Rapporto Micro Ospite

RAPPORTO MICRORGANISMOOSPITE 1. COMMENSALISMO (MICROBIOTI) 2. SIMBIOSI MUTUALISTICA (MICROBIOTI) 3. PARASSITISMO (PATOGENI)

POPOLAZIONI MICROBICHE DEL CORPO UMANO

Quantità di microrganismi presenti in ufc/ml, ufc/g,ufc/cm2

Microrganismi normalmente residenti

MICROBIOTA=FLORA MICROBICA

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE

Stomaco e Duodeno

COLON Digiuno e Ileo

500 SPECIE DIVERSE DI MICRORGANISMI

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Fattori che influenzano la composizione del microbiota

 

VELOCITA’ DEL FLUSSO

PRESENZA DI OSSIGENO 



pH

SOSTANZE ANTIMICROBICHE 

DIETA

Microbioti del tratto G-I nell’uomo adulto (Log n. batteri/g contenuto) stomaco digiuno ileo colon AEROBI Enterobatteri 0–2 0–3 2–6 4 – 10 Streptococchi 0–3 0–4 2–6 5 – 10 Stafilococchi 0–2 0–3 2–5 4–7 Lattobacilli 0–3 0–4 2–5 6 – 10 Miceti 0–2 0–2 2–3 2–6 ANAEROBI Batteroidi rari 0–2 3–7 10 – 12 Bifidobatteri rari 0–3 3–5 8 – 12 Cocchi rari 0–3 2–5 8 – 11 Clostridi rari rari 2–4 6 - 11

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: da dove vengono? il microbiota intestinale deriva dall’interazione tra ospite e ambiente

Isolauri E. et al, 2004, BP &RCG, 18, 299-313

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Specie più rappresentative

Bifidobatteri

- nel neonato il 90 % dei microbioti è rappresentato da Bifidobatteri; 

- nell’individuo adulto i Bifidobatteri costituiscono solo il 50 %



MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Rapporti con l’ospite

E’ possibile suddividere i microbioti in tre gruppi in relazione al loro comportamento nei riguardi dell’ospite umano : -potenzialmente dannosi : Proteus, Staphylococcus, Clostridi, Veillonella, Prevotella, Candida -indifferenti o benefici: Bacteroides, batteri enterici, Enterococcus. -benefici : Lactobacillus, Eubacterium, Bifidobacterium

Bifidobatteri

Gram positivi, Anaerobi obbligati

Gram positivi, Anaerobi facoltativi

Lattobacilli

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?

FUNZIONI NUTRITIVE-METABOLICHE Sintesi e produzione 1- vitamine del gruppo B 2- vitamina K 3- acidi grassi a catena corta (BUTIRRATO, PROPIONATO

Metabolizza 1- acidi biliari 2- farmaci

ACETATO)

MICROBIOTI E SISTEMA IMMUNE 1- importante ruolo nello SVILUPPO e OMEOSTASI del sistema immunitario 2- produzione di s-IgA 3- mantiene uno stato permanente di INFIAMMAZIONE FISIOLOGICA

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?

Antagonismo con potenziali patogeni Microbioti

Patogeni

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?

Antagonismo con potenziali patogeni

Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens

Servin A.L. FEMS Microb. Review , 2004, 28, 405-440

Rapporto Ospite-Microbiota SIMBIOSI MUTUALISTICA

VANTAGGI PER L’OSPITE 1. Vitamine e fattori nutrizionali 2. Antagonismo con potenziali patogeni 3. Stimolazione del sistema immunitario VANTAGGI PER I MICROBIOTI 1. Disponibilità di nutrienti 2. Condizioni ambientali ottimali (temp., pH, O2, aw)

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa faremmo senza di essi? Come valutare il microbiota intestinale. Considerazioni sperimentali

•Studi condotti su animali germ-free (axenici)

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Come valutare il microbiota intestinale. Considerazioni sperimentali

Colonie di E. coli in agar MC La maggior parte delle specie batteriche del nostro microbiota intestinale sono scarsamente coltivabili in laboratorio Metodi molecolari alternativi: 16S rRNA, PCR, FISH ecc.

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Questioni aperte

La funzione della maggior parte dei membri della comunità microbica è sconosciuta •Gnotobioti •Studio della comunità microbica nel suo complesso •Interazioni tra i microbi e tra i microbi e l’ospite

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Fattori che modificano la composizione della comunità microbica

•STRESS •ANTIBIOTICI •MALATTIE •BATTERI PATOGENI • VIRUS •DIETA

CONSEGUENZE di un alterato microbiota intestinale 1. funzioni fisiologiche alterate 2. cattivo assorbimento di nutrienti 3. indebolimento delle difese immunitarie 4. infezioni 5. diarrea o stipsi Clostridium difficile

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa succede se si rivoltano contro l’ospite?

Batteri normalmente residenti

Condizioni cliniche associate alla flora microbica normale

PROBIOTICI 1882 - Metchinkoff

Primi studi

alta concentrazione di LATTOBACILLI = MAGGIORE SALUTE E LONGEVITÀ DELL’UOMO

1965 – Lilly e Stillwell

Prima definizione:

“… è probiotico qualsiasi sostanza o microrganismo in grado di contribuire all’equilibrio della flora batterica…”

1998 – Salminen “…PROBIOTICI come MICRORGANISMI vivi presenti nei cibi che hanno un effetto positivo sulla salute umana”

Using probiotics and prebiotics to improve gut health Tuohy, K.M . et al Drug Discovery Today, 2003, 8 (15), 692-700

Batteri lattici - aggregato Lactobacillus acidophilus: Lactobacillus gasseri Lactobacillus crispatus Lactobacillus amylovorus Lactobacillus gallinarum Lactobacillus johnsonii - aggregato Lactobacillus casei: Lactobacillus paracasei Lactobacillus rhamnosus - Lactobacillus reuteri - Lactobacillus salivarius - Lactobacillus plantarum - Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus - Streptococcus thermophilus Bifidobatteri: - Bifidobacterium longum - Bifidobacterium bifidum - Bifidobacterium breve - Bifidobacterium infantis - Bifidobacterium animalis - Bifidobacterium lactis Altri microrganismi: - Enterococcus faecium - Propionibacterium spp. - Saccharomyces boulardi

PROBIOTICI Caratteristiche

acido e bile resistenza sicurezza ed efficacia difesa della mucosa intestinale; antagonismo verso batteri patogeni

Caratteristiche dei microrganismi probiotici I microrganismi per essere considerati probiotici devono soddisfare i seguenti requisiti: •essere di provenienza intestinale. I microrganismi probiotici devono essere normali componenti della microflora dell’intestino umano in condizioni di salute; •essere assolutamente sicuri per l’impiego nell’uomo senza causare effetti collaterali specialmente in pazienti debilitati o immunocompromessi; •essere attivi e vitali alle condizioni ambientali che sono presenti a livello intestinale •essere resistenti ad un basso pH, al succo gastrico, alla bile ed al succo pancreatico; •essere in grado quindi di persistere, almeno temporaneamente,nell’intestino umano

Rapporto Microrganismo –Ospite

Parassitismo Azione patogena dei batteri 1) Penetrazione all’interno dell’ospite 2) colonizzazione dei tessuti dell’ospite 3) resistenza ai meccanismi di difesa 4) malattia Fattori di virulenza 1) Fattori di attacco 2) Fattori di invasione e colonizzazione 3) Strategie per sfuggire ai meccanismi di difesa dell’ospite 4) Danneggiamento dei tessuti

PATOGENICITA’ E VIRULENZA

PATOGENICITA’ E VIRULENZA

Malattia infettiva E’ “LA RISULTANTE” TRA L’AZIONE PATOGENA DEL MICRORGANISMO E LA RISPOSTA DIFENSIVA DELL’OSPITE

Fattori di attacco dei batteri alle cellule dei tessuti ospite BATTERI

Streptococcus pyogenes Streptococcus mutans Streptococcus salivarius

ADESINE Proteina F Glicosil transferasi Acidi Lipoteicoici

Streptococcus pneumoniae

Proteine di superficie

Staphylococcus aureus

Proteine di superficie

Neisseria gonorrhoeae

Pili

E. coli Enterotossigeno

Pili tipo I

E. Coli Uropatogeno

Pili tipo I

Bordetella pertussis

Pili

Vibrio cholerae

Pili

Treponema pallidum Mycoplasma

Peptide della membrana esterna Proteina di membrana

Adesione dei batteri ai tessuti dell’ospite

Rapporto tra i batteri patogeni e le cellule dell’ospite

Fattori di invasione e colonizzazione INVASINE

BATTERI

ATTIVITA

Ialuronidasi

Streptococci, staphylococci e clostridi

Collagenasi

Clostridium

Collagene

Neuraminidasi

Vibrio cholerae e Shigella dysenteriae

Acido neuraminico

Coagulasi

Staphylococcus aureus

Chinasi

Staphylococci e streptococci

Leucocidine

Staphylococcus aureus

Antifagocitaria

Streptolisine

Streptococcus pyogenes

Antifagocitaria

Emolisine

Streptococci, staphylococci e clostridia 

Fosfolipasi

Lecitinasi

Clostridium perfringens

Fosfolipasi

Clostridium perfringens

Ac.ialuronico

Fibrinogeno/Fibrina Plasminogeno/Plasmina

lecitine fosfolipidi

DIFESE COSTITUTIVE

Difese innate, non specifiche, Pronte per l’uso

DIFESE COSTITUTIVE DELL’OSPITE 2. Barriere anatomiche,ecc. 3. Proteine, peptidi, enzimi antimicrobici 4. Risposta infiammatoria (Fagocitosi)

Fagociti professionali

neutrofili macrofagi

INGLOBARE E DISTRUGGERE I MICRORGANISMI

Fasi della fagocitosi •RICONOSCIMENTO •INGESTIONE E FORMAZIONE DEL FAGOSOMA •FORMAZIONE DEL FAGOLISOSOMA •DIGESTIONE

Fase di riconoscimento

IgG FcR CR

OPSONIZZAZIONE

OPSONIZZAZIONE

OPSON= SALSA

Facilita il processo di riconoscimento Microbo invasore

OPSONINA, IgG Recettore FcR

FRAMMENTO Fc

FAGOCITA

Respiratory Burst Esplosione respiratoria Produzione di radicali tossici dell’ossigeno

Glucose +NADP+ G-6-P-dehydrogenase NADPH + O2 Cytochrome b558

Pentose-P + NADPH -

NADP++ O2

-

2O2 + 2H+

H2O2 + 1O2

Superoxide dismutase 2

2O + H2O2

.OH + OH- + 1O2

Esplosione respiratoria

H2 O2 + Cl-

OCl- + H2O

myeloperoxidase 2OCL- + H2O -

2O2 + 2H+ Superoxide dismutase 2 H2 O2 catalase

-

O2 + Cl-+ H2O

1

H2O2 + O2H2O + O2-

Batter i

AZIONE TOSSICA DEI BATTERI Caratteristiche delle esotossine • Natura proteica • Alto potere immunogeno • Attività enzimatica • Azione citotossica (specifica o ampia) • Azione a “lungo raggio” • E’ possibile ottenere dei tossoidi

TOSSINE Cholera toxin(A-5B) Diphtheria toxin (A/B) Pertussis toxin (A-5B) E. coli heat-labile toxin LT (A-5B) E. coli heat stable toxin ST Shiga toxin (A/5B) Pseudomonas Exotoxin A (A/B) Botulinum toxin (A/B) Tetanus toxin(A/B) Anthrax toxin LF (A2+B) Bordetella pertussis AC toxin (A/B) and Bacillus anthracis

Tossina difterica Azione tossica

Interagisce con recettori cellulari Prodotta da Corynebacterium diphtheriae •Tossina di tipo A/B •Pm 60KDa •535 aminoacidi

Meccanismo d’azione della tossina difterca

Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite

Basi genetiche e molecolari dei fattori di virulenza

Fattori di virulenza Cromosoma principale

Plasmidi

Batteriofagi Trasposoni

Evoluzione patogena dell’Escherichia coli

GENOMICA EVOLUTIVA E. coli non virulento

2. Cambiamento di virulenza.

DNA batterico

1. Trasferimento genetico. Coniugazione Trasduzione Trasformazione

3. Malattie intestinali: dovute ai geni per i fattori di virulenza Adesine Invasine Enterotossine Citotossine

DNA batterico E. coli virulento

Plasmidi

Endotossina (LPS)

Endotossina o LPS

Attività tossica dei batteri ENDOTOSSINE

ESOTOSSINE

NATURA CHIMICA

Lipopolisaccaride(mw = 10kDa)

Proteine (mw = 501000kDa)

Relazione con la cellula batterica

Parte della membrana esterna

Estracellulare, diffusibile

Termoresistenza

si

no

ANTIGENICITA

SI

SI

FORMAZIONE DI TOSSOIDI

No

SI

POTENZA

Relativamente bassa (>100μg) Relativamente alta (1 μg)

SPECIFICITA

bassa

alta

ATTIVITA ENZIMATICA

No

solitamente

PIROGENICITA

SI

occasionalmente

Fattori di virulenza dello Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus è un patogeno molto versatile Siti di infezione e malattie provocate da S. aureus

PATOGENICITA’ DI S.AUREUS • Lo S. aureus è causa di lesioni superficiali della pelle quali: • • • •

Impetigine Ectima Infezioni dei follicoli dei capelli Infezione secondaria delle ferite della pelle

• Sindrome di desquamazione cutanea da stafilococco • Sindrome da shock tossico • Scarlattina da stafilococco

Inoltre lo S. aureus è in grado di determinare infezioni più gravi come:

polmonite mastite flebite meningite infezioni del tratto urinario osteomielite endocardite Lo S. aureus è una causa importante di infezioni ospedaliere; è anche causa di intossicazioni alimentari dovute al rilascio di enterotossine negli alimenti.

Esotossine batteriche TOSSINE PRODOTTE DA S.AUREUS α-tossina: shock settico β, δ-tossina: ruolo sconosciuto

γ-tossina e leucocidina: la prima emolitica, la seconda necrotica Enterotossine: emesi TSST-1: shock tossico ET: sindrome da desquamazione cutanea

POSSIBILI FATTORI DI VIRULENZA ESPRESSI DURANTE LA PATOGENESI DI ALCUNE INFEZIONI DI Staphylococcus aureus

FOLLICOLITE Colonizzazione: adesine Invasione: Invasine: stafilochinasi Altri enzimi (proteasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, elastasi. ecc.) Resistenza alla fagocitosi: coagulasi, leucocidine Resistenza alla risposta immune: coagulasi Azione tossica: tossine citotossiche (emolisina e leucocidine)

POLMONITE

Colonizzzione: adesine Invasione: Invasine: stafilochinasi, ialuronidasi Altri enzimi (proteasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, elastasi. ecc.) Resistenza alla fagocitosi: coagulasi, leucocidina, emolisina, carotenoidi, superossidodismutasi, catalasi, crescita a basso pH Resistenza alla resposta immune: coagulasi, variazione antigenica Azione tossica: Tossine citotossiche (emolisine e leucocidine)

I POSTULATI DI KOCH Critiche

• Alcuni microrganismi patogeni non sono coltivabili • Poiché alcuni patogeni crescono solo in un ospite umano, il loro studio richiederebbe la sperimentazione sull’uomo • Alcune specie commensali possono avere un ruolo patogeno • …. • …..

Chiave molecolare

1. L’inattivazione dei gene o dei geni sospettati del carattere di virulenza deve fare diminuire la virulenza in modo sostanziale 2. La sostituzione del gene mutato con il gene originario ripristina la virulenza 3. Il gene /i geni per il fattore/fattori di virulenza deve essere espresso durante la patogenesi 4. Gli anticorpi diretti contro il prodotto del gene hanno un’azione protettiva

DIFESA SPECIFICA CARATTERISTICHE DEL SISTEMA IMMUNITARIO • SPECIFICITA’ • MEMORIA • CAPACITA’ DI DISCRIMINARE TRA SELF E NON SELF

NON IMMEDIATAMENTE DISPONIBILE

SISTEMA IMMUNITARIO

Immunità cellulomediata LINFOCITI T

Immunità umorale

LINFOCITI B

Sistema immunitario

Immunità umorale Linfociti B

Plasmacellule

Immunità cellulo-mediata Linfociti T Regolazione

ANTICORPI

Produzione di Interleuchine

CITOTOSSICITA’

Caratteristiche degli antigeni

• Alto peso molecolare ( proteine, zuccheri) • Complessità chimica • Non-self Molecole o strutture microbiche con caratteristiche antigeniche: LPS, flagelli, pili, peptidoglicano, capside, esotossine ecc.

Caratteristiche della difesa costitutiva e della difesa immunitaria

Difesa costitutiva Antigene independente Immediatamente disponibile

Non specifico  Nessuna memoria

Difesa immunitaria Antigene dipendente Periodo di adattamento Specifico Sviluppo di memoria immunitaria

Anatomia del sistema immunitario

Ruolo dei Macrofagi nella risposta immune

I macrofagi sono cellule APC (Antigen Presenting cell)

Macrofagi=APC cellule presentanti l’antigene

IMMUNITA’ CELLULO -MEDIATA • Linfociti TH (CD4)

TH1: ATTIVAZIONE DEI MACROFAGI E DELLE CELLULE NATURAL KILLER

TH2: ATTIVAZIONE IMMUNITA’ UMORALE

• Linfociti Tc (CD8): Linfociti citotossici • distruzione delle cellule infette • rigetto trapianti • distruzione delle cellule tumorali

I linfociti T CD8-citotossici- possono interagire direttamente con l’antigene

LINFOCITI T CD8 CITOTOSSICI

IMMUNITA’ UMORALE

ANTICORPI

Struttura degli anticorpi • Catena leggera:

Disulfide bond

– VL & CL

Carbohydrate

– Catena pesante CL

– VH & CH1 - CH3 (o

VL

CH4)

CH2

CH1 VH

Hinge Region

Regione cerniera

CH3

Classi delle Immunoglobuline • • • • •

IgG – catene pesanti Gamma IgM - catene pesanti Mu IgA - catene pesanti Alpha IgD - catene pesanti Delta IgE - catene pesanti Epsilon

Rapporto tra Struttura/Funzione negli anticorpi

Fab sito di legame per l’antigene

Sito di legame del Sito di legame per i recettori del frammento Fc

Complemento Frammento FC

Risposta primaria Risposta secondaria

Sistema del complemento

Complesso MAC Membrane Attack Complex

Citotossicità cellulamediata anticorpo dipendente ADCC

Superantigene prodotto da S.aureus

Stimolazione incontrollata dei linfocitiT

artificiale

IMMUNIZZAZIONE ATTIVA

naturale

IMMUNIZZAZIONE PASSIVA naturale naturale