Proses Triming Organ, Dehidrasi,.docx

PROSES TRIMING ORGAN, DEHIDRASI, CLEARING, & INFILTRASI PARAFIN PENDAHULUAN Latar Belakang Mikroteknik atau teknik histologi ini akan dipelajari ilmu atau seni untuk mempersiapkan organ, jaringan atau bagian yang lainnya untuk dapat diamati dan dipelajari dengan lebih teliti. Pada umumnya untuk melihat jaringan atau organ ini dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada dasarnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Suatu spesimen mikroteknik dapat merupakan sebagian ataupun keseluruhan dari struktur yang ditetapkan. Selain diletakkan pada kaca preparat, spesimen tadi umumnya dilindungi dengan kaca penutup yang direkatkan di atas spesimen (Alyas 2010). Preparat histologi memiliki kegunaan untuk mempelajari struktur normal jaringan, diagnosa penyakit, mempelajari peran sel atau jaringan, dan mengetahui perubahan pada suatu sel atau jaringan. Tahapan pembuatan preparat histologi dimulai dari koleksi organ-fiksasi-trimming organ-dehidrasi-clearing-infiltrasi parafin-blocking-trimming block-staining. Pada laporan ini kami membahas tentang trimming organ,dehidrasi,clearing, dan infiltrasi paraffin. Trimming berfungsi untuk memotong preparat histologi agar bisa dimasukan kedalam kaset blok. Dehidrasi bertujuan untuk menghilangkan kandungan air yang terdapat dalam preparat histologi biasanya menggunakan alkohol. Clearing bertujuan menghilangkan larutan pengdehidras (alkohol) dengan menggunakan larutan xylol. Infiltrasi paraffin bertujuan memasukkan paraffin cair ke dalam jaringan. Tujuan Praktikum Mahasiswa/mahasiswi dapat mengetahui jenis larutan dehidrasi dan clearing. Dapat mengetahui cara dan mampu melakukan triming organ, dehidrasi, clearing, dan infiltrasi parafin.

METODE Tempat dan Waktu

Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah fume hood, blade, pinset, cassette block, pensil, basket, tissue prosessor, tissue embedding console, cetakan blok paraffin dan cold plate embedding console. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah jaringan yang telah difiksasi, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95%, alkohol absolut, xylol absolut, paraplast dan gliserin. Prosedur Percobaan Trimming Organ Sampel yang telah difiksasi dipotong pada bagian yang diinginkan menggunakan blade. Pemotongan sample dilakukan dengan ukuran lebar 0,5cm dan panjang 1-2cm. Pemotongan ini dilakukan di dalam fume hood agar bau larutan tidak tercium langsung oleh manusia. Sayatan jaringan yang telah didapat diletakkan dalam cassette block yang telah diberi label, pengisian cassette block maksimal diisi tiga sampel. Setelah trimming selesai cassette block disimpan di dalam basket sebelum dilakukkan proses dehidrasi dan clearing. Dehidrasi Dehidrasi dilakukan di dalam alat Tissue prosessor yang terdiri dari lima tabung berisi alkohol dan xylol, alat ini akan memindahkan jaringan dari tabung yang satu ke tabung lainnya dengan otomatis sesuai waktu yang telah diatur. Jaringan akan direndam dengan menggunakan larutan alkohol bertingkat. Pertama direndam dalam alkohol 80% selama 24 jam. Kedua, jaringan direndam dalam alkohol 90% selama 24 jam. Ketiga, jaringan direndam dalam alkohol 95% selama 24 jam. Keempat, jaringan direndam dalam alkohol absolut selama 1 jam. Clearing Alat yang digunakan untuk clearing sama seperti alat untuk dehidrasi yaitu Tissue prosessor prinsipnya sama hanya saya larutan yang digunakan berbeda yaitu dengan merendam jaringan kedalam xylol agar jaringan menjadi jernih dan transparan. Proses clearing ini merupakan proses lanjutan dari dehidrasi, dari empat tabung untuk dehidrasi dan satu tabung untuk proses clearing. Pada tabung kelima, jaringan direndam dalam xylol absolut selama 1 jam.

Infiltrasi Paraffin Pertama tissue embedding console disiapkan terlebih dahulu ketika organ telah memasuki larutan Xylol absolut atau kira-kira 2 jam sebelum embedding. Paraffin yang akan digunakan disiapkan untuk proses embedding menggunakan paraplast ataupun paraffin block dan dimasukkan kedalam Cryo Console. Cetakan blok paraffin dilumasi dengan menggunakan gliserin agar tidak lengket. Cetakan yang sudah disiapkan diisi dengan paraffin cair sampai paraffin cembung. Sampel di masukkan dalam paraffin dengan menggunakan pinset hangat, kemudian ditutup dan diisi parafin kembali sampai penuh. Setelah jaringan ditanam, paraffin didinginkan di atas cold plate embedding console agar paraffin membeku. Penutup dilepaskan, parafin yang berisi organ dapat dipotong dengan mikrotom.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar 1 Persiapan Trimming Organ

Proses setelah fiksasi yaitu trimming. Trimming merupakan penyayatan suatu organ untuk membuat sebuah permukaan organ tipis dengan ketebalan yang telah ditentukan. Pisau yang digunakan untuk trimming adalah scalpel no 22-24. Trimming organ bertujuan untuk memisahkan bagian organ yang akan diamati yang akan dijadikan sebagai preparat. Biasanya proses ini dilakukan didalam ruangan kaca yang tertera pada Gambar 1 yang dilengkapi “exhaust hood” untuk menyedot dan membuang bau formalin keluar. Pada saat dilakukan penyayatan sesuai dengan Gambar 1, penyayatan harus sesuai dengan serat bagian yang akan kita amati, yaitu arah sayatan vertical, melintang (khusus organ yang berongga) dan sayatan menyamping. Apabila ada sayatan yang abnormal, sayat pada bagian abnormal untuk dapat dilihat kerusakan organ yang akan diamati nanti. Organ yang telah di trimming, dimasukan pada alat yang bernama cassete. Banyak organ yang dimasukkan pada alat tersebut yaitu maksimal tiga organ. Macam tissue cassete pun disesuaikan dengan jenis potongan dan besar atau kecilnya potongan organ yang diinginkan. Keuntungan dari tempat organ tersebut yaitu organ yang akan kita simpan pada cassete akan tetap pada posisinya, kelemahannya jika kita meletakkan organ lebih dari tiga pada cassete, akan mengganggu proses selanjutnya yaitu pada saat pemotongan menggunakan alat mikrotom pemotongan tidak merata dan jaringannya bertumpuk sehingga sulit untuk membedakan antara satu dengan yang lain. Hasil dari proses trimming adalah organ yang akan dibuat preparat histologi sudah terpotong bagian khusus

yang ingin diteliti dan ditempatkan pada cassete blok untuk dilakukan proses selanjutnya. Prosesing jaringan bertujuan untuk menghilangkan air dari jaringan dan mengganti dengan media yang dapat membeku atau keras untuk memungkinkan yang tipis dapat dipotong atau jaringan dapat dipotong sangat tipis. Dehidrasi merupakan proses yang bertujuan untuk mengeluarkan kandungan air dalam jaringan dengan menggunakan medium tertentu (parafin atau zat lainnya) yang digunakan untuk membuat blok prerparat dapat mengganti atau mengisi tempat air di dalam jaringan atau menyerap masuk ke dalam jaringan, Hal ini mencegah agar air tidak dapat bercampur dengan cairan (Zulham 2009). Jaringan biologis sendiri harus didukung dalam matriks keras untuk memungkinkan bagian yang cukup tipis. Dehidrasi adalah suatu proses atau cara untuk mengurangi atau menghilangkan air dari dalam sel atau jaringan. Dehidrasi merupakan proses yang dilakukan sebelum melakukan penjernihan atau clearing. Dehidrasi berfungsi mencegah terjadinya kerusakan jaringan atau preparat yang berakibat terjadinya pembusukan. (Ika Rochdjatun Sastrahidaya 2014). Reagen yang digunakan pada proses dehidrasi yaitu alkohol, sukrosa 20%, metil alkohol atau spiritus. Tahapan dehidrasi dilakukan setelah proses fiksasi dengan merendam jaringan kedalam alkohol bertingkat secara berturut-turut dengan menggunakan alkohol 80% selama 3 jam, dilanjutkan dengan alkohol 90% selama 3 jam, dilanjutkan dengan alkohol 95% selama 3 jam dan terakhir dengan alkohol 100% selama 1 jam. Tujuan dilakukan secara bertingkat untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin (Subowo 2009). Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus dikembalikan ke dehidran.

Gambar 2 Dehidrasi dan Clearing

Proses ini menggunakan mesin dehidrasi, yang memiliki dua tipe yakni otomatis dan manual. Kelebihan menggunakan tipe otomatis, tidak perlu menunggu semalaman untuk memindahkan dari tabung 1 ke tabung yang lainnya dengan cara mengatur waktu yang kita inginkan seperti pada Gambar 2. Berbeda dengan tipe manual, dimana kita sebagai pengamat harus menunggu dan memindahkan tabung tersebut selama 1 malam. Clearing merupakan proses penjernihan jaringan dengan menggunakan larutan xylol yang dapat mendesak keluar larutan alkohol dari suatu

jaringan/organ dan menggantikan suasana jaringan/organ dalam larutan xylol. Clearing yang belum sempurna membuat jaringan/organ masih mengandung air, sehingga tidak dapat memperlihatkan struktur dari morfologi secara jelas. Cairan yang digunakan yaitu xylol. Xylol merupakan larutan dengan indeks refraksi tinggi serta cepat menarik alkohol, namun untuk mendapatkan hasil penjernihan maksimal, diperlukan waktu perendaman dalam xylol selama semalam (Sumanto 2014). Clearing dilakukan dengan perendaman pada xylol absolut dengan bantuan alat Tissue prosessor seperti yang terlihat pada Gambar 2. Ketika organ dimasukkan dalam xylol tidak boleh terlalu lama karena akan memberikan warna kehitaman pada organ. Waktu proses clearing tergantung pada tebal jaringan/ besar kecilnya jaringan, konsentrasi jaringan, macam zat fiksasi yang dipakai, dan sifat clearing agent yang dipakai. Perendaman xylol bila terlalu lama bisa merapuhkan jaringan sehingga tidak disarankan penggunaan xylol dalam waktu yang lama. Perendaman xylol jika terlalu lama menyebabkan jaringan menjadi kering, rapuh, dan getas sehingga hasil akhir dari pembuatan sediaan tidak akan bertahan lama (Prawiranegara 2015). Zat yang sering digunakan adalah xylol, tapi bisa juga dipakai zat lain seperti benzol, benzene, chloroform, cedar wood oil, dan methyl benzoat. Pertimbangan dalam memilih zat clearing adalah cepat dalam menghilangkan alkohol, mudah dihilangkan untuk proses infiltrasi, tidak merusak jaringan, tidak mudah terbakar, tidak beracun, dan harga zat tersebut. Kelebihan xylol dibandingkan bahan clearing lainnya adalah umum digunakan, murah, bekerja cepat, dan membuat jaringan cepat menjadi transparan. Namun xylol memiliki kekurangan yaitu menyebabkan pengerutan jaringan yang dibuat, pengekerutan jaringan ini dapat mengakibatikan tidak sempurnanya dalam tahapan. Metode parafin termasuk metode irisan yang paling sering digunakan. Pengamatan mikrokopis dari jaringan normal maupun yang mengidap penyakit (patologis) akan lebih baik hasilnya bila dilakukan dari preparat jaringan yang dilakukan penyayatan cukup tipis sehingga berbagai elemen jaringan lebih mudah diamati. Metode paraffin memiliki kelebihan dan kekurangan dibandingkan metode yang lain. Kelebihan metode parafin antara lain irisan yang dihasilkan lebih tipis dibandingkan dengan metode yang lain. Irisan yang dihasilkan juga bersifat mudah dipraktekkan, dan prosesnya lebih cepat (Suntoro 2008) Kekurangan metode parafin antara lain jaringan menjadi keras dan mudah patah, tidak bisa digunakan untuk jaringan besar, dan sebagian enzim pada jaringan akan larut. Pembuatan sediaan dengan metode parafin memerlukan langkah-langkah yang harus dikerjakan dengan urut agar dihasilkan sediaan yang dapat diamati dan dipelajari sesuai tujuan pembuatan sediaan (Suntoro 2008)

Infiltrasi adalah suatu proses memasukkan paraffin lunak secara sedikit demi sedikit kedalam jaringan atau preparat yang akan diamati dengan beberapa tahapan yang masih bercampur dengan xilol. Untuk memudahkan proses infiltrasi paraffin kedalam jaringan ,menggunakan alkohol dari konsentrasi rendah ke

konsentrasi tinggi (Ika Rochdjatun Sastrahidaya 2014). Cara melakukan Infiltrasi paraffin yaitu dilakukan dengan merendam organ ke dalam cetakan blok yang sudah diisikan paraffin cair dalam suhu hangat seperti yang terlihat pada Gambar 3. Menurut Dasumiati (2008), dalam proses infiltrasi paraffin, sebaiknya jangan dimasukan langsung dari zat penjernih kedalam paraffin murni, tetapi sebaiknya sebelum paraffin murni, jaringan dimasukan terlebih dahulu kedalam campuran antara paraffin dan penjernih (paraffin:xylol) dengan volume perbandingan yang sama. Hal ini dimaksudkan agar menghindari perubahan lingkungan yang sangat mendadak terhadap jaringan tersebut sehingga jaringan dapat mengkerut karena tertarik secara maksimal. Jaringan tidak dimasukkan langsung ke paraffin murni setelah proses clearing juga bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan clearing yang menempel pada jaringan dengan memasukkan jaringan dalam campuran larutan paraffin dan xylol. Sehingga pada saat jaringan dimasukkan dalam parafin murni, jaringan sudah benar-benar bebas dari bahan clearing. Jika bahan clering masih terdapat pada jaringan atau organ maka dapat mengganggu proses infiltrasi paraffin. Jaringan atau organ setelah proses clearing dan langsung dimasukkan dalam parafin murni juga diperbolehkan. Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi waktu dalam proses. Namun, jaringan atau organ harus benar-benar tidak mengandung bahan clearing supaya infiltrasi paraffin berjalan dengan baik. Terdapat beberapa jenis parafin yang dapat digunakan, pertama adalah jenis soft parafin. Paraffin jenis ini memiliki titik leleh 50-52oC/53-55 oC. kelebihan dari soft parafin adalah membuat organ tidak mudah rapuh. Paraffin ini biasa digunakan untuk jaringan embrional yang memiliki sifat jaringan tebal. Kedua adalah jenis hard paraffin yang memiliki titik leleh 56-58 oC/60-68 oC, paraffin ini digunakan untuk jaringan keras yang memiliki sifat jaringan tipis. Ketiga adalah jenis paraplast merupakan campuran parafin dan polimer plastik yang memiliki titik leleh 56-58 oC. Keuntungan memakai paraplast adalah sifat paraffinnya lebih elastis sehingga tidak mudah sobek ketika dipotong dengan mikrotom dan dapat dipotong lebih mudah, tidak menyerap air yang cukup, dan tekanan jaringan sedikit. Beberapa hal yang harus diperhatikan terkait dengan proses infiltrasi paraffin adalah temperatur harus tetap hangat dan tidak boleh terlalu panas, hal ini dimaksudkan agar parafin tetap dalam kondisi cair dan jaringan tidak rusak jika temperatur hangat. Parafin yang digunakan harus meleleh sempurna supaya jaringan atau organ tertutup sempurna oleh parafin. Parafin cair yang dilelehkan sudah beberapa hari yang lalu dan disimpan dalam suhu hangat lebih baik daripada parafin yang baru saja dilelehkan, hal ini karena parafin sudah meleleh sempurna dan sangat baik untuk digunakan. Jaringan atau organ harus dipastikan bersih dari sisa cairan penjernih, karena sisa larutan penjernih dapat mengkristal dan saat dipotong dengan mirkotom dapat membuat suatu organ mudah rusak. Cetakan blok parafin disesuaikan ukurannya dengan jaringan atau organ, tidak boleh terlalu rapat atau terlalu longgar. Hal ini supaya organ mudah dipotong dan merata pemotongannya jika tidak terlalu rapat, juga untuk efisiensi tempat jika cetakan yang digunakan pas (tidak terlalu longgar).

Pengisian jaringan atau organ dalam paraffin harus rata (tidak ada yang menonjol disebagian organ). Hal ini dimaksudkan supaya jaringan atau organ tertutup oleh paraffin secara sempurna dan mudah pada saat dilakukan pemotongan. Selain itu agar jaringan atau organ tidak rusak karena semua bagian sudah tertutup oleh paraffin.

SIMPULAN Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa trimming organ dilakukan dalam alat fume hood dengan menyayat bagian organ secara hati-hati. Dehidrasi dilakukan dalam alat tissue processor dengan bahan alkohol bertingkat mulai dari 80%, 90%, 95%, dan 100%. Clearing dilakukan dalam alat tissue processor dengan bahan xylol absolut. Infiltrasi parafin dilakukan dalam suhu hangat, alat yang digunakan dalam keadaan hangat, dan dilakukan dengan cepat.

DAFTAR PUSTAKA Alyas, A. 2010. Praktikum Pembuatan Preparat Menggunakan Metode Parafin. Makassar (ID) : Universitas Hasanuddin. Dasumiati. 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Jakarta (ID): Prodi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah.. Prawiranegara, FA. 2015. Mikroteknik Clearing (Penjernihan) Preparat. Medan (ID): Fakultas Keguruan Ilmu Pendidikan Universitas Islam Sumatera Utara. Sastrahidaya, IR. 2014. Medium Buatan untuk Penelitian Penyakit tubuhan dilaboratorium. Malang (ID):UB Press. Subowo. 2009. Imunobiologi. Edisi 2. Jakarta(ID): Penerbit Sagung Seto. Sumanto D. 2014. Belajar Sitohistoteknologi Untuk Pemula. Semarang(ID) : IAKIS. Suntoro. 2008. Metode Pewarnaan Histologi dan Histokimia. Jakarta: Bhratara Karya Aksara. Zulham. 2009. Histoteknik Biomedik. Medan (ID): Departemen Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara.