Praktikum 5.docx

LAPORAN PRAKTIUKUM BIOTEK DASAR PRAKTIKUM V PCR (polimerase chain reaction)

OLEH

NAMA STAMBUK KELOMPOK ASISTEN

: CRASILIA YANTI PADANG : F1E117033 : I (SATU) : LILIANA

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALU OLEO KENDARI 2018

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulangulang. Proses yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR. Metode

PCR

sangat

sensitif,

sehingga

dapat

digunakan

untuk

melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari sekelompok sekuen genom. Proses PCR membutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase yaitu enzim yang mengkatalisis reaksisintesis rantai DNA, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. PCR (Polymerase Chain Reaction) mempunyai langkah-langkah yang diulang untuk suatu siklus tertentu yaitu Denaturasi DNA yang merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya

berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal pada suhu 94-95oC, annealing yang merupakan proses penempelan primer primer pada segmen tertentu DNA menggunakan suhu spesifik (suhu spesifik ini didapatkan dari nilai - Tm primer dikurangi 5o C) dimana fragmen DNA akan diperbanyak, dan pemanjangan primer (Extention) yang merupakan proses perpanjangan DNA primer pada suhu 72oC dengan waktu yang digunakan selama 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda (Yusuf, 2010). Berdasarkan uraian tersebut, maka dilakukanlah praktikum bioteknologi modern tentang pencetakkan DNA menggunakan PCR. B. Rumusan Masalah Rumusan masalah pada praktikum kali ini adalah sebagai berikut. 1.

Apa saja komponen-komponen PCR?

2.

Bagaimana tahapan-tahapan dalam proses PCR?

3.

Bagaimana indikator keberhasilan dalam proses PCR?

C. Tujuan Tujuan pada praktikum kali ini adalah sebagai berikut. 1. Untuk mengetahui komponen-komponen PCR. 2. Untuk mengetahui tahapan-tahapan dalam proses PCR. 3. Untuk mengetahui indikator keberhasilan dalam proses PCR. D. Manfaat

Tujuan pada praktikum kali ini adalah sebagai berikut. 1. Untuk mengetahui komponen-komponen PCR. 2. Untuk mengetahui tahapan-tahapan dalam proses PCR. 3. Untuk mengetahui indikator keberhasilan dalam proses PCR.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. PCR (sebagai Polymerase Chain Reaction ) Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA. PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali, setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya (Hasibuan, 2015). B. Komponen-komponen PCR Komponen PCR meliputi modifikasi jumlah DNA yaitu 0,5 μl, 1 μl, 2 μl dan 4 μl. Optimasi dilakukan dengan menggunakan Hot Start dan DreamTaq Green sebagai Taq PCR. Total volume reaksi PCR yang digunakan adalah 50 μl. Komponen PCR yang juga sangat menentukan keberhasilan dari amplifikasi PCR adalah DNA template. DNA template yaitu untai DNA yang dijadikan sebagai cetakan untuk melipatgandakan jumlah untai DNA target, dalam hal ini adalah sekuen gen matK cpDNA. DNA template yang digunakan memiliki konsentrasi 50-100 ng (Masruroh, 2013).

C. Tahapan PCR Proses PCR secara umum berlangsung dalam tiga tahap, yakni tahap denaturasi, tahap penempelan (annealing), dan tahap pemanjangan (extension). Tahap denaturasi dilakukan dengan menaikkan suhu hingga suhu 93 – 94oC dan bertujuan untuk memecah DNA target dari dua untai menjadi untaian DNA tunggal yang saling terpisah. Tahap annealing dilakukan pada suhu 50 – 60oC setelah tahap denaturasi dan bertujuan agar primer menempel pada DNA target. Tahap extension berlangsung pada suhu 72oC setelah tahap annealing dan bertujuan agar enzim polimerase dapat melakukan sintesis sehingga berlangsung proses pemanjangan untaian DNA baru (Prayoga, 2015). D. Faktor yang Mempengaruhi PCR Faktor penting yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi DNA ada pada tahap annealing, jika suhu terlalu tinggi dapat mendegradasi primer sehingga dapat terjadi mispriming, sedangkan jika suhu terlalu rendah maka DNA yang terbentuk memiliki spesifisitas rendah. Optimasi suhu annealing pada proses PCR penting untuk dilakukan agar amplifikasi DNA dapat berjalan secara optimal. Faktor-faktor lain yang lebih penting adalah deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), oligonukleotida primer, DNA cetakan (template), komposisis larutan buffer, jumlah siklus reaksi, enzim yang digunakan, dan faktor teknis dan non teknis lainnya seperti kontaminasi (Wardani, 2017).

E. Kelebihan PCR PCR memiliki keunggulan yaitu mampu melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga mencapai 109 kali lipat. Oleh karena itu, adanya kontaminasi dalam jumlah sangat sedikit sekalipun dapat mengakibatkan terjadinya kesalahan dengan menghasilkan produk amplifikasi yang tidak diharapkan 10. Amplikon, atau hasil amplifikasi DNA dengan PCR dapat dilihat setelah melalui teknik elektroforesis. PCR memiliki keunggulan yaitu mampu melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga mencapai 109 kali lipat. Oleh karena itu, adanya kontaminasi dalam jumlah sangat sedikit sekalipun dapat mengakibatkan terjadinya kesalahan dengan menghasilkan produk amplifikasi yang tidak diharapkan. Amplikon, atau hasil amplifikasi DNA dengan PCR dapat dilihat setelah melalui teknik elektroforesis. DNA amplikon diberi pewarnaan dengan ethidium bromida yang akan berfluoresens ketika dipaparkan pada sinar UV level medium dengan panjang gelombang 300nm dari UV transilluminator (Feranisa, 2016).

III. METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat Praktikum ini dilaksanakan pada hari Sabtu, 28 April 2018 pukul 13.00selesai WITA yang bertempat di Laboratorium Unit Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Halu Oleo, Kendari. B. Bahan Praktikum Bahan yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 1. Tabel 1. Bahan dan Kegunaan No. Nama Bahan Satuan 1 2 3 1. DNA cetakan µL 2. Master mix (dNTP, buffer µL PCR, DNA polymerase, dan MgCl2 3. Primer (reverse dan µL forward) 4. Akuades (ddH2O) µL 5. Gel Agarose µL 6. TAE µL 7. EtBr µL 8. Loading dye µL

Kegunaan 4 Sebagai objek amplifikasi DNA Sebagai reagen PCR (mengandung komponen PCR Sebagai bahan PCR menentukan target perpanjangan rantai DNA Sebagai bahan pelarut Untuk visualisasi DNA Sebagai larutan pemendar Sebagai pewarna DNA Sebagai pemberat DNA

C. Alat Praktikum Alat yang digunakan pada praktikum ini tercantum pada Tabel 2. Tabel 2. Alat dan kegunaan No. 1 1. 2.

Nama Alat 2 Mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) Spindown

Jumlah 3 1 1

Kegunaan 4 Untuk mengamplifikasi DNA Untuk mengendapkan atau menyatukan larutan

Tabel 2. Lanjutan 1 3.

2 Sentrifuge

3 1

4. 5.

Tabung effendorf Mikropipet

7 1

6.

Yellow tip

-

7. 8.

Handscun Kuvet

1 1

9 10. 11.

Spektrofotometer Erlenmeyer Hot plate

1 1 1

12 13

Sumuran dan sisir Set elektroforesis

1 1

14. 15 16.

Photoporesis Alat tulis Kamera

1 1 1

4 Untuk memisahkan larutan berdasarkan berat molekulnya Untuk menyimpan larutan sampel Untuk memindahkan larutan dalam volume kecil (µL) secara akurat Untuk mengambil larutan dengan volume 0,1 ml Untuk melapisi tangan saat bekerja Untuk menyimpan sampel yang akan di absorbansi Untuk mengetahui nilai absorbansi sampel Untuk wadah pembuatan gel agarose Untuk memanaskan bahan pembuatan gel agarose Untuk wadah pencetak gel agarose Untuk migrasi DNA berdasarkan berat molekul Untuk memvisualisasikan pita DNA Untuk menuliskan hasil pengamatan Untuk mengambil gambar hasil pengamtan

D. Prosedur Kerja Prosedur kerja pada praktikum ini adalah sebagai berikut: 1. Pelaksanaan PCR a. Memasukkan 5 µL master mix ke dalam tabung eppendorff (0,5 mL). Lalu menambahkan 3 µL dH 2 O b. Menambahkan primer reverse dan forward masing-masing 0,5 µL c. Menambahkan 1 µL sampel DNA (DNA template) sehingga volume total dalam tabung eppendorff mencapai 10 µL d. Menghomogenkan sampel dengan vortex pada 1000 rpm selama 9 detik (setiap 3 detik tabung di angkat) e. Melakukan sentrifuge sampel dengan menggunakan spindown f. Memasukkan tabung eppendorff campuran sampel ke dalam alat PCR

g. Melakukan setting-an alat untuk kondisi PCR dan jumlah siklus yang dipakai sebanyak 30 siklus h. Melakukan pengujian kualitas sampel hasil PCR. 2. Elektroforesis a. Membuat gel agarose 1% (g/v), dengan cara menimbang bubuk agarosa 0,3 gram dan memasukkan bubuk agarosa tersebut ke dalam Erlenmeyer b. Menambahkan 30 mL TAE 1x kedalam Erlenmeyer berisi bubuk agarosa c. Memanaskan bahan hingga larut sempurna di atas hot plate d. Mendinginkan bahan hingga hangat-hangat kuku e. Menuangkan bahan ke wadah pencetak yang telah dilengkapi sisir membentuk sumuran f. Mendiamkan bahan hingga memadat membentuk struktur gel (gel agarosa) g. Memasukkan gel agarosa ke dalam bak elektroforesis dan menambahkan T AE 1x hingga gel agarosa terendam h. Melakukan suspensi sampel DNA dengan loading dye, kemudian memasukkannya ke dalam sumuran gel agarosa i. Melakukan elektroforesis dengan cara mengalirkan listrik 100 volt, 80 A selama 30 menit pada bak elektroforesis yang telah berisi sampel DNA j. Setelah 30 menit, merendam gel agarosa berisi sampel DNA pada larutan EtBr (Ethidium bromide) selama 5 menit, lalu merendamnya ke dalam akuades selama 3 menit. k. Melakukan pembacaan hasil elektroforesis dengan photophoresis.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan PCR (Polymerase Chain Reaction) Hasil pengamatan pada praktikum ini dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Hasil pengamatan PCR (Polymerase Chain Reaction) No 1 1

Gambar 2

Keterangan 3

1. Smear (pengotor) 2. Pita DNA 3. Agarose

1 2 3

A. Pembahasan Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi tahap denaturasi, pemisahan kedua untai DNA pada temperatur tinggi. Prinsip umum kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim. Menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Cara untuk mendapat potongan DNA, diperlukan primer yang berfungsi untuk menandai dimana ujung DNA yang akan

digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu Primer forward untuk menandai ujung depan untai DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari ujung belakang. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Komponen-komponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA temlpate yaitu untai DNA yang dijadikan sebagai cetakan untuk melipatgandakan jumlah untai DNA target, dalam hal ini adalah sekuen gen matK cpDNA, primer yaitu suatu potongan atau sequencedari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dan senyawa bufer (Joko, 2011). Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu

pra-denaturasi DNA

templat, denaturasi DNA template pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Penempelan primer pada templat (annealing), pada tahap ini Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target. Pemanjangan primer (extension) dan

pemantapan

(postextension) (Handayono, 2000). Praktikum inimenggunakan bahan yaitu sampel DNA, Master mix (dNTP, buffer PCR, DNA polymerase, dan MgCl2) yang digunakan sebagai reagen PCR mengandung komponen PCR. Primer (reverse dan forward) Sebagai bahan PCR

menetukan target perpanjangan rantai DNA. Akuades (ddH2O) sebagai bahan pelarut. Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur kemudian dihomogenkan dengan vortex pada 1000 rpm selama 9 detik (setiap 3 detik tabung di angkat), setelah itu melakukan sentrifuge sampel dengan menggunakan spindown. Selanjutnya memasukkan tabung eppendorff campuran sampel ke dalam alat PCR, kemudian mensetting alat untuk kondisi PCR dan jumlah siklus yang dipakai sebanyak 30 siklus. Melakukan pengujian kualitas sampel hasil PCR dengan elektroforesis. Sampel hasil PCR di masukan kedalam sumuran pada agarrose yang dibuat dengan menggunakan sisir, kemudian Melakukan elektroforesis dengan listrik 100 volt, 80 A selama 30 menit pada bak elektroforesis yang telah berisi sampel DNA, lalu merendamnya ke dalam aquadest selama 3, dan setelah direndam

dilanjutkan

dengan

pembacaan

hasil

elektroforesis

dengan

photophoresis , kemudian mengambil gambar hasil photophoresis berupa pita-pita DNA yang berpendar. Berdasrkan hasil pengamatan gambar hasil photophoresis tidak terdapat pita-pita DNA yang berbendar. PCR yang dilakukan pada praktikum ini gagal karena beberapa faktor seperti kualitas bahan yang digunakan sudah lama tidak terpakai sehingga berpengaruh dan beberapa faktor lain. Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR yaitu, konsentrasi dan kualitas DNA, temperatur annealing dari kedua primer, konsentrasi MgCl2, enzim polimerase, konsentrasi dan kualitas primer, jumlah siklus PCR, konsentrasi dNTP, dan materi pendukung lainnya. Keberhasilan reaksi PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor yaitu deoksiribonukleotida triphosphat (dNTP), oligonukleotida primer, DNA template

(cetakan), komposisi larutan buffer, jumlah siklus reaksi, enzim yang digunakan, dan faktor teknis dan non-teknis lainnya, misalnya kontaminasi. Oligonukleotida primer (desain primer) memegang peranan penting untuk spesififisitas maksimal dan efisiensi PCR (Sasmito, 2014).

V. PENUTUP

A. Simpulan Simpulan pada praktikum ini adalah sebagai berikut: 1. komponen utama PCR yaitu DNA cetakan,

Oligonukleotida primer,

Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dan komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. 2. Tahapan PCR yaitu Denaturasi yang merupakan tenik pemisahan DNA, Annealing (penempelan primer) yang merupakan teknik penempelan DNA, dan Pemanjangan Primer (Extention) 3. Indikator keberhasilan pada proses PCR adalah terdapat produk yang berupa pita DNA. B. Saran Saran saya pada praktikum ini adalah: 1. Untuk praktikan agar lebih memperhatikan ketika asisten mejelaskan mengenai praktikum yang dilaksanakan 2. Untuk asisten, terima kasih atas bimbingannya sehingga kami dapat berhasil melakukan percobaan ini. 3. Untuk laboratorium, agar terus dijaga kebersihannya.

DAFTAR PUSTAKA

Handoyo, P., Rudiretna, A., 2000, Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR), Jurnal Unitas, 9(1): 18 Hasibuan, E., 2015, Peranan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) terhadap Perkembangan Ilmu Pengetahuan, Skripsi, Universitas Sumatra Utara Joko, T., Kusumandari, N., Hartono, D., 2011, Optimasi Metode PCR untuk Deteksi Pectobacterium Carotovorum, Penyebab penyakit Busuk Lunak Anggrek, Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2): 54-59. Masruroh, S., Fitmawati., Sofiyanti, N., 2013, Optimasi Aplifikasi PCR Sekuen Gen matK cpDNA pada Tanaman Mangga, Jurnal Repository, 1(1): 1-5 Prayoga, W., Wardani, A. K., 2015, Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi Salmonella, Jurnal Pangan dan Agroindustri, 3(2): 384-488 Sasmito, D. E. K., Kurniawan, R., Muhimmah, I., 2014, Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Sekuensing DNA, Skripsi, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta. Wardani, A. K., Arliansyah, A., Fauziah, A., Fa’ida, T. N., 2017, Identifikasi Gen Transgenik pada Produk Susu Bubuk Kedelai dari Susu Formula Soya dengan Metode PCR, Jurnal Agritech, 37(3): 237-245. Yusus, Z. K., 2010, Polymerase Chain Reaction (PCR), Jurnal Saintek, 5(6): 1-3

LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Hari/Tanggal

: Sabtu, 28 April 2018

Judul Praktikum

: PCR (Polymerase Chain Reaction) 1. Untuk mengetahui cara penggunaan Polymerase Chain Reaction (PCR). 2. Untuk mengetahui cara polymerase DNA. Tujuan Praktikum :

Hasil Pengamatan

:

Tabel 3. Hasil pengamatan elektroforesis produk PCR No. 1 1.

Gambar Pengamatan 2

Keterangan

Literatur 3

4 1. Sumuran 2.Smear/ pengotor 3. Produk PCR 4. Agerose

1

3 2 4

(Gagal)