Metode Isolasi Dna Kromosom.docx

METODE Dalam praktikum ini, alat yang digunakan adalah cawan petri, collection tube, elution tube, Erlenmeyer, freezer, inkubator, jarum inokulum, mikropipet, mikrosetrifugator, spin filter, spirtus, tabung eppendorf 1.5 mL, dan tip plastik. Bahan yang digunakan yaitu aquabidest, bakteri Escherichia coli, dapar TE yang terbuat dari 10mM TrisHCl dan 1mM EDTA, elution buffer, lysis solution RL, lysozyme 20 mg/ml, media Luria Bertani (LB) cair, washing solution HS, dan washing solution LS. Pada praktikum ini, dilakukan dua tahap untuk mengisolasi DNA kromosom. Pertama, dilakukan persiapan suspensi bakteri Escherichia coli yang akan digunakan. Kedua, dilakukan proses atau tahapan isolasi DNA kromosom suspensi bakteri yang telah dicuci. Persiapan Suspensi Bakteri Koloni bakteri Escherichia coli yang sudah dibiakan selama 18 jam diinolukasi ke dalam media Luria Bertani (LB) cair 100 ml. Kemudian, media tersebut diinkubasi selama 18 jam dengan shaker kecepatan 200 – 250 rpm pada suhu 37oC. Hasil suspensi bakteri yang telah diinkubasi, dipipet 1.5ml ke dalam tabung eppendorf 1.5ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Hasil dari sentrifugasi berupa supernatan dibuang lalu ditambahkan 1 ml suspensi bakteri dan kembali disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan dicuci pellet atau sisa hasil sentrifugasi dengan aquabidest, disentrifugasi 6000 rpm selama 5 menit, dan dibuang supernatannya. Pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Isolasi DNA Kromosom Hasil pencucian pellet bakteri E. coli dengan aquabidest diresuspensi dengan 100 µl dapar TE dan 2 µl lysozyme, homogenkan campuran dengan cara pipetting. Setelah itu, ditambahkan 450 µl lysis solution RL, dihomogenkan dengan pipetting, diinkubasi pada suhu ruang selama tiga menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan maksimum selama satu menit. Selanjutnya, dipindah supernatan ke dalam spin filter D dan dimasukkan ke dalam collection tube, lalu disentrifugasi 12000 rpm selama dua menit. Dilakukan penggantian collection tube, ditambahkan 500 µl washing solution HS, disentrifugasi 12000 rpm selama satu menit, dan dibuang filtratnya. Ditambahkan 700 µl washing solution LS, disentrifugasi 12000 rpm selama satu menit, dibuang filtrat, dan disentrifugasi 12000 rpm selama dua menit. Dipindahkan spin filter ke elution tube, ditambahkan 100 µl elution buffer, diinkubasi pada

suhu ruang selama satu menit, disentrifugasi 8000 rpm selama satu menit, dan disimpan pada suhu -20oC. Setelah diisolasi, dilakukan proses memperbanyak hasil tersebut dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa 1%.