Control De Calidad De Vacunas Monovalentes, Vivas, Nacionales Y Extranjeras, Contra La Enfermedad De Newcastle, Mediante Pruebas De Esterilidad Y Titulación De Virus

I.

INTRODUCCIÓN

1.1. Enunciado del problema Control de calidad de vacunas monovalentes, vivas, nacionales y extranjeras, contra la enfermedad de Newcastle, mediante pruebas de esterilidad y titulación de virus. 1.2. Descripción del problema No tenemos una evaluación constante de la calidad, no sólo libre de patógenos sino su capacidad inmunogénica, por lo que no podemos estar completamente seguros de que las empresas productoras de las vacunas sigan cumpliendo con las normas de calidad y lo que indica su etiqueta en cada lote que producen. 1.3. Justificación del trabajo 1.3.1. Aspecto General La EN, como otras enfermedades de las aves, en nuestro país constituye riesgo de presentación similar a una bomba de tiempo para la avicultura comercial, la que puede explotar en cualquier momento y afectar a los productores avícolas, si no se tomaran las medidas preventivas adecuadas para contrarrestar dicha posibilidad.

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En Latinoamérica han sucedido en los últimos años brotes severos con esta enfermedad, por tal razón se han implementado agresivos programas de vacunación los que han ayudado a disminuir considerablemente estos brotes. 1.3.2. Aspecto Tecnológico El uso de pruebas de esterilidad y titulación en vacunas contra la EN son técnicas altamente confiables para controlar la calidad y asegurar que un producto contiene la cantidad de antígeno establecido en la orden de producción. 1.3.3. Aspecto Social Teniendo en conocimiento la calidad de las vacunas, mediante las pruebas de esterilidad y títulos antigénicos, permitiéndose tomar medidas para modificar el programa de vacunación de ser necesario, obteniéndose una inmunización más eficaz, se está beneficiando a los productores avícolas, reduciendo probablemente los índices de mortalidad en las aves, disminuyendo un poco su preocupación, obteniendo una mejor calidad de vida. 1.3.4. Aspecto Económico La manifestación clínica de esta enfermedad tiene un importante impacto económico, no sólo por el incremento en la mortalidad, la conversión alimenticia o el aumento en el número de aves retrasadas,

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sino por las implicaciones en la movilización y comercialización que comprometen la viabilidad económica, no sólo de una empresa sino de toda una región y de un país. 1.3.5. Importancia La importancia del presente trabajo radica en el conocimiento de la calidad para verificar que un producto está libre de microorganismos viables contaminantes y el reconocimiento de la cantidad de partículas virales presentes en la vacuna. 1.4. Objetivos 1.4.1. Objetivo General Determinar mediante pruebas de esterilidad y titulación la calidad de las vacunas monovalentes, vivas, contra la EN. 1.4.2. Objetivos específicos Mediante la prueba de esterilidad, constatar que las vacunas se hallan libres de contaminantes bacterianos y fúngicos. Mediante la titulación, asegurar que las vacunas contienen la cantidad de antígeno establecido en la orden de producción. 1.5. Planteamiento de la hipótesis Dado que las vacunas de uso avícola contra la enfermedad de Newcastle contienen antígenos inmunogénicos, es probable probar su calidad.

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II.

MARCO TEÓRICO O CONCEPTUAL

2.1.Análisis bibliográfico Las cepas del virus de Newcastle varían ampliamente en cuanto a la severidad de la enfermedad que pueden provocar en las aves. Las cepas menos patógenas pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por la presencia de otros organismos o mediante condiciones ambientales adversas. El método preferido de diagnóstico es el aislamiento del virus y su subsiguiente caracterización. Una de las propiedades más características de las cepas diferentes del virus de la EN es su enorme variación respecto a la patogenicidad para los pollos. Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la base de los signos clínicos observados en los pollos infectados. Estos son: 1. Velogénico viscerotrópico: es muy patogénica en la que se observan frecuentemente lesiones intestinales hemorrágicas; 2. Velogénico neurotrópico: se presenta con mortalidad elevada, habitualmente seguida de signos respiratorios y nerviosos; 3. Mesogénico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos ocasionales pero baja mortalidad; 4. Lentogénico o respiratorio: se presenta con una infección respiratoria leve o subclínica; 5. Entérico asintomático: normalmente consiste en una infección entérica subclínica.

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Raramente los agrupamientos en patotipos son claros, e incluso en infecciones de aves SPF, se puede apreciar un considerable encubrimiento. Además, puede tener lugar una exacerbación de los signos clínicos inducida por las cepas más benignas si se superponen infecciones de otros organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales adversas. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endémica en muchos países. La vacunación profiláctica se practica en casi todos los países productores de aves de corral a escala comercial. ETIOLOGÍA La EN es causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un serotipo del género Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los paramixovirus aislados procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas serológicas en nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el virus de la EN se ha denominado APMV-1. (Blood y Radostis, 1996) EPIDEMIOLOGÍA Parece probable que la gran mayoría de las aves sea susceptible a la infección con virus de la EN tanto de virulencia alta como de virulencia baja para los pollos, aunque los signos clínicos observados en aves infectadas con el virus de la EN varían ampliamente y dependen de factores tales como: el virus, la especie hospedadora, la edad del

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hospedador, la infección con otros organismos, el estrés medioambiental y el estado inmune. Bajo algunas circunstancias la infección con los virus extremadamente virulentos puede provocar una mortalidad repentina alta con signos clínicos relativamente escasos. Así que los signos clínicos son variables y están influidos por otros factores de modo que ninguno puede considerarse patognomónico.

Incluso en los hospedadores susceptibles, tales como los pollos, los virus de la EN muestran un rango considerable de virulencia. Generalmente, la variación consiste en grupos alrededor de los dos extremos en pruebas utilizadas para valorar la virulencia, pero, por diversas razones, algunos virus pueden mostrar virulencia intermedia.

La variación enorme en la virulencia y en los signos clínicos implica la necesidad de definir cuidadosamente lo que constituye la EN para los propósitos de comercio, políticas y medidas de control. (Ocadiz, 1998)

PATOGENIA La variación extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos víricos de la EN y el uso generalizado de vacunas vivas implica que la identificación de un aislamiento como virus de la EN a partir de aves que muestren signos clínicos no confirma un diagnóstico de la EN, por lo que también se requiere una valoración de la virulencia del aislado. Se investigan por parte de varios grupos en todo el mundo varias pruebas in

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vitro potenciales para establecer la virulencia normalmente relacionada con la base molecular de la patogenicidad. Hasta la fecha, una valoración definitiva de la virulencia del virus se basa habitualmente en una o más de las siguientes pruebas in vivo, aunque la definición actual de la OIE permite una valoración molecular de la virulencia:

•

Tiempo medio de muerte en huevos i)

Se diluye el líquido alantoideo infectivo, estéril y fresco en solución salina estéril para preparar diluciones decimales en serie comprendidas entre 10-6 y 10-9.

ii)

Para cada dilución se inocula 0.1ml en la cavidad alantoidea de cada uno de los cinco huevos embrionados de aves SPF de 910 días de edad y entonces se incuban a 37ºC.

iii)

Las diluciones víricas restantes se mantienen a 4ºC y se inoculan otros cinco huevos con 0.1ml de cada dilución 8 horas más tarde y se incuban a 37ºC.

iv)

Cada huevo se examina dos veces al día durante 7 días y se registran los tiempos a los que muere cada embrión.

v)

La dosis letal mínima es la dilución vírica más alta que causa la muerte de todos los embriones inoculados por ella.

vi)

El tiempo medio de muerte (MDT) es el tiempo en horas en el que la dosis letal mínima provoca la muerte de todos los embriones inoculados.

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vii)

El MDT se ha utilizado para clasificar las cepas del virus de la EN dentro de los grupos siguientes; velogénico (tarda menos de 60 horas en matar); mesogénico (tarde entre 60 y 90 horas en matar); y lentogénico (tarda más de 90 horas en matar).

•

Índice de patogenicidad intracerebral i)

El líquido alantoideo infectivo y fresco con un título HA>24 (>1/16) se diluye 1/10 en solución salina isotónica estéril sin aditivos, tales como antibióticos.

ii)

Se inyectan por vía intracerebral 0.05ml del virus diluido en diez polluelos procedentes de huevos de un grupo de aves SPF. En el momento de la inoculación, estos polluelos deben tener más de 24 horas y menos de 48 horas.

iii)

Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 días.

iv)

En cada observación, las aves se puntúan: 0 si es normal, 1 si está enferma, y 2 si está muerta. (Los individuos muertos deben puntuarse como 2 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la muerte).

v)

El índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la puntuación media por ave y por observación durante el período de 8 días.

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Los virus más virulentos presentarán índices que se aproximan a la puntuación máxima de 2.0, mientras que las cepas lentogénicas presentarán valores próximos a 0.0.

•

Índice de patogenicidad intravenosa i)

El líquido alantoideo infectivo recogido en fresco (que no debería tener más de 24-48 horas y que debería demostrarse que está exento de contaminación bacteriana) con un título HA>24 (>1/16) se diluye 1/10 en solución salina isotónica estéril.

ii)

Se inyecta por vía intravenosa 0.1ml del virus diluido en diez pollos SPF de seis semanas.

iii)

Se examinan las aves a intervalos de 24 horas durante 10 días y se anota con el siguiente score cada observación: 0 si es normal, 1 si está enferma, 2 si está paralizada o muestra algunos signos nerviosos, y 3 si está muerta. (Los individuos muertos deben puntuarse como 3 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la muerte).

iv)

El índice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuación media por ave y por observación durante el período de 10 días.

Las cepas lentogénicas y algunas cepas mesogénicas tendrán valores IVPI de 0, mientras que los índices de las cepas virulentas se aproximarán a 3.0.

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Se han recomendado algunas variaciones en estas pruebas. El muestreo de la cloaca y de la conjuntiva de pollos de 8 semanas con líquido alantoideo no diluido se ha sustituido por la prueba IVPI. La intención es distinguir entre los virus velogénicos viscerotrópicos y velogénicos neurotrópicos.

•

Interpretación de los índices de patogenicidad No resulta sencilla la interpretación de los índices de patogenicidad obtenidos con vistas a un comercio impositivo, o a restricciones en el movimiento u otras políticas. El objetivo es controlar las cepas que son significativamente más virulentas que las cepas lentogénicas, tales como la Hitchner-B1 o La Sota. Como los virus capaces de producir una enfermedad bastante severa pueden tener valores IVPI de 0, se utiliza la prueba ICPI con más frecuencia para tales valoraciones. Sin embargo, como en esta prueba cepas diferentes muestran un rango de valores desde 0.00 hasta 2.00, está claro que cualquier valor utilizado para definirlas debe regirse por el sentido práctico.

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO En el diagnóstico de la EN es importante entender que la demostración de la presencia del virus con múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0 confirma la presencia de virus virulentos o potencialmente virulentos, pero la falta de detección de virus o la detección de virus de la EN sin múltiples aminoácidos básicos en el punto de escisión de F0

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empleando técnicas moleculares no confirma la ausencia de virus virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en una misma población estén mezclados virus virulentos y avirulentos, implica que todavía será necesario el aislamiento del virus y una valoración in vivo de la virulencia. (Merck, 2004) IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE a) Muestras para el aislamiento vírico Cuando las investigaciones de la EN son el resultado de la aparición de la enfermedad severa y mortalidad elevada en grupos de aves, es corriente intentar el aislamiento del virus a partir de aves muertas recientemente o aves moribundas que se sacrifican de forma indolora. Las muestras procedentes de aves muertas deberían consistir en frotis oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmón, riñones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hígado y corazón. Pueden ser recogidos separadamente o en conjunto, aunque, habitualmente, las muestras intestinales se procesan de forma separada de otras muestras. Las muestras procedentes de aves vivas deberían incluir tanto frotis traqueales como cloacales; las últimas deberían estar visiblemente cubiertas de material fecal. Los pájaros pequeños y delicados pueden dañarse por el muestreo pero la recogida de heces frescas puede servir como alternativa adecuada. En el caso de que sean limitadas las oportunidades de obtener muestras, es importante que se examinen los frotis cloacales (o

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fecales) y los frotis traqueales (o tejido traqueal) tanto como los órganos o tejidos más afectados o asociados con la enfermedad clínica. Las muestras deberían tomarse en las etapas tempranas de la enfermedad. Se tendrían que colocar las muestras en solución salina isotónica tamponada con fosfato (PBS), pH 7.0-7.4, que contenga antibióticos. Los antibióticos pueden variar de acuerdo a las condiciones locales, pero podría ser, por ejemplo, penicilina (2,000 unidades/ml); estreptomicina (2mg/ml); gentamicina (50µg/ml); y micostatina (1,000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a concentraciones cinco veces superiores para frotis cloacales y de heces. Es importante reajustar la solución a pH 7.0-7.4 después de la adición de los antibióticos. Las heces y los tejidos tomados finamente deberían prepararse como suspensiones al 10-20% (p/v) en la solución de antibiótico. Las suspensiones deberían procesarse tan pronto como fuera posible después de una incubación durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Cuando es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4ºC hasta 4 días.

b) Cultivo del virus Los líquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante la clarificación por centrifugación a 1,000g durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no exceda los 25ºC se inoculan en volúmenes de 0.2ml en la cavidad

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alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos embrionados de aves SPF de 9-11 días de incubación. Después de la inoculación, se incuban a 35-37ºC durante 4-7 días. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos cuando surgen, y todos los huevos que permanezcan hasta el final del período de incubación, deberían enfriarse primero a 4ºC y probar los líquidos alantoideos para detectar actividad de hemaglutinación (HA). Los líquidos que den una reacción negativa deberían ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.

c) Identificación del virus La actividad HA detectada en líquidos bacteriológicamente estériles recogidos a partir de huevos inoculados puede deberse a la presencia de cualquiera de los 15 subtipos de hemaglutininas de los virus de la gripe A o de los 8 restantes serotipos de paramixovirus. (El líquido no estéril podría contener actividad HA bacteriana). El virus de la EN puede confirmarse empleando antisuero específico en una prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI). Habitualmente se utiliza el antisuero de pollo preparado contra una de las cepas del virus de la EN. Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el virus de la EN y algunos otros APMVs, especialmente los virus de los serotipos APMV-3 y APMV-7 pueden causar algunos problemas que pueden resolverse empleando controles adecuados de antígeno y antisuero. PRUEBAS SEROLÓGICAS

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El virus de la EN puede emplearse como un antígeno en una variedad de pruebas serológicas, lo que permite que se utilicen las técnicas de neutralización

o

de

enzimoinmunoensayo

(ELISA)

para

el

diagnóstico. En la actualidad, la prueba HI es la más ampliamente utilizada. Los sueros de pollo raramente dan reacciones positivas no específicas en esta prueba y es innecesario cualquier pretratamiento de los sueros. Los sueros procedentes de especies distintas a las de los pollos a veces pueden causar aglutinación de los eritrocitos (RBC) de pollo, así que esta propiedad debería determinarse primero, y posteriormente extraer mediante adsorción del suero con RBC de pollo. Esto se realiza adicionando 0.025ml de RBC de pollo empacados a cada 0.5ml de antisueros, agitando suavemente y dejándolos durante al menos 30 minutos; a continuación los RBC se precipitan mediante centrifugación a 800g durante 2-5 minutos y se decantan los sueros adsorbidos.

En

diferentes

laboratorios

se

practican

variaciones

de

los

procedimientos para las pruebas HA y HI. Los siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulación de plástico y fondo en V en las que el volumen final para ambos tipos de prueba es de 0.075ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS isotónico (0.1 M), pH 7.0-7.2, y RBC procedentes de un mínimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen igual de solución de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre

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procedente de aves no vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al virus de la EN). Las células se deberían lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensión al 1% (células empacada v/v). Debería realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antígenos y de los antisueros.

a) Pruebas de hemaglutinación y de inhibición de la hemaglutinación Pruebas de hemaglutinación

•

i)

Se distribuyen 0.025ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en V.

ii)

A cada pocillo se adicionan 0.025ml de la suspensión vírica (p. ej. Líquido alantoideo infectivo). Para una determinación precisa del contenido de HA, se debería hacer partir de una serie de diluciones muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5, 1/7, etc.

iii)

A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensión vírica en volúmenes de 0.025ml.

iv)

Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0.025ml de PBS.

v)

En cada pocillo se dispensan 0.025ml de RBC de pollo al 1% (v/v).

vi)

La solución se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estáticos los RBC durante unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20ºC, o

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durante 60 minutos a 4ºC si las temperaturas son altas, considerando que los RBC control deberían sedimentar de una forma distinta. vii)

La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en forma de lágrima de los RBC. Debería leerse la titulación a la dilución más alta a la que se de una HA completa (sin corriente); esto representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a partir del rango inicial de diluciones.

Prueba de inhibición de la hemaglutinación

•

i)

Se dispensan 0.025ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulación de plástico y fondo en V.

ii)

Se adicionan 0.025ml de suero en el primer pocillo de la placa.

iii)

A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles de suero en volúmenes de 0.025ml.

iv)

A cada pocillo se añaden 4 HAU de virus/antígeno en 0.025ml y la placa se deja durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20ºC, ó 60 minutos a 4ºC.

v)

A cada pocillo se añaden 0.025ml de RBC de pollo al 1% (v/v) y, después de mezclar suavemente, los RBC se dejan estáticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en

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torno a 20ºC, o durante unos 60 minutos a 4ºC si las temperaturas del ambiente son altas, considerando que los RBC control deberían sedimentar de una forma distinta. vi)

El título de HI es la dilución mayor de suero que causa la inhibición completa de 4 HAU de antígeno. La aglutinación se valora inclinando las placas. Debería considerarse que muestran inhibición sólo aquellos pocillos en los que la corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los pocillos control (que contienen 0.025ml de RBC y 0.05ml de PBS).

vii)

La validez de los resultados debería evaluarse frente a un suero control negativo, que no debería presentar un título >1/4 (>22 ó >log2 2 cuando se expresa como el recíproco), y un suero control positivo para el cual el título debería encontrarse entre una de las diluciones del título conocido.

El valor de la serología en el diagnóstico está relacionado claramente con el estado inmune esperado de las aves afectadas. Los títulos de HI pueden considerarse positivos si hay inhibición a una dilución del suero de 1/16 (24 ó log2 4 cuando se expresa como el recíproco) o superior contra 4 HAU de antígeno. Algunos laboratorios prefieren usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectará a la interpretación de los resultados de modo que un título positivo será 1/8 (23 ó log2 3) o superior. Se debería incluir una nueva titulación del

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antígeno en todas las pruebas para verificar el número de HAU utilizadas. Los títulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de un grupo de aves. En grupos vacunados que estén siendo controlados serológicamente, es posible identificar respuestas anamnésicas como resultado de una infección de desafía con el virus de campo, pero se debería proceder con gran cautela porque se pueden producir variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el virus de la EN darán por resultado títulos sustancialmente elevados frente al virus de la EN. Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas de ELISA que se basan en diversas estrategias para la detección de anticuerpos contra el virus de la EN, incluyendo ELISA indirecto, tipo sándwich y de bloqueo o competitivo, que emplean MAbs. Al menos uno de los kits utiliza una subunidad antigénica. Habitualmente estas pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es importante que para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones especificadas. (OIE, 2004)

REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Las cepas víricas de la EN empleadas en las vacunas comerciales de virus vivos se encuadran en dos grupos: vacunas lentogénicas tales como

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Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 y F, y vacunas mesogénicas, tales como Roakin, Mukteswar y Komarov. Las cepas de ambos grupos han sido seleccionadas y clonadas para satisfacer los diferentes criterios en su producción y aplicación. Todos los virus de vacunas mesogénicas tienen dos pares de aminoácidos básicos en el punto de escisión F0 y valores ICPI de aproximadamente 1.4. Esto significa que las infecciones de aves con estos virus entrarían dentro de la definición propuesta para la EN, pero como estas vacunas se emplean principalmente en países donde la EN es endémica, este hecho puede que no excluya necesariamente su uso. El servicio de producción de vacunas debería operar bajo los procedimientos y prácticas apropiados de bioseguridad. Si la EN se utiliza para la producción de vacunas o para estudios de desafío de la vacuna, la parte del servicio donde se realice el trabajo debería cumplir los requisitos para los patógenos del nivel de Contención del Grupo 4 (organismos que causan enfermedades exóticas o enzoóticas, sujetos a control oficial y con alta posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio). La mayoría de vacunas con virus vivos crecen en la cavidad alantoidea de huevos embrionados de aves pero algunas, notablemente algunas cepas mesogénicas, se ha adaptado a una variedad de sistemas de cultivo de tejidos. Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves incorporándolas en el agua de bebida, administrándose como un spray grueso o mediante instilación conjuntival o intranasal. Algunas cepas mesogénicas se obtienen por inoculación intradérmica en la membrana del

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ala. Se han preparado vacunas que dan resultados óptimos mediante la aplicación de vías específicas. En general, las vacunas vivas más inmunogénicas son más virulentas y, por tanto, es más probable que causen efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la vacunación con la cepa La Sota causará problemas considerablemente mayores en aves susceptibles jóvenes que la cepa Hitchner-B1, aunque La Sota induce una respuesta inmune más fuerte. Las vacunas inactivadas se consideran más caras que las vacunas vivas y su empleo entraña la manipulación e inyección de aves individuales. Se preparan a partir de líquido alantoideo al que se inactiva su infectividad mediante la adición de formaldehído o beta-propiolactona. Se incorpora en una emulsión con aceite mineral y se administra por vía intramuscular o subcutánea. Así las aves individuales reciben una dosis estándar. No se produce la propagación subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias adversas. Se utilizan tanto cepas virulentas como avirulentas como inóculo vírico aunque, desde el punto de vista del control de la seguridad, el uso de éstas últimas parece menos adecuado. Como después de la administración no se produce la multiplicación vírica, se requiere una cantidad de antígeno para la inmunización mucho mayor que en el caso de la vacunación con virus vivos. La duración de la inmunidad depende del programa de vacunación elegido. Una de las consideraciones más importantes que afectan a los programas de vacunación es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jóvenes que pueden variar considerablemente de granja en granja, de lote a lote y entre

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pollos individuales. Por esta razón, se emplean diversas estrategias. O las aves no se vacunan hasta las 2-4 semanas de vida cuando la mayoría de ellos será susceptible, o se vacunan con 1 sólo día de vida por instilación conjuntival o mediante la aplicación de un spray grueso. Se establecerá una infección activa en algunas aves que persistirá hasta que la inmunidad maternal decrezca. Entonces, se llevará a cabo una revacunación 3-4 semanas más tarde. Se ha demostrado que las vacunas inactivadas también pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 día que tienen cierto grado de inmunidad maternal, y los mejores resultados se han obtenido cuando a los polluelos maternalmente inmunes de 1 día se les da una combinación de vacunas viva e inactivada, comparada con vacunas vivas o inactivadas dadas de forma separada. La vacunación de aves de 1 día totalmente susceptibles, incluso con las vacunas vivas más suaves, puede provocar enfermedad respiratoria, especialmente si están presentes en cantidad significativa bacterias patógenas comunes. Normalmente se practica una vacunación después de 3 semanas de vida sólo en gallinas de crianza y gallinas de puesta. Se debería llevar a cabo con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad adecuada. Los programas de vacunación emplean con frecuencia vacunas con virus vivos un poco más patogénicos para reforzar la inmunidad de las usadas inicialmente. También pueden usarse estas vacunas vivas más patogénicas después de una vacunación inicial con vacunas inactivadas en emulsión de aceite.

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Cuando se diseña un programa de vacunación, debería tenerse en consideración el tipo de vacuna utilizada, el estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de protección requerido en relación a cualquier posibilidad de infección con el virus de campo bajo las condiciones locales. Aquí se indican dos ejemplos de programas de vacunación que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de enfermedad. Para el primer ejemplo, cuando la enfermedad es leve y esporádica se sugiere que se adopte el siguiente orden de vacunación: vacuna viva Hitchner-B1 mediante administración conjuntival o de spray a 1 día de edad; vacuna viva Hitchner-B1 o La Sota a los 18-21 días de vida en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de bebida a las 10 semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsión de aceite en el momento de la puesta. Para el segundo ejemplo, cuando la enfermedad es severa y más extendida, se adopta el mismo protocolo ya indicado hasta los 21 días de vida y a esto le sigue la revacunación a los 35-42 días de vida con la vacuna viva La Sota en el agua de bebida o como spray; esta revacunación se repite a las 10 semanas de vida con una vacuna inactivada (o una vacuna viva mesogénica) y de nuevo se repite en el momento de la puesta. (Shortridge, 1982)

1. Control del inóculo a) Características del inóculo El primer principio a considerar cuando se selecciona una cepa para una vacuna viva del virus de la EN es si se va a usar como vacuna

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primaria o secundaria, siendo su patogenicidad la principal consideración. Los métodos de aplicación y frecuencia de uso son consideraciones válidas. El uso de MAb ha demostrado una variación considerable en la antigenicidad de cepas diferentes. Esto puede indicar la necesidad de adaptar las vacunas más cuidadosamente a virus antigénicamente relacionados con cualquier virus de campo predominante. Se ha introducido una vacuna viva basada en la cepa V4 del virus de la EN, seleccionada por su estabilidad al calor, para combatir los problemas específicos asociados con la crianza del pollo campero en los países en desarrollo. La intención es que esta vacuna puede estar protegida por el alimento para los pollos que se alimentan de restos. Hasta la fecha, los ensayos realizados en diferentes países han producido resultados mezclados; bien puede ser que los factores locales sean extremadamente importantes afectando al éxito de esta estrategia. Más recientemente se ha desarrollado la vacuna I2 termoestable específicamente para la vacunación de los pollos camperos; actualmente se recomienda que esta vacuna se suministre mediante gota al ojo. La consideración más importante en la selección de un inóculo para preparar una vacuna inactivada es la cantidad de antígeno producida cuando crece en huevos embrionados; raramente es rentable concentrar el virus. Se han usado tanto cepas virulentas como lentogénicas para preparar vacunas inactivadas, pero las

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primeras ofrecen un riesgo innecesario porque supone la manipulación de grandes cantidades de virus virulentos así como el peligro de una inactivación inadecuada y la posible contaminación consiguiente.

b) Método de cultivo Se establece un inóculo original y a partir del mismo un inóculo de trabajo. Si la cepa se ha clonado mediante dilución limitante o selección en placa, el establecimiento de un cultivo maestro sólo puede implicar la producción de un gran volumen de líquido alantoideo infectivo (como mínimo 100ml), que puede conservarse en forma de alícuotas liofilizadas (0.5ml).

c) Validación como vacuna A los virus del inóculo de origen desconocido se les debería realizar pases a través de huevos SPF y ser clonados antes de producir el inóculo original. También puede ser conveniente algún pase a través de pollos SPF. En cualquier caso, después de su preparación, del inóculo original se debería comprobar su esterilidad, seguridad, potencia y presencia de agentes extraños.

2. Método de producción Para la producción de la vacuna, primero se establece un inóculo de trabajo, a partir de cualquiera de los lotes de vacuna producidos,

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mediante la expansión de una alícuota del inóculo original hasta un volumen suficiente para permitir la producción de la vacuna durante 12-18 meses. Es mejor conservar el inóculo de trabajo de forma líquida a una temperatura de -60ºC o inferior porque el virus liofilizado no siempre se multiplica hasta un título alto en el primer pase subsiguiente. La mayoría de las vacunas de la EN se producen en huevos embrionados de ave y las vacunas de virus vivos deberían producirse en huevos SPF. El método de producción es la propagación de virus aséptica y a gran escala; todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad. Es habitual diluir el inóculo de trabajo en PBS estéril, pH 7.2, de modo que aproximadamente se inoculan 103-104 EID50/0.1ml en la cavidad alantoidea de huevos embrionados SPF de 9 ó 10 días de vida. A continuación se incuban a 37ºC. Se deberían desechar los huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El tiempo de incubación dependerá de la cepa vírica utilizada y se predeterminará para asegurar una producción máxima con el número de muerte de embriones.

Los huevos infectados deberían enfriarse a 4ºC antes de recogerse. Se quitan las partes superiores de los huevos y se aspiran los líquidos alantoideos después de la eliminación del embrión. Debería evitarse la inclusión de cualquier resto de yema o de albúmina. Se deberían

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conservar todos los líquidos inmediatamente a 4ºC y comprobar la ausencia de contaminación bacteriana antes de preparar grandes cantidades para la liofilización o inactivación. Normalmente, las vacunas vivas se liofilizan. La metodología depende de los aparatos utilizados y de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa muy importante ya que una liofilización inadecuada resulta tanto en pérdidas de título como en un período de validez reducido. En la producción de vacunas inactivadas, se trata el líquido alantoideo recogido con formaldehído (una concentración final típica es 1/1000) o beta-propiolactona (una concentración final típica es 1/20001/4000). El tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que esté libre de virus vivos. La mayoría de vacunas inactivadas no se concentran; el líquido alantoideo inactivado normalmente se emulsiona con aceite mineral o vegetal. Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan como emulsiones primarias de agua en aceite. Habitualmente, la fase oleosa consiste en nueve volúmenes de aceite mineral altamente refinado, tal como Marcol 52, Drakeol 6VR y BayolF, más un volumen de agente emulsinante, tal como Arlacel A, Montanide 80 y Montanide 888. La fase acuosa es el virus inactivado al que se le adiciona un emulsionante no iónico como Tween 80. Normalmente la relación fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4. Los fabricantes se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la viscosidad y la estabilidad. Si la viscosidad es demasiado alta, la

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vacuna será difícil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es inestable.

3. Control del proceso Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su viabilidad y potencia. Para aquellas producidas en huevos, el control más importante del proceso es comprobar la ausencia de contaminación bacteriana y fúngica. Esto es necesario debido a la aparición de huevos en estado de putrefacción que pueden no ser detectados hasta el momento de la recogida. Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de inactivación en huevos embrionados, tomando 25 alícuotas (0.2ml) de cada lote y realizando pases cada tres veces a través de embriones SPF.

4. Control de lotes Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para conseguir que se administren los niveles adecuados de virus. Habitualmente se titula el virus en huevos embrionados de aves hasta conseguir la EID50. Esto implica realizar diluciones a la décima del virus; se inoculan 0.1ml de cada dilución en cinco a siete huevos embrionados de aves de 9-10 días de vida. Después de 5-7 días de incubación a 37ºC, los huevos se enfrían y se prueban para demostrar

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su actividad hemaglutinante, que es una indicación de la presencia del virus vivo. La EID50 a punto final se calcula empleando una fórmula estándar tal como la de Spearman-Kärber.

a) Esterilidad La esterilidad se define como la ausencia de organismos vivos. Se logra por calentamiento, por filtración, mediante tratamiento con óxido de etileno o por radiaciones ionizantes, y realizando asépticamente cualquier proceso posterior. La ausencia de contaminación se define como la falta de seres vivos concretos. Esto se puede obtener seleccionando los materiales a partir de fuentes que carezcan de los organismos concretos y realizando asépticamente cualquier proceso posterior. Solo con un control adecuado de los materiales primarios empleados y de los procesos que se siguen, así como del almacenamiento, se puede conseguir una adecuada seguridad de esterilidad y de ausencia de contaminación. Se requiere la realización de pruebas sobre el producto para comprobar que se ha logrado este control. Los materiales originales deben obtenerse de fuentes que estén libres de contaminación y que sean manejadas de tal modo que se reduzca la contaminación y la posibilidad de que cualquier contaminante se multiplique. Los materiales que puedan esterilizarse sin que sus propiedades biológicas resulten excesivamente afectadas deben esterilizarse

28

mediante un método efectivo para tales materiales concretos. El método debe reducir el nivel de contaminación hasta que ésta sea indetectable, según determine una prueba de esterilidad adecuada. Si se emplea un procedimiento de esterilización, deberá ser validado para demostrar su conveniencia y ser controlado de modo adecuado para demostrar que ha funcionado correctamente en cada ocasión. Los materiales que no se han esterilizado y aquellos sometidos a manipulación tras la esterilización han de ser manejados asépticamente. El ambiente en que se realiza cualquier manipulación aséptica ha de mantenerse en un estado de limpieza protegido de fuentes externas de contaminación, y debe estar controlado para reducir al mínimo la contaminación interna. Los materiales de origen animal deben ser esterilizados, u obtenidos de animales sanos que, en la medida de lo posible, deberían de estar libres de patógenos que puedan transmitirse de la especie de origen a la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie en contacto con ellas, o el material debe estar exento de tales patógenos.

Los virus del inóculo inicial y los de cualquier línea celular continua empleada para el crecimiento de los virus deben estar libres de bacterias, hongos, micoplasmas, virus no relacionados y otros patógenos que puedan transmitirse de la especie de origen a

29

la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie en contacto con ellas. Cada lote de vacuna debe superar una prueba de esterilidad similar a la de métodos publicados, además debe superar pruebas adecuadas para demostrar que la vacuna está exenta de virus contaminados (tales pruebas incluyen ensayos en cultivos celulares que sean sensibles a los virus de la especie a vacunar, pruebas sobre huevos embrionados, y, cuando sea necesario, pruebas en animales). Puede ser necesaria la realización de pruebas para determinar la ausencia de algunas bacterias específicas, por ejemplo Salmonella pullorum, Mycobacterium tuberculosis y M. paratuberculosis, Brucella spp. y Leptospira spp. Algunos países exigen que cada lote de vacuna supere una prueba de ausencia de micoplasmas.

b) Inocuidad El uso de pollos para la comprobación de las vacunas supone la inoculación de diez o más aves de la edad indicada que procedan de un grupo SPF. Se administrarán diez dosis de vacuna viva por vía supraconjuntival a cada ave y a continuación las aves se mantendrán en observación durante 21 días. Ningún pollo debería mostrar signos clínicos serios y ninguno debería morir por causas atribuibles a la vacuna.

30

En el caso de vacunas inactivadas se administrará una dosis doble por la vía recomendada a diez aves de 3 semanas de edad y se mantendrán en observación durante 2 semanas para comprobar la ausencia de signos clínicos de enfermedad o lesiones locales.

c) Potencia Se han propuesto varios métodos para comprobar la potencia de las vacunas del virus de la EN. Se ha subrayado la importancia de usar una adecuada cepa de desafío para la valoración. Una cepa adecuada es la Herts 33. Para las vacunas vivas, el método recomendado supone la vacunación de 20 aves SPF u otras completamente susceptibles a la mínima edad recomendada por vía sugerida, empleando la dosis mínima recomendada. Después de 14-21 días, cada ave vacunada y diez aves control se desafían por vía intramuscular con 105 LD50 (dosis letal 50%) del virus de desafío de la EN. La vacuna para la prueba si al cabo de 10 días el 90% de los pollos vacunados sobrevive sin síntomas de enfermedad, pero todos los controles mueren en 6 días. Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF o susceptibles de 21-28 días. Se inyectan por vía intramuscular tres grupos de 20 aves con volúmenes de vacuna equivalentes a 1/25, 1/50 y 1/100 de una dosis. Se mantiene un grupo de diez pollos como control. Se desafían todas las aves mediante inyección intramuscular de 106 LD50 del virus de desafío de la EN, 17-21

31

días más tarde. Se observan los pollos durante 21 días. La PD50 (dosis protectora 50%) se calcula mediante métodos estadísticos estándar. La prueba sólo es válida si todas las aves control de desafío mueren en 6 días. La vacuna cumple con la prueba si la PD50 no es menos que 50 por dosis y si el límite de confianza menor no es menos que 35 PD50 por dosis. Algunas autoridades de control aceptan una prueba sólo a 1/50, por razones de sanidad animal. No es necesario repetir la prueba de potencia en cada lote si se ha demostrado que ha pasado la prueba un lote representativo del producto final procedente del inóculo original.

d) Duración de la inmunidad El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis única o régimen de vacunación de la EN, variará enormemente tanto con la vacuna como con la especie hospedadora. Es extremadamente complejo y difícil de evaluar el nivel de inmunidad requerido en un hospedador dado (p. ej. para proteger contra la muerte, la enfermedad, las pérdidas de producción de carne o huevos). Generalmente, se debería hacer alguna evaluación de la longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regímenes de vacunación para mantener éstos por encima de un nivel aceptable.

e) Estabilidad

32

El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, debería mantener su potencia durante al menos 1 año. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como la reducción de la infectividad seguida de la incubación a 37ºC durante 7 días, pueden utilizarse como una guía para las capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva. Las vacunas en emulsión de aceite, también deberían someterse a un agente acelerador mediante almacenamiento a 37ºC, durante un mínimo de un mes, sin separación de las fases acuosa y oleosa. Las vacunas con virus vivos deben emplearse inmediatamente después de su reconstitución. Las vacunas inactivadas no se deben congelar.

f) Conservantes Para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el producto liofilizado, pero los conservantes antimicrobianos pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la vacuna.

g) Precauciones (riesgos) Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los humanos. Se ha informado de que los virus de la EN, tanto los virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado a humanos, causando normalmente conjuntivitis aguda después de la introducción al ojo. Habitualmente, las infecciones son

33

transitorias y no afectan a la córnea. Las vacunas en emulsión de aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La inyección accidental de humanos debería tratarse con prontitud mediante la incisión y el lavado de la zona, como para el caso de una herida por “inyección de grasa”. (OIE, 2004)

34

III.

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1.Materiales 3.1.1. Localización del trabajo a) Localización espacial. El trabajo de laboratorio de la presente investigación se desarrollará en las instalaciones del laboratorio de sanidad animal del SENASA, localizado en la Av. La Molina 1915, distrito de La Molina, provincia de Lima, departamento de Lima. Ubicación y límites geográficos: 12°

00°

03°

a

12°

00°

07°

Latitud

Sur

76° 57° 00° a 76° 51 ° 00° Longitud Oeste Tiene una altitud de 350 a 900 m.s.n.m. Presentando los siguientes límites geográficos: •

Por el norte con el distrito de Ate Vitarte.

•

Por el este con el distrito de Pachacámac.

•

Por el sur con el distrito de Villa María del Triunfo.

•

Por el oeste con los distritos de Ate Vitarte y Monterrico.

Fuente: http://www.munimolina.gob.pe/m1.htm

35

b) Localización temporal. El trabajo de recolección de muestra se llevará a cabo durante los meses de Enero a Julio del 2008 y el trabajo de laboratorio se realizara dentro de los meses de Julio y Agosto del 2008. 3.1.2. Material biológico •

Muestras de vacunas monovalentes, vivas, nacionales y extranjeras contra la EN.

•

Huevos libres de patógenos específicos (SPF), obtenidos del Laboratorio FARVET, Chincha, Perú.

3.1.3. Equipos y maquinarias •

Computadora Personal.

•

Cámara digital.

•

Estufa incubadora 37.5°C.

•

Estufa de medios 23ºC.

•

Estufa de medios 36ºC.

•

Ovoscopio.

•

Agitador de tubos.

•

Refrigeradora 4ºC

•

Autoclave.

•

Cámara de bioseguridad tipo II.

36

•

Minitaladro.

3.1.4. Materiales de laboratorio •

Placas petri.

•

Tubos de ensayo.

•

Propipetas.

•

Pipetas de 1ml, 2ml, 5ml, 10ml.

•

Jeringas descartables de 1ml, 3ml, 5ml.

•

Balones y matraces para reactivos.

•

Gradillas

•

Agua destilada estéril.

•

PBS.

•

Caldo BHI.

•

Caldo Thioglicolato.

•

Agar TSA.

•

Agar Sangre.

•

Agar Sabouraud.

•

Algodón.

•

Alcohol.

37

•

Lejía.

•

Yodo.

•

Gorro.

•

Mascarilla.

•

Guantes estériles.

•

Marcador de tinta indeleble.

•

Pegamento universal (Uhu).

•

Tijera.

•

Lápiz.

•

Película autosellante, moldeable (Parafilm M).

3.2.Métodos 3.2.1. Muestreo a) Universo. Empresas productoras de vacunas contra la EN Nacionales

Extranjeras

2

10

b) Tamaño de la Muestra.

38

Debido al tamaño reducido del universo el tamaño de la muestra será el universo completo. c) Procedimiento de Muestreo. Se adquirirán 2 muestras de un lote de cada empresa productora de las vacunas mencionadas, siendo en total 24 muestras. A las cuales se les realizarán los exámenes de control de calidad (esterilidad, titulación). 3.2.2. Métodos de Evaluación a) Metodología de la Experimentación. Las vacunas que no estén siendo utilizadas en ese momento deben ser conservadas en el refrigerador a 4ºC, así mismo los medios y caldos de cultivo. ESTERILIDAD: Esta prueba consiste en determinar que el producto está libre de cualquier contaminante microbiológico. 1) Retirar del refrigerador los medios y caldos de cultivo (uno por cada vacuna y un control, BHI adicional para reconstituir las vacunas) y colocarlos en la estufa a 36ºC por aproximadamente 30 minutos para temperarlos. 2) Marcar con plumón indeleble en cada medio y caldo la vacuna que será sembrada en cada uno.

39

3) Colocar en la cabina de bioseguridad los medios y caldos de cultivo, pipetas, jeringas, propipeta, vortex, gradilla, envase con desinfectante, algodón y alcohol. Someterlos a rayos UV por 15 minutos. 4) Apagar los rayos UV, retirar la tapa de la cabina, encender la corriente de aire y la luz de la cabina. 5) Desinfectarse las manos con alcohol. Colocar la vacuna dentro de la cabina. 6) Colocarse el gorro, mascarilla y guantes estériles. 7) Retirar el precinto de la vacuna. Cargar 5ml de agar BHI en la jeringa para reconstituir la vacuna. Observar que por presión negativa (vacío) el líquido debe absorberse rápidamente al frasco de la vacuna, y la pastilla (vacuna liofilizada) debe disolverse en aproximadamente 10 segundos lo que indica una buena liofilización de la vacuna. 8) Retirar la tapa de la vacuna y con una pipeta extraer la vacuna disuelta, aplicar 1ml a cada caldo de cultivo y 0.2ml a cada medio de cultivo (colocados al borde del medio de cultivo). 9) Homogenizar con el vortex los caldos de cultivo en los que se acaba de sembrar. 10) Con una pipeta distinta para cada vacuna y para cada medio se hace el sembrado por agotamiento, en forma de estrías. Esperar a que seque. Cada pipeta usada se coloca en el recipiente con desinfectante.

40

11) Colocar los medios de cultivo Sabouraud en la estufa de 23ºC (especial para crecimiento de hongos y levaduras), los demás medios y caldos en la estufa de 36ºC por 14 días. 12) Al 7mo día se realizan los pasajes de los caldos a medios de cultivo. Para lo que extraemos del refrigerador un medio de cada tipo para cada caldo de cada vacuna, más uno de cada tipo para el control. 13) Temperamos los medios en la estufa a 36ºC por 30 minutos y luego con el plumón indeleble marcamos la vacuna y caldo para la que serán destinados. 14) Colocamos en la cabina de bioseguridad los medios de cultivo, pipetas, propipeta, gradilla, vortex, envase con desinfectante, algodón y alcohol. Los sometemos a rayos UV por 15 minutos. 15) Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina, encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina. 16) Nos desinfectamos las manos y colocamos los caldos sembrados hace 7 días en la cabina. Nos colocamos el gorro, mascarilla y guantes estériles. 17) Extraemos con una pipeta 0.6ml de cada caldo, para colocar 0.2ml en cada medio de cultivo. 18) Sembramos en cada medio de la misma manera descrita anteriormente. Esperar a que seque.

41

19) Colocamos el medio Sabouraud en la estufa de 23ºC, y los demás medios y caldos en la estufa de 36ºC por 7 días. 20) Al completarse el tiempo señalado se revisan todos los caldos y medios de cultivo. Los caldos deben verse traslúcidos y no debe haber crecimiento de ninguna bacteria u hongo en los medios de cultivo sólidos. (Protocolo SENASA)

TITULACIÓN: Determinación del contenido viral de cada una de las vacunas por utilizar en el presente trabajo, mediante la titulación en huevos SPF de pollo. 1) Apenas se reciben los huevos deben ser colocados en la incubadora a 37.5ºC para evitar que se enfríen y mueran los embriones. Es importante que sean colocados con la cámara de aire hacia arriba. Se usarán 30 huevos por cada vacuna. 2) Con el ovoscopio revisar cada huevo para verificar que el embrión esté vivo, marcar con un lápiz el límite de la cámara de aire y el lugar a perforar (lugar no irrigado cerca del cordón umbilical). Volver a colocarlos en la incubadora. 3) Colocar en la cabina de bioseguridad tubos de ensayo, pipetas, jeringas, gradillas, PBS, agua destilada estéril, propipetas,

42

vortex, tijera, algodón, plumón indeleble y alcohol. Los sometemos a rayos UV por 20 minutos. 4) Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina, encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina. 5) Nos desinfectamos las manos con alcohol. Colocamos la vacuna dentro de la cabina. Nos colocamos el gorro, mascarilla y guantes estériles. 6) Se reconstituye (repontenciar) la vacuna en un tubo de ensayo con PBS de acuerdo a la dosis de la vacuna. Ejm: si la dosis indicada es de 0.03ml (una gota) por ave, y el frasco es para 1000 dosis, entonces se reconstituirá con 30ml de PBS. 7) Por cada vacuna se tendrán 10 tubos de ensayo con 9ml de agua destilada estéril en cada uno para realizar las diluciones de la vacuna. Los tubos deben estar rotulados indicando la vacuna y dilución que les corresponde (de 10-1 a 10-10). 8) En el primer tubo colocar con una pipeta 1ml de la vacuna reconstituída, homogenizar con el vortex. 9) De la primera dilución extraer 1ml con otra pipeta y colocarlo en el siguiente tubo de ensayo, homogenizar en el vortex. Se sigue esta sucesión hasta el último tubo.

43

10) De acuerdo al título que figura en el frasco de la vacuna se escogerá la dilución con ese título además de 2 diluciones inmediatamente superiores y 2 inmediatamente inferiores. Ejm: si la vacuna indica un título de 10-7, utilizaremos las diluciones de 10-5 a 10-9. 11) Vaciamos la cabina de bioseguridad y la desinfectamos con abundante alcohol. 12) Colocamos nuevamente en la cabina el vortex, jeringas de 1ml, minitaladro, plumón indeleble, alcohol y algodón. Los sometemos a rayos UV por 20 minutos. 13) Apagamos los rayos UV, retiramos la tapa de la cabina, encendemos la corriente de aire y la luz interna de la cabina. 14) Nos desinfectamos las manos con alcohol, colocar en la cabina las diluciones a usar de cada vacuna y los huevos. Nos colocamos otros guantes estériles. 15) Rociamos con alcohol los huevos, cubriendo la zona a perforar. Con el plumón indeleble marcar cada huevo con la vacuna y dilución que le será inoculada. Se inocularán 5 huevos por cada dilución y se reservará 1 huevo control por cada dilución.

44

16) Con el minitaladro se perforará en el lugar marcado previamente con lápiz, se deberá tener mucho cuidado de sólo perforar la cáscara, no la cutícula. 17) Se homogeniza con el vortex la primera dilución a inocular, con una jeringa se extrae 1ml de la dilución. Se inyecta 0.2ml de la dilución en cada huevo. 18) Se repite el mismo procedimiento anterior para cada dilución. Al terminar de inocular se procede a tapar con Uhu el agujero perforado. 19) Colocar los huevos nuevamente en la incubadora con la cámara de aire hacia arriba. 20) Se deberán revisar diariamente los huevos, procurando que sea a la misma hora, y se deberán ir descartando los muertos, teniendo un registro de lo que sucede cada día. 21) Los huevos muertos al igual que el sobrante de las vacunas deben ser colocadas en la cámara fría para su posterior incineración.

(Protocolo

Agencia

de

Cooperación

Internacional del Japón y Universidad Nacional de La Plata)

45

b) Recopilación de información. •

En el laboratorio: Mediante pruebas de control de calidad: Esterilidad y Titulación.

•

En la biblioteca: Revisión bibliográfica de antecedentes de investigación tesis, artículos de revistas científicas, libros de la especialidad, etc.

•

Otros ambientes generadores de información científica: Artículos en revistas electrónicas, documentos de internet y comunicaciones, y consulta personal con expertos en el área temática.

3.2.3. Variables de respuesta a) Variables independientes. •

Empresa de la que proviene la muestra.

b) Variables dependientes. •

Presencia de contaminantes.

•

Título adecuado.

46

3.3.Evaluación Estadística 3.3.1. Diseño experimental 3.3.1.1.Unidades experimentales Cada vacuna muestreada es considerada una unidad experimental.

3.4.Análisis estadístico 3.4.1. Análisis de Frecuencia El análisis estadístico se desarrollará mediante la Estadística descriptiva y cálculos en distribución de frecuencias.

47

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1.Características Físico-cualitativas

E-05

E-06

E-07

E-08

E-09

E-10

gira No gira No gira No gira No gira No gira No gira No gira

No

No

1000

Crema

Sí

No

No

No

1000

Crema

Sí

No

No

No

1000

Crema

Sí

No

No

No

1000

Azul

Sí

No

No

No

1000

Crema

Sí

No

No

No

1000

Azul

Sí

No

No

No

1000

Azul

Sí

No

No

No

1000

Crema

Sí

No

No

No

2500

Crema

Sí

No

No

No

1000

Crema

Sí

No

No

No

2000

Sí

No

No

No

5000

Verde agua

La Sota La Sota Clone 30 Clone 30 La Sota La Sota La Sota PHY. LMV. 42 La Sota La Sota VG/ GA B1

10-7

Buena liofilización

No

Vacío

Sí

Título

Crema

Cepa

Dosis

E-04

gira No

Carame-lización

E-03

gira No

Impurezas

E-02

gira No

hidrataciónSignos de

E-01

gira No

fácilmenteDesprende

N-02

No

Pastilla liofilizada

N-01

Precinto

Vacuna

Cuadro Nº01. Características Físico-cualitativas.









10-6





>10-7.2





≥10-6.2





≥10-6.5





≥10-5.5





≥10-5.5





10-6.2









≥10-5.5





≥10-6.4





No figura

No figura

Previamente a las pruebas de esterilidad y titulación de virus se debe observar detenidamente las características de las vacunas, con el fin de realizar un mejor control de su calidad.

48

En el cuadro Nº01 se observa que el precinto de todas las vacunas se encuentra en buen estado, ya que en ningún caso gira. Se observan distintos colores de presentación de las vacunas, debiéndose a la presencia de colorantes en el caso de las pastillas liofilizadas azules y verde agua. También se observa que en el caso de todas las vacunas muestreadas, la pastilla liofilizada se desprende fácilmente del frasco que la contiene; además

ninguna

presenta

signos

de

hidratación,

impurezas

o

caramelización. Nueve de las vacunas (N-01, N-02, E-01, E-02, E-03, E04, E-05, E-06 y E-08) contienen una cantidad de dosis total de 1000, una vacuna (E-09) de 2000 dosis, una (E-07) de 2500 dosis, y por último una (E-10) de 5000 dosis. Siete de las vacunas muestreadas (N-01, N-02, E-03, E-04, E-05, E-07 y E-08) son de la cepa La Sota, dos (E-01 y E-02) de la cepa Clone 30, una (E-10) de la cepa B1, una (E-06) de la cepa PHY.LMV.42 (cepa enterotrópica apatógena), y una (E-09) de la cepa VG/GA (cepa enterotrópica lentogénica). Correspondiente al título que indica el frasco de cada vacuna observamos que tres de las vacunas muestreadas presentarían un título ≥10-5.5 (E-05, E-06 y E-09), una de 10-6 (E-01), una ≥10-6.2 (E-03), una de 10-6.2 (E-07), una ≥10-6.4 (E-10), una ≥106.5

(E-04), una de 10-7 (N-01), una >10-7.2 (E-02), y en el caso de dos de las

vacunas muestreadas (N-02 y E-08) no figura el título. Por último observamos que todas las vacunas muestreadas presentan buenas condiciones de vacío y liofilización. Gráfico Nº01. Porcentaje de las cepas de las vacunas.

49

En el gráfico Nº01 se observa el porcentaje de uso de las cada cepa en las vacuna muestreadas, obteniéndose como resultado 58.33% de La Sota, 16.67% de Clone 30, 8.33% de B1, 8.33% de PHY.LMV.42, y 8.33% de VG/GA. Dándose una notoria diferencia hacia la inclinación de la mayor parte de laboratorios productores de las vacunas muestreadas a utilizar la cepa La Sota para la elaboración de las mismas.

4.2.Prueba de Esterilidad Las pruebas de esterilidad son procedimientos que hacen parte del control de calidad microbiológico en manufactura y sirven para demostrar que el producto

es

estéril,

determinando

la

ausencia

o

presencia

microorganismos contaminantes en este. Cuadro Nº02. Prueba de esterilidad.

Vacuna

Medio de cultivo

7 días

50

14 días

Pasajes BHI

Thyogl.

de

N-01

N-02

E-01

E-02

E-03

E-04

E-05

E-06

Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato

Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio

51

Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

E-07

E-08

E-09

E-10

Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato Sabouraud Agar sangre TSA BHI Thyoglicolato

Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio

Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio Sin crec. Sin crec. Sin crec. Sin cambio Sin cambio

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

Sin crec. Sin crec. Sin crec.

En el cuadro Nº02 se observa que, en absolutamente todas las vacunas muestreadas no hubo crecimiento de microorganismos (bacterias, hongos o levaduras) en los medios de cultivo sólidos al 7mo ó 14to día, en los caldos de cultivo tampoco se observó ningún cambio al 7mo ó 14to día, de igual manera no se registró crecimiento bacteriano o fúngico en los cultivos realizados de los caldos de cultivo (pasajes). Realizada la prueba de esterilidad para las 12 muestras se obtuvieron los resultados mostrados en el siguiente cuadro.

Cuadro Nº03. Resultados de la Prueba de Esterilidad, medios de cultivo.

Medio de cultivo

Sin crecimiento

52

Contaminado

Sabouraud

12

0

Agar Sangre

12

0

TSA

12

0

PORCENTAJE TOTAL

100%

0%

Podemos observar en el cuadro Nº03 que el 100% de las muestras fueron interpretadas como estériles es los medios de cultivo sólidos, frente a un 0% de muestras contaminadas. Esto indica que todas las vacunas muestreadas superaron esta prueba de control de calidad microbiológico satisfactoriamente.

Cuadro Nº04. Resultados de la Prueba de Esterilidad, caldos de cultivo.

Caldos de cultivo

Sin cambio

Contaminado

BHI

12

0

Thyoglicolato

12

0

PORCENTAJE TOTAL

100%

0%

En el cuadro Nº04 se observa que el 100% de las muestras fueron interpretadas como estériles es los caldos de cultivo, frente a un 0% de muestras contaminadas. Esto indica que todas las vacunas muestreadas superaron

esta

prueba

de

satisfactoriamente.

53

control

de

calidad

microbiológico

Queda en evidencia con estos resultados que la totalidad de las vacunas muestreadas son estériles, demostrándose por la ausencia de contaminantes bacterianos y/o fúngicos en los medios de cultivo.

4.3.Titulación de Virus Se realiza con el fin de determinar el contenido viral de cada una de las vacunas y, por ende, controlar la cantidad de antígeno a aplicar a cada ave para producir los anticuerpos necesarios para lograr la inmunización, y no ocasionar la muerte del animal.

/TotalMuertos

muertos% de

5 5 1 0 2 1 1 1 2 0 5 5 4 2 0

0 0 4 5 3 4 4 4 3 5 0 0 1 3 5

13 8 3 2 2 5 4 3 2 0 16 11 6 2 0

0 0 4 9 12 4 8 12 15 20 0 0 1 4 9

13/13 8/8 3/7 2/11 2/14 5/9 4/12 3/15 2/17 0/20 16/16 11/11 6/7 2/6 0/9

100 100 43 18 14 56 33 20 12 0 100 100 86 33 0

54

Título (DL50)

de vivosAcumulado

10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

DP

de muertosAcumulado

E-01

# de vivos

N-02

# de muertos

N-01

Dilución de la vacuna

Vacuna

Cuadro Nº05. Método de Reed y Muench

0.88

10-6.9

0.26

10-3.3

0.68

10-6.7

E-02

E-03

E-04

E-05

E-06

E-07

E-08

E-09

E-10

10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

5 5 3 1 0 5 5 4 0 0 5 5 3 1 0 5 5 3 0 0 5 5 3 0 0 3 3 3 0 0 5 5 4 0 0 5 4 4 2 1 5 5 3 1 1

0 0 2 4 5 0 0 1 5 5 0 0 2 4 5 0 0 2 5 5 0 0 2 5 5 2 2 2 5 5 0 0 1 5 5 0 1 1 3 4 0 0 2 4 4

14 9 4 1 0 14 9 4 0 0 14 9 4 1 0 13 8 3 0 0 13 8 3 0 0 9 6 3 0 0 14 9 4 0 0 16 11 7 3 1 15 10 5 2 1

0 0 2 6 11 0 0 1 6 11 0 0 2 6 11 0 0 2 7 12 0 0 2 7 12 2 4 6 11 16 0 0 1 6 11 0 1 2 5 9 0 0 2 6 10

14/14 9/9 4/6 1/7 0/11 14/14 9/9 4/5 0/6 0/11 14/14 9/9 4/6 1/7 0/11 13/13 8/8 3/5 0/7 0/12 13/13 8/8 3/5 0/7 0/12 9/11 6/10 3/9 0/11 0/16 14/14 9/9 4/5 0/6 0/11 16/16 11/12 7/9 3/8 1/10 15/15 10/10 5/7 2/8 1/11

100 100 67 14 0 100 100 80 0 0 100 100 67 14 0 100 100 60 0 0 100 100 60 0 0 82 60 33 0 0 100 100 80 0 0 100 92 78 38 10 100 100 71 25 9

0.32

10-6.3

0.375

10-6.4

0.32

10-6.3

0.17

10-5.2

0.17

10-5.2

0.37

10-5.4

0.375

10-5.4

0.7

10-5.7

0.46

10-6.5

En el cuadro Nº04 se observa según el método de Reed y Muench que, en la vacuna N-01 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, entre ellas

55

la DP es 0.88 (DP= % infectados por encima del 50% - 50% / % infectados por encima del 50% - % infectados por debajo del 50%), obteniendo como resultado un título de 10-6.9 (se suman los decimales obtenidos de la DP entre las diluciones en las que se hallaría el 50%); en la vacuna N-02 el título se halla entre las diluciones 10-3 y 10-4, la DP es 0.26, obteniendo como título 10-3.3; en la vacuna E-01 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.68, obteniendo como título 10-6.7; en la vacuna E-02 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.32, obteniendo como título 10-6.3; en la vacuna E-03 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.375, obteniendo como título 10-6.4; en la vacuna E-04 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.32, obteniendo como título 10-6.3; en la vacuna E-05 el título se halla entre las diluciones 10-5 y 10-6, la DP es 0.17, obteniendo como título 10-5.2; en la vacuna E-06 el título se halla entre las diluciones 10-5 y 10-6, la DP es 0.17, obteniendo como título 10-5.2; en la vacuna E-07 el título se halla entre las diluciones 10-5 y 10-6, la DP es 0.37, obteniendo como título 10-5.4; en la vacuna E-08 el título se halla entre las diluciones 10-5 y 10-6, la DP es 0.375, obteniendo como título 10-5.4; en la vacuna E-09 el título se halla entre las diluciones 10-5 y 10-6, la DP es 0.7, obteniendo como título 10-5.7; en la vacuna E-10 el título se halla entre las diluciones 10-6 y 10-7, la DP es 0.46, obteniendo como título 10-6.5.

56

Cuadro Nº06. Comparación entre el título obtenido y el que figura en el frasco.

Vacuna

Título del frasco 10-7

N-01

10-6.9

No figura

N-02

10-3.3

10-6

E-01

10-6.7

>10-7.2

E-02

10-6.3

≥10-6.2

E-03

10-6.4

≥10-6.5

E-04

10-6.3

≥10-5.5

E-05

10-5.2

≥10-5.5

E-06

10-5.2

10-6.2

E-07

10-5.4

No figura

E-08

10-5.4

≥10-5.5

E-09

10-5.7

≥10-6.4

E-10

Título obtenido

10-6.5

En el cuadro Nº05 se observa que cuatro de las vacunas (E-02, E-04, E-05 y E-06) cumplen con el título que figura en su respectivo frasco, seis de las vacunas muestreadas (N-01, E-01, E-03, E-07, E-09 y E-10) no cumplen con el título que figura en su frasco, y dos vacunas (N-02 y E-08) no indican el título en el frasco por lo que no es posible su comparación y control.

Cuadro Nº07. Resultados de cumplimiento de título que figura en el frasco de la vacuna.

Resultado

Frecuencia

Porcentaje

Cumple con el título indicado

4

33%

57

No cumple con el título indicado

6

50%

Título no figura

2

17%

En el cuadro Nº06 se observa que sólo el 33% de las vacunas muestreadas cumplen con el título que figura en el frasco, el 50% de las vacunas muestreadas no cumple con el título que indica el frasco, y en el 17% de las vacunas muestreadas no figura el título de la vacuna. Con los datos previos se obtiene el siguiente gráfico.

Gráfico Nº02. Porcentaje de vacunas que cumplen el título indicado en el frasco.

58

V.

CONCLUSIONES

1. Todas las vacunas muestreadas aprobaron satisfactoriamente el análisis Físico-cualitativo al que fueron sometidas. 2. En la prueba de Esterilidad, las 12 vacunas, que representan el 100% de las muestras analizadas, no presentaron ningún signo de contaminación al no existir crecimiento microbiológico (bacterias u hongos) en ninguno de los medios y caldos en los que fueron sembradas. 3. En la Titulación de Virus, 6 vacunas, que representan el 50% de las muestras, no cumplieron con el título indicado por el propio fabricante, siendo la diferencia con esa misma muy pequeña aún así no cumplen lo que figura en el frasco, pudiendo deberse esta diferencia a la falta de cuidado debido a que no existe un control de calidad obligatorio de cada lote por las entidades del estado. Sólo 4 vacunas, representando el 33% de las muestras tituladas, cumplieron el título indicado en su etiqueta; y 2 vacunas, representando el 17% de las muestras, no presentaba el título de la vacuna en el frasco, imposibilitando así el control de calidad del título del virus.

59

VI.

RECOMENDACIONES

1. Se sugiere realizar controles de calidad a cada lote de cada empresa de las vacunas contra esta y otras enfermedades aviares. 2. Complementar estas pruebas con otras pruebas de control de calidad, tales como inocuidad, pureza o potencia. 3. Realizar pruebas de las vacunas en las aves de corral para probar la efectividad y respuesta a la vacuna. 4. Se sugiere que todos los laboratorios tengan como norma indicar el título de la vacuna en el frasco.

60

VII.

BIBLIOGRAFIA

7.1.Principal 1. Blood, D.C. y Radostis, O.M. Medicina Veterinaria. Editorial Interamericana McGraw-Hill. 8va Edición. España. 1996. 2. Mendo Rubio, Manuel. Lecciones de Microbiología y Medios de Cultivo. Manual de Laboratorio. Ediciones Laborales S.R.L. Lima, Perú. 1995. 3. MERCK. Manual de Medicina Veterinaria.Editorial Océano. Segunda edición. 2004. 4. OIE. Control of infectious Animal Diseases by Vaccination. Buenos Aires, Argentina. 2004. 5. OIE. Manual de la OIE sobre Animales Terrestres 2004. Buenos Aires, Argentina. 2004. 6. OIE. Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los animales terrestres (mamíferos, aves y abejas). Quinta edición. Volumen I. Paris, Francia. 2004. 7. Ocadiz G., Javier. Epidemiología en Animales domésticos. Editorial Trillas. México. 1998. 8. Shortridge K.F., Allan W. H., Alexander D. J. Newcastle Disease Laboratory Diagnosis and Vaccine Evaluation. Hong Kong University Press. Hong Kong, China. 1982.

61

7.2.Internet a. Eficiencia en vacunas contra Newcastle. Descargado el 02/09/2006. http://encolombia.com/veterinaria/fenavi9102sanidad.htm b. Estrategia de inmunización contra la enfermedad de Newcastle. Descargado el 27/11/2006. http://www.iia.cu/pdf/v27_89.pdf c. Norma

Oficial

Mexicana

NOM-052-ZOO-1995,

Requisitos

mínimos para las vacunas empleadas en la prevención y control de la enfermedad de Newcastle. Descargado el 26/11/2006. http://www.ipfsaph.org/cds_upload/kopool_data/FAOLEX_0/es_mex17 848.doc d. Vacunación Segura y Eventos Adversos. Descargado el 03/07/2008. http://www.buenosaires.gov.ar/areas/salud/a_primaria/programas/inmu nizacion/archivos/man_eventos_adversos.pdf e. Requisitos mínimos para las vacunas empleadas en la prevención y control de la enfermedad de Newcastle. Descargado el 26/08/2008. http://www.sagarpa.gob.mx/ganaderia/NOM/052zoo.pdf f. Validación de la prueba de esterilidad para vacunas virales preparadas en vehículos oleoso y acuoso. Descargado el 21/09/2008. http://www.saber.ula.ve/db/ssaber/Edocs/pubelectronicas/revistafarmaci a/vol45/cortes_a.pdf

62

63

GLOSARIO DE ABREVIATURAS APMV

:

Paramixovirus aviar.

BHI

:

Caldo infusión cerebro corazón.

EID

:

Enfermedad infecciosa emergente.

EN

:

Enfermedad de Newcastle.

HA

:

Hemaglutinación.

HAU

:

Unidad de hemaglutinación.

HI

:

Inhibición de la hemaglutinación.

ICPI

:

Índice de patogenicidad intracerebral.

IVPI

:

Índice de patogenicidad intravenosa.

F0

:

Precursor de la proteína viral de fusión.

LD

:

Dosis letal.

MAb

:

Anticuerpo monoclonal.

PBS

:

Solución tampón de fosfato salino.

PD

:

Dosis protectora.

RBC

:

Eritrocitos.

SENASA

:

Servicio Nacional de Sanidad Agraria.

SPF

:

Sin patógenos específicos.

TSA

:

Agar Tripticasa de Soya.

64

RECOPILACIÓN DE DATOS PARA LA TITULACIÓN DE VIRUS

Cuadro Nº08. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna N-01.

Vacuna: N-01 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-5

1

-

-

-

4

-

-

5

10-6

-

-

-

-

5

-

-

5

10-7

-

-

-

-

1

-

-

1

10-8

-

-

-

-

-

-

-

0

10-9 Total

2

-

-

-

-

-

-

2

3

0

0

0

10

0

0

13

vacuna

Cuadro Nº09. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna N-02.

Vacuna: N-02 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-3

1

-

-

-

-

-

-

1

10-4

1

-

-

-

-

-

-

1

10-5

-

-

-

-

1

-

-

1

10-6

1

1

-

-

-

-

-

2

10-7 Total

-

-

-

-

-

-

-

0

3

1

0

0

1

0

0

5

vacuna

65

Cuadro Nº10. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-01.

Vacuna: E-01 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-3

-

-

-

-

2

2

1

5

10-4

-

-

-

-

3

1

1

5

-5

-

-

-

-

2

-

2

4

-6

-

-

-

-

2

-

-

2

-7

-

-

-

-

-

-

-

0

0

0

0

0

9

3

4

16

vacuna

10 10

10 Total

Cuadro Nº11. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-02.

Vacuna: E-02 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-4

-

-

-

-

3

1

1

5

10-5

-

1

-

-

1

2

1

5

10-6

-

-

-

-

3

-

-

3

10-7

-

1

-

-

-

-

-

1

10-8 Total

-

-

-

-

-

-

-

0

0

2

0

0

7

3

2

14

vacuna

66

Cuadro Nº12. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-03.

Vacuna: E-03 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-4

-

-

-

-

3

-

2

5

10-5

1

-

-

-

1

2

1

5

-6

-

-

-

-

3

1

-

4

-7

-

-

-

-

-

-

-

0

-8

-

-

-

-

-

-

-

0

1

0

0

0

7

3

3

14

vacuna

10 10

10 Total

Cuadro Nº13. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-04.

Vacuna: E-04 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-4

-

-

-

-

2

2

1

5

10-5

1

-

-

-

2

1

1

5

10-6

2

-

-

-

-

1

-

3

10-7

-

-

-

-

1

-

-

1

10-8 Total

-

-

-

-

-

-

-

0

3

0

0

0

5

4

2

14

vacuna

67

Cuadro Nº14. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-05.

Vacuna: E-05 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-3

-

-

-

-

1

3

1

5

10-4

-

-

-

-

2

1

2

5

-5

-

-

-

-

1

1

1

3

-6

-

-

-

-

-

-

-

0

-7

-

-

-

-

-

-

-

0

0

0

0

0

4

5

4

13

vacuna

10 10

10 Total

Cuadro Nº15. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-06.

Vacuna: E-06 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-3

-

-

-

-

3

1

1

5

10-4

-

-

-

-

1

2

2

5

10-5

-

-

-

-

1

-

2

3

10-6

-

-

-

-

-

-

-

0

10-7 Total

-

-

-

-

-

-

-

0

0

0

0

0

5

3

5

13

vacuna

68

Cuadro Nº16. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-07.

Vacuna: E-07 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-4

-

-

-

-

-

1

2

3

10-5

-

-

-

-

1

2

-

3

-6

-

-

-

-

2

1

-

3

-7

-

-

-

-

-

-

-

0

-8

-

-

-

-

-

-

-

0

0

0

0

0

3

4

2

9

vacuna

10 10

10 Total

Cuadro Nº17. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-08.

Vacuna: E-08 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-3

-

-

-

-

2

1

2

5

10-4

-

-

-

-

2

2

1

5

10-5

-

-

-

-

-

4

-

4

10-6

-

-

-

-

-

-

-

0

10-7 Total

-

-

-

-

-

-

-

0

0

0

0

0

4

7

3

14

vacuna

69

Cuadro Nº18. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-09.

Vacuna: E-09 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-3

-

-

-

-

1

3

1

5

10-4

-

-

-

-

2

2

-

4

-5

-

-

-

-

2

2

-

4

-6

-

-

-

-

2

-

-

2

-7

-

-

-

-

1

-

-

1

0

0

0

0

8

7

1

16

vacuna

10 10

10 Total

Cuadro Nº19. Cantidad de embriones muertos tras inoculación de la vacuna E-10.

Vacuna: E-10 Dilución de la

Días post-inoculación (# muertos) Total

1

2

3

4

5

6

7

10-4

-

-

-

-

1

-

4

5

10-5

-

-

-

-

3

2

-

5

10-6

-

-

-

-

1

-

2

3

10-7

-

-

-

-

1

-

-

1

10-8 Total

-

-

-

-

-

-

1

1

0

0

0

0

6

2

7

15

vacuna

70

FOTOS

Foto Nº01. Cabina de Bioseguridad

71

Foto Nº02. Material listo para empezar la prueba de Esterilidad

72

Foto Nº03. Estufa de medios de 36ºC

73

Foto Nº04. Estufa de medios de 23ºC

74

Foto Nº05. Sembrando vacunas en los medios de cultivo.

75

Foto Nº06. Caldos de cultivo después de haber sembrado las vacunas.

76

Foto Nº07. Incubadora a 37.5ºC

77

Foto Nº08. Huevos SPF con el punto de inoculación señalado.

78

Foto Nº09. Perforando los huevos en el punto de inoculación.

79

Foto Nº10. Inoculando las diluciones de la vacuna en los huevos SPF.

80