Presentación Tesis - Control De Calidad De Vacunas Contra La Enfermedad De Newcastle, Mediante Pruebas De Esterilidad Y Titulación De Virus

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERÍAS BIOLÓGICAS Y QUÍMICAS PROGRAMA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Control de Calidad de vacunas monovalentes, vivas, nacionales y extranjeras, contra la Enfermedad de Newcastle, mediante pruebas de Esterilidad y Titulación de virus, 2008. Presentado por: REBECCA D. DELGADO MCCULLOUGH Para optar el título profesional de: MÉDICO VETERINARIO Y ZOOTECNISTA

I. Introducción

El presente trabajo de investigación tiene la finalidad de constatar la calidad de las vacunas monovalentes, vivas, nacionales y extranjeras, contra la enfermedad de Newcastle, mediante pruebas de esterilidad y titulación de virus.

Descripción del problema No tenemos una evaluación constante de la calidad de estas vacunas, no solo libres de patógenos sino su capacidad inmunogénica, por lo que no podemos estar completamente seguros de que las empresas productoras de las vacunas sigan cumpliendo con las normas de calidad y lo que indica su etiqueta en cada lote que producen.

Justificación  Aspecto

General: La EN, como otras enfermedades de las aves, en nuestro país constituye un riesgo similar al de una bomba de tiempo para la avicultura comercial, pudiendo afectar a los productores avícolas. Por tal razón se han implementado agresivos programas de vacunación, que han ayudado a disminuir considerablemente estos brotes.

 Aspecto

Tecnológico: El uso de pruebas de esterilidad y titulación en vacunas contra la EN son técnicas altamente confiables para controlar la calidad y asegurar que un producto contiene la cantidad de antígeno establecido en la orden de producción.

 Aspecto

Social: Teniendo en conocimiento la calidad de las vacunas, permitiéndose tomar medidas para modificar el programa de vacunación de ser necesario, obteniéndose una inmunización más eficaz, se está beneficiando a los productores avícolas, disminuyendo un poco su preocupación, obteniendo una mejor calidad de vida.

 Aspecto

Económico: La manifestación clínica de esta enfermedad tiene un importante impacto económico, no sólo por el incremento en la mortalidad, la conversión alimenticia o el aumento en el número de aves retrasadas, sino por las implicaciones en la movilización y comercialización que comprometen la viabilidad económica, no sólo de una empresa sino de toda una región y de un país.

Importancia La importancia del presente trabajo radica en el conocimiento de la calidad para verificar que un producto está libre de microorganismos viables contaminantes y el reconocimiento de la cantidad de partículas virales presentes en la vacuna.

Objetivo General Determinar mediante pruebas de esterilidad y titulación de virus la calidad de las vacunas monovalentes, vivas, contra la Enfermedad de Newcastle.

Objetivos Específicos Constatar que las vacunas se hallan libres de contaminantes bacterianos y fúngicos.

Asegurar que las vacunas contienen la cantidad de antígeno establecido en la orden de producción.

Planteamiento de la Hipótesis Dado que las vacunas de uso avícola contra la Enfermedad de Newcastle contienen antígenos inmunogénicos, es probable probar su calidad.

II. MARCO TEÓRICO

Las cepas del virus de Newcastle varían ampliamente en cuanto a la severidad de la enfermedad que pueden provocar en las aves. Una de las propiedades más características de las cepas diferentes del virus es su enorme variación respecto a la patogenicidad para los pollos.

Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la base de los signos clínicos observados en los pollos infectados. Estos son:  Velogénico viscerotrópico  Velogénico neurotrópico  Mesogénico  Lentogénico o respiratorio  Entérico asintomático

Distribución Geográfica La EN se considera endémica en muchos países. La vacunación profiláctica se practica en casi todos los países productores de aves de corral a escala comercial.

Etiología La EN es causada por el Paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un serotipo del género Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramixovyrinae, familia Paramyxoviridae.

Epidemiología

Parece probable que la gran mayoría de las aves sea susceptible a la infección con virus de la EN, tanto de virulencia alta como de virulencia baja para los pollos, aunque los signos clínicos observados en aves infectadas con el virus varían ampliamente y dependen de factores como: el virus especie hospedadora edad estrés medioambiental estado inmune infección con otros organismos

Bajo algunas circunstancias la infección con los virus extremadamente virulentos puede provocar una mortalidad repentina alta con signos clínicos relativamente escasos. Así que los signos clínicos son variables y están influidos por otros factores de modo que ninguno puede considerarse patognomónico.

Patogenia La variación extrema de la virulencia de los diferentes aislamientos víricos de la EN y el uso generalizado de vacunas vivas implica que la identificación de un aislamiento como virus de la EN a partir de aves que muestren signos clínicos no confirma un diagnóstico, por lo que también se requiere una valoración de la virulencia del aislado.

Una valoración definitiva de la virulencia del virus se basa habitualmente en una o más de las siguientes pruebas in vivo:  Tiempo medio de muerte en huevos  Índice de patogenicidad intracerebral  Índice de patogenicidad intravenosa

Técnicas de Diagnóstico La demostración de la presencia del virus con múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 confirma la presencia de virus virulentos o potencialmente virulentos, pero la falta de detección de virus o la detección de virus de la EN sin múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 empleando técnicas moleculares no confirma la ausencia de virus virulentos.

Identificación del Agente  Muestras

para el aislamiento vírico: Las muestras procedentes de aves muertas deberían consistir en frotis oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmón, riñones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hígado y corazón. Las muestras de aves vivas deberían incluir tanto frotis traqueales como cloacales (cubiertas de material fecal).

Se colocan las muestras en solución salina isotónica tamponada con fosfato (PBS), ph 7.0 a 7.4, que contenga antibióticos. Las suspensiones deberían procesarse tan pronto como fuera posible después de una incubación durante 1 a 2 horas, a temperatura ambiente. Cuando es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4ºC hasta 4 días.

 Cultivo

del virus: Los líquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante la clarificación por centrifugación durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no exceda los 25ºC se inoculan en volúmenes de 0.2ml en la cavidad alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos embrionados de aves SPF de 9 a 11 días de incubación.

Después de la inoculación, se incuban de 35 a 37ºC durante 4 a 7 días. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos cuando surgen, y todos los huevos que permanezcan hasta el final del período de incubación, deberían enfriarse primero a 4ºC y probar los líquidos alantoideos para detectar actividad de hemaglutinación. Los líquidos que den una reacción negativa deberían ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.

 Identificación

del virus: El virus de la EN puede confirmarse empleando antisuero específico en una prueba de inhibición de la hemaglutinación. Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el virus de la EN y algunos otros APMVs pueden causar algunos problemas que pueden resolverse empleando controles adecuados de antígeno y antisuero.

 Prueba

Pruebas Serológicas

de hemaglutinación

 Prueba

de inhibición de la hemaglutinación

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves incorporándolas en el agua de bebida, administrándose como un spray grueso o mediante instilación conjuntival o intranasal. Algunas cepas mesogénicas se obtienen por inocuación intradérmica en la membrana del ala.

Se han preparado vacunas que dan resultados óptimos mediante la aplicación por vías específicas. En general, las vacunas vivas más inmunogénicasson más virulentas y, por tanto, es más probable que causen efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la vacunación con la cepa La Sota causará problemas considerablemente mayores en aves susceptibles jóvenes que la cepa B1, aunque La Sota induce una respuesta inmune más fuerte.

Las vacunas inactivadas se consideran más caras que las vacunas vivas y su empleo entraña la manipulación e inyección de aves individuales. Se preparan a partir de líquido alantoideo al que se inactiva su infectividad mediante la adición de formaldehído o β-propiolactona. Se incorpora en una emulsión con aceite mineral y se administra por vía intramuscular o subcutánea.

Así las aves individuales reciben una dosis estándar. No se produce la propagación subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias adversas. Como después de la administración no se produce la multiplicación vírica, se requiere una cantidad de antígeno para la inmunización mucho mayor que en el caso de la vacunación con virus vivos.

La duración de la inmunidad depende del programa de vacunación elegido. Una de las consideraciones más importantes que afectan a los programas de vacunación es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jóvenes que pueden variar considerablemente de granja en granja, de lote a lote y entre pollos individuales.

Por esta razón se emplean diversas estrategias…  Las aves no se vacunan hasta las 2-4 semanas de vida cuando la mayoría de ellos será susceptible.  Se vacunan con 1 sólo día de vida por instilación conjuntival o mediante la aplicación de un spray grueso. Se establecerá una infección activa en algunas aves que persistirá hasta que la inmunidad maternal decrezca. Entonces se llevará a cabo una revacunación 3-4 semanas más tarde.

Cuando se diseña un programa de vacunación, debe tenerse en cuenta el tipo de vacuna utilizada, el estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de protección requerido en relación a cualquier posibilidad de infección con el virus de campo bajo las condiciones locales.

Por ejemplo:  Cuando la enfermedad es leve y esporádica: 1 día de edad → vacuna viva B1 (conjuntival o spray) 18-21 días de vida → viva B1 o La Sota (agua de bebida) 10 semanas de vida → viva La Sota (agua de bebida) en momento de la puesta → vacuna inactivada (emulsión de aceite)

 Cuando

la enfermedad es severa y más extendida: 1 día de edad → vacuna viva B1 (conjuntival o spray) 18-21 días de vida → viva B1 o La Sota (agua de bebida) 35-42 días de vida → viva La Sota (spray o agua de bebida) 10 semanas de vida → vacuna inactivada o viva mesogénica en el momento de la puesta → vacuna viva inactivada o viva mesogénica

Control del inóculo 

Características del inóculo: El primer principio a considerar cuando se selecciona una vacuna viva del virus de la EN es si se va a usar como vacuna primaria o secundaria, siendo su patogenicidad la principal consideración. Los métodos de applicación y frecuencia de uso son consideraciones válidas. El uso de Mab ha demostrado una variación considerable en la antigenicidad de cepas diferentes. Esto puede indicar la necesidad de adaptar las vacunas más cuidadosamente a virus antigénicamente relacionados con cualquier virus de campo predominante.

La consideración más importante en la selección de un inóculo para preparar una vacuna inactivada es la cantidad de antígeno producida cuando crece en huevos embrionados; raramente es rentable concentrar el virus. Se han usado tanto cepas virulentas como lentogénicas para preparar vacunas inactivadas, pero las primeras ofrecen un riesgo innecesario porque supone la manipulación de grandes cantidades de virus virulentos así como el peligro de una inactivación inadecuada y la posible contaminación consiguiente.

 Método

de cultivo: Se establece un inóculo de trabajo. Si la cepa se ha clonado mediante dilución limitante o selección en placa, el establecimiento de un cultivo maestro sólo puede implicar la producción de un gran volumen de líquido alantoideo infectivo (mínimo 100ml), que puede conservarse en forma de alícuotas liofilizadas (0.5ml).

 Validación

como vacuna: A los virus del inóculo de origen desconocido se les debe realizar pases a través de huevos SPF y ser clonados antes de producir el inóculo original. También puede ser conveniente algún pase a través de pollos SPF. En cualquier caso, después de su preparación, del inóculo original se debería comprobar su esterilidad, seguridad, potencia y presencia de agentes extraños.

Método de producción Para la producción de la vacuna, primero se establece un inóculo de trabajo, a partir de cualquiera de los lotes de la vacuna producidos, mediante la expansión de una alícuota del inóculo original hasta un volumen suficiente para permitir la producción de la vacuna durante 12 a 18 meses. Es mejor conservar el inóculo de trabajo de forma líquida a una temperatura de -60ºC o inferior porque el virus liofilizado no siempre se multiplica hasta un título alto en el primer pase subsiguiente.

Las vacunas de virus vivo deben producirse en huevos SPF. El método de producción es la propagación de virus a gran escala; todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad.

Es habitual diluir el inóculo de trabajo en PBS estéril, pH 7.2, de modo que aproximadamente se inoculan 103-104 EID50/0.1ml en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios SPF de 9 ó 10 días de vida. A continuación se incuban a 37ºC. Se deberían desechar los huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El tiempo de incubación dependerá de la cepa vírica utilizada y se predeterminará para asegurar una producción máxima con el número de muerte de embriones.

Los huevos infectados deberían enfriarse a 4ºC antes de recogerse. Se quitan las partes superiores de los huevos y se aspiran los líquidos alantoideos después de la eliminación del embrión. Debería evitarse la inclusión de cualquier resto de yema o de albúmina.

Se deberían conservar todos los líquidos inmediatamente a 4ºC y comprobar la ausencia de contaminación bacteriana antes de preparar grandes cantidades para la liofilización o inactivación. Normalmente, las vacunas vivas se liofilizan. La metodología depende de los aparatos utilizados y de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa muy importante ya que una liofilización inadecuada resulta tanto en pérdidas de título como en un período de validez reducido.

En la producción de vacunas inactivadas, se trata el líquido alantoideo recogido con folmaldehído (una concentración final típica es 1/1000) o β-propiolactona (una concentración final típica es 1/2000 a 1/4000). El tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que esté libre de virus vivos. La mayoría de vacunas inactivadas no se concentran, el líquido alantoideo normalmente se emulsiona con aceite mineral o vegetal.

Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan como emulsiones primarias de agua en aceite. Habitualmente, la fase oleosa consiste en nueve volúmenes de aceite mineral altamente refinado, más un volumen de agente emulsionante. La fase acuosa es el virus inactivado al que se le adiciona un emulsionante no uónico. Normalmente la relación fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4.

Los fabricantes se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la viscosidad y la estabilidad. Si la viscosidad es demasiado alta, la vacuna será difícil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es inestable.

Control del proceso Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su viabilidad y potencia. Para aquellas producidas en huevos, el control más importante del proceso es comprobar la ausencia de contaminación bacteriana y fúngica. Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de inactivación en huevos embrionados, tomando 25 alícuotas (0.2ml) de cada lote y realizando pases cada tres veces a través de embriones SPF.

Control de lotes Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para conseguir que se administren los niveles adecuados de virus. Habitualmente se titula el virus en huevos embrionados de aves hasta conseguir la EID50. Esto implica realizar diluciones a la décima del virus; se inoculan 0.1ml de cada dilución en 5 a 7 huevos embrionados de aves de 9-10 días de vida.

Después de 5 a 7 días de incubación a 37ºC, los huevos se enfrían y se prueban para demostrar su actividad hemaglutinante, que es una indicación de la presencia del virus vivo.

 Esterilidad:

Se define como la ausencia de organismos vivos. Se logra por calentamiento, filtración, mediante tratamiento con óxido de etileno o por radiaciones ionizantes, y realizando asépticamente cualquier proceso posteior. Cada lote de vacuna debe superar una prueba de esterilidad, además debe superar pruebas adecuadas para demostrar que la vacuna está exenta de virus contaminados (ensayos en cultivos celulares, pruebas sobre huevos embrionados).

 Inocuidad:

El uso de pollos para la comprobación de las vacunas supone la inoculaciónde 10 ó más aves SPF. Se administran 10 dosis de vacuna viva vía supraconjuntival a cada ave y a continuación las aves se mantendrán en observación durante 21 días. Ningún pollo debería morir por causas atribuibles a la vacuna.

En el caso de vacunas inactivadas, se administrará una dosis doble por la vía recomendada a 10 aves de 3 semanas de edad y se mantendrán en observación durante 2 semanas para comprobar la ausencia de signos clínicos de enfermedad o lesiones locales.

 Potencia:

Para las vacunas vivas, se vacunan 20 aves SPF, empleando la dosis mínima recomendada. Después de 14-21 días, cada ave vacunada y 10 aves control se desafían por vía IM con 105 LD50 del virus de desafío de la EN. La vacuna para la prueba si al cabo de 10 días el 90% de los pollos vacunados sobrevive sin síntomas de enfermedad, pero todos los controles mueren en 6 días.

Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF de 21-28 días. Se inyectan vía IM 3 grupos de 20 aves con volúmenes de vacuna equivalentes a 1/25, 1/50 y 1/100 de una dosis. Se mantiene un grupo de 10 pollos como control. Se desafían todas las aves mediante inyección IM de 106 LD50 del virus de desafío de la EN, 17-21 días más tarde. Se observan los pollos durante 21 días. La prueba sólo es válida si todas las aves control de desafío mueren en 6 días. La vacuna cumple con la prueba si la PD50 no es menos de 50 por dosis y si el límite de confianza menor no es menos de 35 PD por dosis.

 Duración

de la inmunidad: El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis única o régimen de vacunación de la EN, variará enormemente tanto con la vacuna como con la especie hospedadora. Generalmente, se debería hacer una evaluación de la longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regímenes de vacunación para mantener éstos por encima de un nivel aceptable.

 Estabilidad:

El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, debería mantener su potencia durante al menos 1 año. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como la reducción de la infectividad seguida de la incubación a 37ºC durante 7 días, pueden utilizarse como una guía para las capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva.

Las vacunas en emulsión de aceite, también deberían someterse a un agente acelerador mediante almacenamiento a 37ºC, durante un mínimo de 1 mes, sin separación de las fases acuosa y oleosa. Las vacunas con virus vivos deben emplearse inmediatamente después de su reconstitución. Las vacunas inactivadas no se deben congelar.

 Conservantes:

Para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el producto liofilizado, pero los conservantes antimicrobianos pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la vacuna.

 Precauciones

(riesgos): Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los humanos. Se ha informado que los virus de la EN, tanto los virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado a humanos, causando normalmente conjuntivitis aguda después de la introducción al ojo. Habitualmente, las infecciones son transitorias y no afectan a la córnea.

Las vacunas en emulsión de aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La inyección accidental de humanos debería tratarse con prontitud mediante la incisión y el lavado de la zona, como para el caso de una herida por inyección de grasa.

III. Materiales y Métodos

Materiales

 Localización

espacial:

El trabajo de laboratorio de la investigación se desarrolló instalaciones del laboratorio de animal del SENASA, localizado en Molina 1915, distrito de La Molina, de Lima, departamento de Lima.

presente en las sanidad la Av. La provincia

 Localización

temporal:

El trabajo de recolección de muestra se llevó a cabo durante los meses de Enero a Julio del 2008 y el trabajo de laboratorio se realizó dentro de los meses de Julio y Agosto del 2008.

 Material

biológico:

Vacunas monovalentes, vivas, nacionales y extranjeras contra la Enfermedad de Newcastle. Huevos libres de patógenos específicos (SPF).

 Equipo

y Maquinaria: Computadora personal Cámara digital Incubadora a 37.5ºC

Ovoscopio

Estufa de medios 23ºC

Estufa de medios

Agitador de tubos (vortex) Refrigeradora 4ºC Autoclave Cámara de bioseguridad tipo II Minitaladro

 Material

de laboratorio: Placas Petri Tubos de ensayo Propipetas Pipetas Jeringas Balones y matraces Gradillas Agua destilada estéril PBS Guantes estériles

Caldo BHI Caldo Thyoglicolato Agar TSA Agar Sangre Agar Sabouraud

Algodón Lejía Gorro Mascarillas Tijera Lápiz

Alcohol Yodo Marcador indeleble Pegamento universal Película autosellante

Métodos  Muestreo:

Procedimiento de muestreo: Se adquirirán 2 muestras de un lote de cada empresa productora de las vacunas mencionadas, siendo en total 24 muestras. A las cuales se les realizarán los

 Esterilidad:

vRetirar del refrigerador los medios y caldos de cultivo (uno por cada vacuna y un control, BHI adicional para reconstituir las vacunas) y colocarlos en la estufa a 36ºC por aproximadamente 30 minutos para temperarlos. vMarcar con plumón indeleble en cada medio y caldo la vacuna que será sembrada en cada uno.

vColocar en la cabina de bioseguridad los medios y caldos de cultivo, pipetas, jeringas, propipeta, vortex, gradilla, envase con desinfectante, algodón y alcohol. Someterlos a rayos UV por 15 minutos. v Apagar los rayos UV, retirar la tapa de la cabina, encender la corriente de aire y la luz de la cabina.

vDesinfectarse las manos con alcohol. Colocar la vacuna dentro de la cabina. vColocarse el gorro, mascarilla y guantes estériles. v Retirar el precinto de la vacuna. Cargar 5ml de agar BHI en la jeringa para reconstituir la vacuna. Observar que por presión negativa (vacío) el líquido debe absorberse rápidamente al frasco de la vacuna, y la pastilla (vacuna liofilizada) debe disolverse en aproximadamente 10 segundos lo que indica una buena liofilización de la vacuna.

vRetirar la tapa de la vacuna y con una pipeta extraer la vacuna disuelta, aplicar 1ml a cada caldo de cultivo y 0.2ml a cada medio de cultivo (colocados al borde del medio de cultivo). vHomogenizar con el vortex los caldos de cultivo en los que se acaba de sembrar.

v Con una pipeta distinta para cada vacuna y para cada medio se hace el sembrado por agotamiento, en forma de estrías. Esperar a que seque. Cada pipeta usada se coloca en el recipiente con desinfectante.

vColocar los medios de cultivo Sabouraud en la estufa de 23ºC (especial para crecimiento de hongos y levaduras), los demás medios y caldos en la estufa de 36ºC por 14 días. v Al 7mo día se realizan los pasajes de los caldos a medios de cultivo. Para lo que extraemos del refrigerador un medio de cada tipo para cada caldo de cada vacuna, más uno de cada tipo para el control.

vTemperamos los medios en la estufa a 36ºC por 30 minutos y luego con el plumón indeleble marcamos la vacuna y caldo para la que serán destinados. vColocamos en la cabina de bioseguridad los medios de cultivo, pipetas, propipeta, gradilla, vortex, envase con desinfectante, algodón y alcohol. Los sometemos a rayos UV por 15 minutos. v Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina, encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina.

vNos desinfectamos las manos y colocamos los caldos sembrados hace 7 días en la cabina. Nos colocamos el gorro, mascarilla y guantes estériles. vExtraemos con una pipeta 0.6ml de cada caldo, para colocar 0.2ml en cada medio de cultivo. v Sembramos en cada medio de la misma manera descrita anteriormente. Esperar a que seque.

vColocamos el medio Sabouraud en la estufa de 23ºC, y los demás medios y caldos en la estufa de 36ºC por 7 días. v Al completarse el tiempo señalado se revisan todos los caldos y medios de cultivo. Los caldos deben verse traslúcidos y no debe haber crecimiento de ninguna bacteria u hongo en los medios de cultivo sólidos.

 Titulación:

vApenas se reciben los huevos deben ser colocados en la incubadora a 37.5ºC. vCon el ovoscopio revisar cada huevo para verificar que el embrión esté vivo, marcar con un lápiz el límite de la cámara de aire y el lugar a perforar, volver a colocarlos en la incubadora.

v Colocar en la cabina de bioseguridad tubos de ensayo, pipetas, jeringas, gradillas, PBS, agua destilada estéril, propipetas, vortex, tijera, algodón, plumón indeleble y alcohol. Los sometemos a rayos UV por 20 minutos.

v Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina, encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina. v Nos desinfectamos las manos con alcohol. Colocamos la vacuna dentro de la cabina. Nos colocamos el gorro, mascarilla y guantes estériles.

v Se reconstituye la vacuna en un tubo de ensayo con PBS de acuerdo a la dosis de la vacuna. Ejemplo: Si la dosis indicada es de 0.03ml por ave, y el frasco es para 1000 dosis, entonces se reconstituirá con 30ml de PBS. v Por cada vacuna se tendrán 10 tubos de ensayo con 9ml de agua destilada estéril. Los tubos deben estar rotulados indicando la vacuna y dilución que les corresponderá (10-1 a 10-9).

v En el primer tubo colocar, con una pipeta, 1 ml de la vacuna reconstituida, homogenizar con el vortex. v De la primera dilución extraer 1 ml con otra pipeta y colocarlo en el siguiente tubo de ensayo, homogenizar con el vortex. Se sigue esta sucesión hasta el último tubo.

v De acuerdo al título que figura en el frasco de la vacuna se escogerá la dilución con ese título además de 2 diluciones inmediatamente superiores y 2 inmediatamente inferiores. v Vaciamos la cabina de bioseguridad y la desinfectamos con abundante alcohol.

v Colocamos nuevamente en la cabina el vortex, jeringas de 1ml, minitaladro, plumón indeleble, alcohol y algodón. Los sometemos a rayos UV por 20 minutos. v Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina, encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina.

v Nos desinfectamos las manos con alcohol, colocamos en la cabina las diluciones a usar en cada vacuna y los huevos. Nos colocamos otros guantes estériles. v Rociamos los huevos con alcohol, cubriendo la zona a perforar. Con el plumón indeleble marcar cada huevo con la vacuna y la dilución que le será inoculada. Se inoculan 5 huevos por cada dilución y se reserva 1 huevo control por cada dilución.

v Con el minitaladro se perforará en el lugar marcado previamente con lápiz, se deberá tener mucho cuidado de sólo perforar la cáscara, NO LA CUTÍCULA.

v Se homogeniza con el vortex la primera dilución a inocular, con una jeringa se extrae 1 ml de la dilución. Se inyecta 0.2ml de la dilución en cada huevo.

v Se repite el mismo procedimiento anterior para cada dilución. Al terminar de inocular se procede a tapar con Uhu el agujero perforado.

v Colocar los huevos nuevamente en la incubadora con la cámara de aire hacia arriba. v Se deben revisar diariamente los huevos, procurando que sea a la misma hora, y se deberán ir descartando los muertos teniendo un registro de lo que se observa cada día. v Los huevos muertos al igual que el sobrante de las vacunas deben ser colocadas en la cámara fría para su posterior incineración.

Variables de respuesta

Empresa de la que proviene la vacuna.

Presencia de contaminantes. Título adecuado.

Evaluación estadística

 Unidades

experimentales: Cada vacuna muestreada es considerada una unidad experimental.

Análisis estadístico  Análisis

de frecuencia: El análisis estadístico se desarrollará mediante la estadística descriptiva y cálculos en distribución de frecuencias.

IV. Resultados y Discusión

Características Físico-cualitativas Previamente a las pruebas de esterilidad y titulación de virus se debe observar detenidamente las características de las vacunas, con el fin de realizar un mejor control de calidad.

Cuadro Nº01. Resumen de características físicocualitativas de las vacunas muestreadas.

Gráfico Nº01. Porcentaje de uso de cepas en las vacunas muestreadas

Prueba de Esterilidad Las pruebas de esterilidad son procedimientos que forman parte del control de calidad microbiológico en manufactura y sirven para demostrar que el producto es estéril, determinando la ausencia o presencia de microorganismos contaminantes en este.

Cuadro Nº03. Resultados de la prueba de Esterilidad en medios de cultivo sólidos.

Cuadro Nº04. Resultados de la prueba de Esterilidad en caldos de cultivo.

Titulación de virus Se realiza con el fin de determinar el contenido viral de cada una de las vacunas y, por ende, controlar la cantidad de antígeno a aplicar a cada ave para producir los anticuerpos necesarios para lograr la inmunización, y no ocasionar la muerte del animal.

Cuadro Nº06. Comparación entre el título obtenido en la prueba realizada y el que figura en el frasco de las vacunas contra la EN.

Cuadro Nº07. Tabla frecuencial de cumplimiento del título que figura en el frasco de las vacunas muestreadas.

Gráfico Nº02. Porcentaje de cumplimiento del título que figura en el frasco de las vacunas muestreadas.

V. Conclusion es

1. Todas las vacunas muestreadas aprobaron satisfactoriamente el análisis físico-cualitativo al que fueron sometidas. 2. En la prueba de Esterilidad, las 12 vacunas, que representan el 100% de las muestras analizadas, no presentaron ningún signo de contaminación al no existir crecimiento microbiológico (bacterias u hongos) en ninguno de los medios y caldos en los que fueron sembradas.

3. En la Titulación de virus, 6 vacunas, que representan el 50% de las muestras, no cumplieron con el título indicado por el fabricante, siendo la diferencia con ese mismo muy pequeña aún así no cumplen lo que figura en el frasco. Sólo 4 vacunas, representando el 33% de las muestras tituladas, cumplieron el título indicado en su etiqueta; y 2 vacunas, representando el 17% de las muestras, no indicaban el título de la vacuna en el frasco, imposibilitando así el control de calidad del título del virus.

VI. Recomendacion es

1. Se sugiere realizar controles de calidad a cada lote de cada empresa productora de vacunas contra esta y otras enfermedades aviares. 2. Complementar estas pruebas con otras de control de calidad, tales como inocuidad, pureza o potencia.

3. Realizar pruebas de las vacunas en las aves de corral para probar la efectividad y respuesta a la vacuna. 4. Se sugiere que todos los laboratorios tengan como norma indicar el título de la vacuna en el frasco.

Muchas gracias!