en enfermedades humanas

Virus RNA relevantes en enfermedades humanas

Clasificación de virus DNA

Clasificación de virus RNA

Metodologías para el estudio de los virus Huevos embrionados Animales de laboratorio

Cultivos celulares

Tipos y características de los cultivos celulares Cultivo primario • • • •

Línea celular continua

Células diploides

Euploidismo Constituido por distintos tipos celulares Crecimiento limitado (5 a 10 divisiones celulares) Uso: Estudios de virología experimental; preparación de vacunas a virus atenuado (ej:Sabin)

•Población homogénea (tipo celular único), diploide •Hasta 100 divisiones •Uso: vacunas

Monocapa

• • • •

•

Suspensión

Único tipo celular Aneuploidismo Crecimiento ilimitado Surgidas desde células tumorales o de cultivos diploides Menos diferenciadas

Línea continua epitelioide: A549 (carcinoma humano de pulmón)

Línea continua fibroblástica: BHK (baby hamster kidney)

BSC40 Control

(Mono verde africano) Infectadas

A549 Control

Infectadas (Sarampión)

MT-2 (células linfoides – HTLV-I) Infectadas con HIV-1 Formación de sincicios

Membrana corioalantoidea Infectada con virus viruela

Coloreada con azul de tetrazolio

Cuantificación de virus por plaqueo

ENSAYO DE HEMAGLUTINACIÓN (virus Influenza)

ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (virus Influenza)

Prueba de ELISA (Enzyme linked-immunosorbent assay)

Western blot Criterio de interpretación con fines diagnósticos Virus HIV (investiga presencia de Ac específicos) Positivo: 2/3 bandas mayores (anticuerpos contra gp160/120, gp41, p24) Indeterminado: No cumple criterio de positividad Negativo: Ausencia de bandas

Inmunofluorescencia (Ej: detección de Ags de hantavirus)

CMV (Ag pp65)

HSV-1

PCR

(pesquisa de ácidos nucleicos)

Hibridación fluorescente in-situ

PCR in situ

Detección de ARN viral (HIV) por PCR in situ

QUANTIPLEX HIV-1

Pre-amplifier

TARGET PROBES CAPTURE PROBES

bDNA Amplifier 15 alcaline-phosphatase labeled DNA branches

RNA

CAPTURE

Dioxetane

SIGNAL AMPLIFICATION

CHEMILUMINESCENCE

Cómo se estudia la ultraestructura de un virus?

•Métodos físicos

•Determinación del tamaño por filtración (filtros coloidales), coeficiente de sedimentación (ultracentrífugas), contenido de ácidos nucleicos y dispersión de la luz (espectroscopia), electroforesis de ácidos nucleicos y proteínas del virus, estructura viral a nivel atómico (difracción de rayos X-cristalografía, RMN)

•Métodos químicos •Determinación de la composición y naturaleza de los componentes virales, y su relación para la construcción de la partícula viral. Se estudian los lípidos, las proteínas, y los ácidos nucleicos.

•Microscopia electrónica •Puede superar los X 100,00. Básicamente dos tipos de información: a) recuento total del número de partículas virales en un preparado y, b) la apariencia/estructura de las partículas