Modul Praktikum Bioteknologi 2018.pdf

MODUL PRAKTIKUM Bioteknologi Farmasi

Disusun oleh:

Dr. Tiana Milanda, M.Si., Apt. Dr. Tina Rostinawati, M.Si., Apt. Melisa Intan Barliana, Dr. Med.Sc., Apt. Yuni Elsa, Ph.D., Apt. Dra. Rr. Sulistiyaningsih, M.Kes., Apt. Sri Agung Fitri Kusuma, M.Si., Apt. Arif Satria Wira Kusuma, M.Si., Apt.

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN SEMESTER GENAP 2017/2018

Daftar Isi KATA PENGANTAR ................................................................................................. 4 Modul 1. Tata Tertib Laboratorium ............................................................................. 5 Modul 2. Pengenalan Alat............................................................................................ 6 2.1 Tujuan ................................................................................................................ 6 2.2 Prinsip ................................................................................................................ 6 2.3 Teori ................................................................................................................... 6 Modul 3. Isolasi DNA Kromosom ............................................................................. 10 3.1 Tujuan .............................................................................................................. 10 3.2 Prinsip .............................................................................................................. 10 3.3 Teori ................................................................................................................. 10 3.4 Bahan ............................................................................................................... 13 3.5 Alat ................................................................................................................... 13 3.6 Persiapan .......................................................................................................... 13 3.7 Prosedur ........................................................................................................... 14 Modul 4. Isolasi DNA Plasmid .................................................................................. 16 4.1 Tujuan .............................................................................................................. 16 4.2 Prinsip .............................................................................................................. 16 4.3 Teori ................................................................................................................. 16 4.4 Bahan ............................................................................................................... 19 4.5 Alat ................................................................................................................... 20 4.6 Persiapan .......................................................................................................... 20 4.7 Prosedur ........................................................................................................... 21 Modul 5. Pemetaan DNA Plasmid ............................................................................. 24 5.1 Tujuan .............................................................................................................. 24 5.2 Prinsip .............................................................................................................. 24 5.3 Teori ................................................................................................................. 24 5.4 Bahan ............................................................................................................... 27 5.5 Alat ................................................................................................................... 27 5.6 Persiapan .......................................................................................................... 28 5.7 Prosedur ........................................................................................................... 28 Modul 6. Polymerase Chain Reactions (PCR) .......................................................... 29 6.1 Tujuan .............................................................................................................. 29 6.2 Prinsip .............................................................................................................. 29 6.3 Teori ................................................................................................................. 29 6.4 Bahan ............................................................................................................... 32 Praktikum Bioteknologi Farmasi

2

6.5 Alat ................................................................................................................... 32 6.6 Persiapan .......................................................................................................... 32 6.7 Prosedur ........................................................................................................... 33 Modul 7. Transformasi Plasmid ................................................................................. 34 7.1 Tujuan .............................................................................................................. 34 7.2 Prinsip .............................................................................................................. 34 7.3 Teori ................................................................................................................. 34 7.4 Bahan ............................................................................................................... 36 7.5 Alat ................................................................................................................... 36 7.6 Prosedur ........................................................................................................... 37 Modul 8. Elektroforesis Gel Agarosa ........................................................................ 40 8.1 Tujuan .............................................................................................................. 40 8.2 Prinsip .............................................................................................................. 40 8.3 Teori ................................................................................................................. 40 8.4 Bahan ............................................................................................................... 42 8.5 Alat ................................................................................................................... 42 8.6 Persiapan .......................................................................................................... 42 8.7 Prosedur ........................................................................................................... 43 Modul 9. Elektroforsesis Gel Poliakrilamid .............................................................. 45 9.1 Tujuan .............................................................................................................. 45 9.2 Prinsip .............................................................................................................. 45 9.3 Teori ................................................................................................................. 45 9.4 Bahan ............................................................................................................... 46 9.5 Alat ................................................................................................................... 46 9.6 Persiapan .......................................................................................................... 47 9.7 Prosedur ........................................................................................................... 47

Praktikum Bioteknologi Farmasi

3

KATA PENGANTAR Panduan Praktikum Bioteknologi Farmasi disusun sebagai panduan bagi mahasiswa Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran untuk melaksanakan praktikum Bioteknologi Farmasi. Praktikum ini diselenggarakan dalam rangka mendukung mata kuliah Bioteknologi Farmasi. Materi praktikum yang disajikan dalam panduan ini meliputi teknik-teknik dasar di bidang bioteknologi yang perlu dikuasai oleh mahasiswa. Materi tersebut meliputi isolasi DNA kromosom, transformasi gen, isolasi DNA plasmid, pemetaan DNA plasmid menggunakan enzim restriksi, Polymerase Chain Reactions (PCR) elektroforesis DNA, isolasi protein total sel dan elektroforesis protein menggunakan SDS PAGE. Panduan praktikum ini masih jauh dari sempurna, baik dalam penyusunan modul maupun tata bahasanya. Revisi panduan akan terus dilakukan sesuai dengan kompetensi keilmuan yang ingin dicapai seorang sarjana farmasi. Semoga panduan ini dapat bermanfaat, khususnya bagi para mahasiswa.

Jatinangor, Februari 2018

Tim Penyusun

Praktikum Bioteknologi Farmasi

4

Modul 1. Tata Tertib Laboratorium Keselamatan Umum 1. Menggunakan jas lab dikancingkan dan kelengkapannya (sarung tangan) selama praktikum. 2. Rambut diikat dan dilarang memakai aksesoris kecuali jam. 3. Cuci tangan sebelum dan setelah melakukan praktikum, dan sebelum meninggalkan laboratorium, 4. Mengambil reagen sesuai kebutuhan dan menggunakan sarung tangan selama praktikum, 5. Hati-hati dalam penggunaan pipet. Jika ujung pipet bersentuhan dengan benda lain yang tidak steril maka pipet tersebut tidak boleh digunakan sebelum disterilkan dengan alkohol 70%. 6. Tip pipet yang sama tidak boleh digunakan lebih dari satu kali pakai kecuali ada indikasi yang jelas dalam catatan atau dari asisten, 7. Hati-hati dalam penggunaan alat laboratorium (sentrifugasi, alat PCR, dll), perhatikan penggunaannya sesuai arahan dari dosen dan asisten. 8. Menjaga kebersihan dan ketertiban laboratorium, 9. Tidak boleh makan, minum, atau merokok, 10. Selalu jaga barang-barang pribadi, jauhkan dari kultur bakteri dalam laboratorium. 11. Membersihkan alat-alat yang dipakai setelah selesai praktikum. 12. Tidak menggunakan alat komunikasi (telepon genggam) selama praktikum.

Prosedur Pembuangan (Waste) Bila bekerja menggunakan bakteri harus hati-hati dan mengikuti prosedur pembuangan yang ditentukan, yaitu: •

Tabung reaksi Hilangkan semua label (tanda), tempatkan tabung dalam wadah yang sesuai di dalam bak pencucian. Hati-hati cairan dalam tabung jangan tumpah atau tercecer.

•

Tip plastik dan tabung Eppendorf Tip disposable untuk mikro pipet dan tabung eppendorf dibuang ke dalam wadah yang telah disediakan.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

5

Modul 2. Pengenalan Alat 2.1 Tujuan 1. Untuk mengetahui dan mengenal alat-alat yang digunakan dalam laboratorium

bioteknologi.

2. Untuk mengetahui teknik penyiapan serta penggunaan alat-alat tersebut dengan

baik.

3. Untuk mengetahui fungsi dan prinsip kerja alat-alat laboratorium bioteknologi. 4. Untuk mengetahui teknik/cara sterilisasi alat-alat yang digunakan dalam laboratorium bioteknologi.

2.2 Prinsip Menggunakan alat-alat di laboratorium bioteknologi dengan benar agar hasil eksperimen benar, tidak ada kontaminasi, dan tidak merusak alat.

2.3 Teori Eksperimen

atau

penelitian

di

laboratorium

bioteknologi

biasanya

menggunakan bakteri, DNA plasmid, DNA kromosom, atau bahkan sampel segar (hasil swab, tumbuhan, atau jaringan). Dalam prosedurnya menggunakan teknik atau cara-cara khusus tentunya diperlukan pula pengenalan akan alat-alat laboratorium bioteknologi serta teknik/cara penggunaan alat-alat yang berhubungan dengan penelitian tersebut.Hal ini dilakukan untuk memudahkan berlangsungnya suatu eksperimen atau penelitian. Adapun alat-alat yang dipergunakan pada laboratorium bioteknologi antara lain: •

Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope) Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop cahaya. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan benda dengan diameter lebih kecil dari 0,1 mm.

•

Autoklaf Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan

Praktikum Bioteknologi Farmasi

6

yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dengan suhu 121 oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi (15 Psi=15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC. •

Inkubator (Incubator) Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran suhu inkubator misalnya adalah 10-70oC.

•

Biological Safety Cabinet Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat yang digunakan untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasi sinar UV beberapa jam sebelum digunakan.

•

Mikropipet (Micropippete) dan Tip Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume pipette) antara 1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µl. Dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.

•

Cawan Petri (Petri Dish) Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dituangkan ke dalam cawan bagian bawah dan ditutup menggunakan penutup cawan bagian atas dilakukan secara aseptis. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.

•

Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube) Tabung reaksi digunakan untukmenumbuhkan mikroba dan dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik, atau aluminium foil.

•

Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

Praktikum Bioteknologi Farmasi

7

Labu Erlenmeyer berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang digunakan dalam eksperimen. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung air suling, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dan sebagainya. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dan sebagainya. Seluruh labu Erlenmeyer yang digunakan dalam laboratorium bioteknologi harus ditutup secara aseptis menggunakan penutup kapas. •

Gelas ukur (Graduated Cylinder) Gelas ukur berguna untuk mengukur volume suatu cairan dan memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan meniskus cekung larutan.

•

Jarum Inokulum Jarum

inokulum

berfungsi

untuk

memindahkan

biakan

untuk

ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan penggoresan koloni pada permukaan agar maupun mensuspensikan koloni ke dalam media cair pertumbuhan, sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating). •

Mikrosentrifuga Partikel-partikel atau sel yang terdapat dalam larutan suspensi pasti lama-lama akan mengendap oleh gravitasi (1xg). Namun, waktu yang diperlukan untuk mengendap tidak praktis untuk suatu penelitian. Selain itu, partikel yang ukurannya sangat kecil akan sulit untuk terpisah dari larutan bila tidak menggunakan kekuatan sentrifugal. Sentrifugasi merupakan proses pemisahan suatu campuran heterogen dengan menggunakan kekuatan sentrifugal (g-force). Prinsip sentrifugasi ialah bahwa untuk memperoleh organel yang besardiperlukan kecepatan sentrifugasi yang rendah, dan sebaliknya.Pada saat menggunakan sentrifugator, Posisi tabung eppendorf harus seimbang dan saling bersebrangan.

•

Mesin PCR (Thermal cycler)

Praktikum Bioteknologi Farmasi

8

Beberapa eksperimen di laboratorium bioteknologi menggunakan mesin PCR untuk amplifikasi dan deteksi sekuen DNA. PCR biasanya dilakukan dalam tabung reaksi kecil (0.2-0.5 ml) dengan total volume reaksi 10-200 μl dithermal cycler. Thermal cycler memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi untuk mencapai suhu yang diperlukan pada setiap tahapan reaksi. Tabung reaksi yang digunakan memiliki dinding yang tipis sehingga mampu meneruskan konduktivitas termal agar keseimbangan suhu cepat tercapai.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

9

Modul 3. Isolasi DNA Kromosom

3.1 Tujuan Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif (E. coli BL21) menggunakan PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific - Catalog Number K182001) . 3.2 Prinsip Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase K dan Digestion Solution atau Lysis Solution. RNA dihilangkan dengan penambahan RNase A. Lisat dicampurkan dengan etanol, lalu dituangkan ke dalam kolom purifikasi, sehingga molekul DNA terikat pada membran silika. Kolom dicuci dengan Wash Buffer untuk membuang kontaminan. DNA kromosom dielusi dari membran silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution Buffer. 3.3 Teori DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan diantara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315–316; Raven & Johnson 2002: 94). DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki Praktikum Bioteknologi Farmasi

10

struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176–178). Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1). DNA kromosom dari sel eukariotik berukuran sangat panjang sehingga akan memiliki viskositas yang tinggi bila berada pada larutan air. Karena sifat kromosom DNA yang rentan, maka selama proses ekstraksi perlu dihindari penggunaan pipet tip berukuran sangat kecil serta pengocokan (Wink, 2011). DNA dapat diisolasi dari jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel lain. DNA adalah suatu asam nukleat yang larut dalam air, terpresipitasi sebagai makromolekul dalam campuran alkohol dan air. Isolasi DNA dibagi menjadi 2 tahap yaitu desintegrasi sel dari dinding sel, serta ekstraksi fasa air menggunakan fenol/kloroform atau agen ekstraksi hidrofobik lainnya (Wink, 2011). Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahanbahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CaCl. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam Praktikum Bioteknologi Farmasi

11

molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan. Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyaii membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang membentuk penghalang memisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. DNA terdapat didalam suatu sel sehingga untuk mengisolasi suatu DNA, harus dilakukan pemecahan sel secara fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical destruption, liquid homozigation, sonifikasi, freeze dan manual grinding.

Gambar 1. Skema Purifikasi DNA dari prokariot atau eukariot menggunakan kolom afinitas (Wink, 2011).

Praktikum Bioteknologi Farmasi

12

3.4 Bahan • Biakan bakteri E. coli BL21 yang telah diinkubasi selama 18 jam. • Medium pertumbuhan Luria Bertani (LB) cair yang telah disterilisasi. • Purelink™ Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific) yang mengandung reagen sebagai berikut: Proteinase K Solution, RNAse A Solution, Digestion Buffer, Lysis Buffer, Wash Buffer I, Wash Buffer II, Elution Buffer (10 mM TrisCl, pH 9,0, 0,1 mM EDTA), Purelink™ Genomic Spin Column dan tabung kolektor 2 mL. • Etanol 96 - 100%. 3.5 Alat 1.

Tabung Eppendorf 1,5 mL

2.

Sentrifugator

3.

Mikropipet 100-1000L, 50-200L dan 10-100L

4.

Tip mikropipet

5.

Lemari es 1 buah dan freezer -20 °C

6.

Waterbath

7.

Termometer

8.

Inkubator

9.

Sarung tangan

10. Beaker glass 11. Pembakar Spirtus 12. Vortex 3.6 Persiapan 1. Penyiapan Pereaksi: • Etanol (konsentrasi 96%) ditambahkan ke dalam PureLink™ Genomic Wash Buffer I dengan perbandingan volume (3:2) dan PureLink™ Genomic Wash Buffer II dengan perbandingan volume (7:3). • Sebelum digunakan, PureLink™ Genomic Digestion Buffer dan PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer diperiksa untuk mengetahui adanya pengendapan garam. Endapan yang terbentuk dapat dilarutkan

Praktikum Bioteknologi Farmasi

13

kembali dengan memanaskan larutan pada suhu 37 °C, lalu didinginkan pada suhu 25 °C. • Penanganan PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer dan PureLink™ Genomic Wash Buffer I harus menggunakan sarung tangan, karena keduanya mengandung zat pengiritasi. 2. Penyiapan Suspensi Bakteri: • Koloni bakteri E.coli BL21 diambil dari plate biakan berumur 18 jam, kemudian diinokulasikan ke dalam 5 mL medium LB (untuk 2 kelompok). Biakan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37 ºC dengan pengocokan 200250 rpm. Untuk hasil maksimal, volume labu Erlenmeyer yang digunakan minimal 4 kali volume biakan. • Sebanyak 1,5 mL biakan bakteri dimasukkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL, disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang. Sebanyak 1,0 mL biakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet bakteri, disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang. • Pelet bakteri ditambahkan 1,0 mL aquabidest, disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (5.000 x g) selama 5 menit, lalu supernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali. 3.7 Prosedur 1.

Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 180 μL PureLink™ Genomic Digestion Buffer, lalu ditambahkan 20 μL Proteinase K. Campuran dikocok menggunakan vortex atau melalui pemipetan berulang untuk menghasilkan suspensi yang homogen.

2.

Suspensi diinkubasi pada suhu 55 °C sambil sesekali di-vortex atau dimasukkan dalam shaking water bath sampai sel lisis secara sempurna (kirakira 30 menit).

3.

Sebanyak 20 μL RNase A Solution ditambahkan ke dalam suspensi, lalu dikocok menggunakan vortex. Campuran kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

14

4.

Sebanyak 200 μL PureLink™ Genomic Lysis/Binding Solution ditambahkan ke dalam campuran, lalu dikocok menggunakan vortex selama 5 detik hingga diperoleh campuran yang homogen.

5.

Sebanyak 200 μL etanol 96-100% ditambahkan ke dalam lisat, lalu dikocok menggunakan vortex atau resuspensi melalui pemipetan berulang.

6.

Lisat

(~620 μL)

yang sudah ditambahkan

PureLink™

Genomic

Lysis/Binding Solution dan etanol dituangkan ke PureLink™ Spin Column dalam tabung kolektor. Kolom disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 10.000 x g. Supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Kolom dimasukkan kembali ke dalam tabung kolektor yang sama. 7.

Sebanyak 500 μl PureLink™ Genomic Wash Buffer I ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 9.400 rpm (10.000 x g). Supernatan dalam tabung kolektor dibuang, lalu kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama.

8.

Sebanyak 500 μl PureLink™ Genomic Wash Buffer II (dengan penambahan etanol) ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan maksimum (14.000 x g). Jika larutan residu masih terlihat dalam kolom purifikasi, maka tabung kolektor dikosongkan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama selama 1 menit. Supernatan pada tabung kolektor dibuang dan kolom dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL baru.

9.

Sebanyak 200 μL PureLink™ Genomic Elution Buffer ditambahkan ke dalam kolom. Untuk mengelusi DNA kromosom. Kolom diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang, lalu disentrifugasi pada kecepatan maksimum (14000 x g) selama 1 menit.

10. Kolom purifikasi dilepaskan dari tabung Eppendorf. DNA murni dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu -20°C.

Catatan Jika diperlukan konsentrasi DNA yang lebih pekat, maka volume PureLink™ Genomic Elution Buffer dapat dikurangi menjadi 50 μL. Kemudian sentrifugasi dengan kecepatan maksimum (14.000 x g) selama 1,5 menit. Semakin sedikit volume PureLink™ Genomic Elution Buffer, semakin sedikit pula kadar DNA yang terelusi.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

15

Modul 4. Isolasi DNA Plasmid

4.1 Tujuan Memahami metode isolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif (E.coli BL21) menggunakan PrestoTM Mini Plasmid Kit (Geneaid). 4.2 Prinsip Pelet sel bakteri diresuspensi dan dilisis menggunakan SDS/basa untuk melepaskan DNA plasmid. Lisat dinetralisasi untuk menghasilkan kondisi pengikatan DNA plasmid ke membran silika pada kolom spin. Debris sel dan SDS diendapkan melalui sentrifugasi, lalu supernatan yang mengandung DNA plasmid dituang ke dalam membran pada kolom spin. DNA yang teradsorpsi dicuci untuk menghilangkan kontaminan, lalu DNA tersebut dielusi menggunakan Elution Buffer. 4.3 Teori Plasmid merupakan molekul DNA sirkular yang terdapat dalam sel bakteri. Plasmid biasanya membawa satu atau lebih gen, yang membawa informasi genetik termasuk gen yang resisten terhadap antibiotik tertentu. Contohnya dapat mendukung kemampuan sel bakteri untuk dapat bertahan secara normal dalam lingkungan yang mengandung konsentrasi antibiotika tertentu yang dapat bersifat toksik bagi sel bakteri tersebut. Semua plasmid memiliki sedikitnya suatu urutan DNA yang dapat berperan sebagai origin of replication (ori), sehingga plasmid dapat bermultiplikasi dalam sel tanpa tergantung pada kromosom bakteri. Oleh karena itu, plasmid berperan penting sebagai vektor kloning yang sering digunakan di bidang biologi molekuler dan bioteknologi. Keberadaan plasmid dan kromosom dalam sel bakteri menyebabkan perlunya teknik isolasi yang tepat untuk dapat membedakan plasmid dan kromosom. Pada dasarnya prinsip isolasi keduanya memiliki persamaan yaitu memisahkan DNA dari semua protein sel dan molekul RNA dengan cara lisis, ekstraksi, sentrifugasi dan pengendapan. Pemisahan DNA plasmid dari DNA kromosom dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran dan konformasinya. Ukuran kromosom sel bakteri lebih besar dari DNA plasmid, sehingga dapat dipisahkan bersama dengan protein sel menggunakan

Praktikum Bioteknologi Farmasi

16

sentrifugasi. Tahap pemurnian selanjutnya dilakukan dengan memperhatikan konformasi keduanya yang berbeda. Molekul DNA plasmid umumnya berada dalam bentuk superkoil (covalently closed circular - ccc form). Sedangkan fragmen DNA kromoson memiliki bentuk linier. Konformasi ccc tersebut dapat berubah menjadi relaks atau open circular (oc form) bila rantai nukleotida plasmid ada yang terputus. Bentuk ccc plasmid dapat dipisahkan dari fragmen linier dengan cara ultrasentrifugasi dalam larutan Cesium klorida dengan bantuan interkelar Etidium bromide. Dalam kondisi ini, konformasi ccc memiliki buoyant density yang lebih besar daripada fragmen linier dan oc plasmid, sehingga pita ccc DNA plasmid akan terletak dibawah pita linier dan oc DNA.

Gambar 2. Elektroforesis gel agarosa dari plasmid DNA dengan Etidium Bromida (Wink, 2011). Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah: a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri Praktikum Bioteknologi Farmasi

17

(bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994). Terdapat beberapa macam metode isolasiDNA plasmid sampai saat ini, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzymatic digestion (Devi dan Victor, 2009). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002). Pada percobaan ini, teknik isolasi plasmid dilakukan menggunakan detergen yang terdapat pada kit isolasi plasmid. Pellet sel bakteri diresuspensi dan diberi perlakuan dengan penambahan SDS / pelisis alkali untuk membebaskan DNA plasmid. Lisat bakteri yang dihasilkan dinetralkan untuk menciptakan kondisi yang sesuai untuk pengikatan DNA plasmid pada membran silika yang terdapat dalam kolom spin. Endapan yang mengandung debris sel dan SDS di-pellet menggunakan sentrifugasi, Praktikum Bioteknologi Farmasi

18

sedangkan supernatan yang mengandung DNA plasmid dilewatkan melalui membran kolom spin. DNA plasmid yang teradsorbsi dicuci untuk menghilangkan kontaminan dan di-elusi dengan sejumlah kecil buffer elusi (10 mM Tris-HCl, pH 8.5). DNA plasmid yang telah murni tersebut dapat digunakan lebih lanjut untuk semua prosedur biologi molekuler seperti pemotongan konvensional menggunakan enzim restriksi, pemotongan cepat menggunakan enzim restriksi FastDigest®, transformasi, dan sekuensing otomatis.

Gambar 3. Peta plasmid pUC19 (http://www.transomic.com/Vectors-and-Maps/pUC19.aspx) 4.4 Bahan 1. Plat biakan bakteri E. coli BL21 berumur 18 jam 2. Medium Luria Bertani (LB) cair steril 3. Ampicillin 100 g/mL dalam medium LB cair 4. Etanol 95% 5. Aquabidestillata 6. PrestoTM Mini Plasmid Kit (Geneaid): PD1 Buffer, PD2 Buffer, PD3 Buffer, True Blue Lysis Buffer, W1 Buffer, Wash Buffer, Elution Buffer, RNAse A (50 mg/ml), kolom PDH, dan Collection Tubes 2 mL.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

19

4.5 Alat 1.

Tabung Eppendorf 1,5 mL

2.

Mikrosentrifugator

3.

Mikropipet 100-1000L, 50-200L, dan 10-100L

4.

Tip mikropipet

5.

Lemari es dan freezer -20 °C.

6.

Waterbath

7.

Termometer

8.

Inkubator

9.

Sarung tangan

10. Beaker glass 20 mL 11. Pembakar spirtus 12. Vortex 4.6 Persiapan 1. Pembuatan Larutan Pereaksi: - Larutan RNase A yang terdapat dalam Presto™ Mini Plasmid Kit terlebih dahulu dimasukkan kedalam Buffer PD1 kemudian di-vorteks selama kurang lebih lima detik. - Setelah menambahkan RNase A, harap ceklis tutup botol. PD1 yang telah ditambahkan larutan RNase harus disimpan pada suhu 2-8 ºC selama maksimal 6 bulan. - Jika ditemukan endapan pada Buffer PD2, maka segera hangatkan buffer pada water bath dengan suhu 37 ºC disertai dengan pengocokan secara halus. - Tambahkan etanol absolut 96-100% (lihat label botol untuk mengetahui volumenya) kedalam Wash Buffer kemudian kocok selama beberapa detik. Ceklis tanda pada label botol bila etanol telah ditambahkan. Pastikan bahwa botol tertutup dengan rapat setelah digunakan untuk menghindari penguapan etanol. 2. Penyiapan Suspensi Bakteri: - Koloni bakteri E. coli BL21 diambil dari plat biakan berumur 18 jam, lalu diinokulasikan ke dalam 5 mL medium LB yang telah ditambahkan antibiotik ampicilllin 100 g/mL. Biakan diinkubasi selama 18 jam pada

Praktikum Bioteknologi Farmasi

20

suhu 37 ºC dengan pengocokan 200-250 rpm. Untuk hasil maksimal, volume labu Erlenmeyer yang digunakan minimal 4 kali volume biakan. - Untuk highcopy number plasmids (300-700 kopi/sel, seperti vektor pUC, pBluescript, pGEM, pTZ dan pZET), proses isolasi DNA plasmid sebaiknya menggunakan 1-5 mL kultur bakteri. Untuk low copy number plasmids (10-50 kopi/sel, seperti vektor pBR322 dan pACYC) dan verylow copy number plasmids (sampai 5 kopi/sel, seperti vektor pSC101) dapat digunakan maksimal 10 mL kultur bakteri. - Sebanyak 1,5 mL biakan bakteri dimasukkan dalam tabung Eppendorf 1,5 mL, disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (6.800 x g) selama 2 menit, lalu supernatannya dibuang. Sebanyak 1,0 mL biakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet bakteri, disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (6.800 x g) selama 2 menit, lalu supernatannya dibuang. - Pelet bakteri ditambahkan 1,0 mL aquabides, disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm (6.800 x g) selama 1 menit, lalu supernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali. 4.7 Prosedur 1.

Seluruh prosedur dilakukan pada suhu kamar.

2.

Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 200 μL Buffer PD1 menggunakan vortex atau dengan pemipetan berulang sampai tidak terdapat sisa gumpalan.

3.

Suspensi bakteri ditambahkan 200 μL Buffer PD2. Tabung dikocok dengan cara dibolak-balik 10 kali sampai larutan menjadi kental dan agak jernih. Diamkan pada suhu ruangan sekitar 2 menit. Catatan: - Pengocokan tidak boleh menggunakan vortex, karena dapat menyebabkan pemotongan DNA plasmid. - Larutan tidak boleh diinkubasi lebih dari 5 menit, karena dapat menyebabkan denaturasi bentuk superkoil dari DNA plasmid.

4.

Sebanyak 300 μL Buffer PD3 ditambahkan ke dalam larutan tersebut, lalu tabung dikocok dengan cara dibolak-balik 10 kali. Catatan:

Praktikum Bioteknologi Farmasi

21

- Pengocokan tidak boleh menggunakan vortex, karena dapat menyebabkan pemotongan DNA plasmid. - Pengocokan harus dilakukan perlahan untuk mencegah terbentuknya endapan debris sel bakteri. - Lisat bakteri yang telah dinetralkan akan berwarna keruh dan kental. 5.

Lisat bakteri disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 3 menit untuk memisahkan pelet debris sel dan DNA kromosom. Jika sel bakteri yang digunakan > 5 mL sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 10.000 rpm (16-20.000 x g) selama 5-8 menit. Selama sentrifugasi, tempatkan PDH Column dalam Collection Tube 2 mL.

6.

Transfer semua supernatan ke PDH Column. Pastikan proses transfer tidak mengganggu endapan putih yang terbentuk.

7.

Supernatan tersebut disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14 -16.000 x g) selama 30 detik pada suhu ruang. Cairan pada tabung kolektor dibuang, lalu, tempatkan PDH Column dalam Collection Tube 2 mL.

8.

Untuk Keperluan Meningkatkan Kualitas Sekuensing: Sebanyak 400 μL Buffer W1 ditambahkan ke dalam kolom PDH, lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 30 detik. Cairan pada tabung kolektor dibuang, lalu kolom PDH ditempatkan dalam Collection Tube 2 mL.

9.

Untuk Keperluan Purifikasi Standar DNA Plasmid: Sebanyak 600 μL Wash Buffer (pastikan yang ditambahkan adalah etanol absolut) ditambahkan kedalam kolom PDH, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 30 detik pada suhu ruangan. Cairan pada tabung kolektor dibuang, lalu kolom PDH ditempatkan dalam Collection Tube 2 mL. Sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 3 menit pada suhu ruangan untuk mengeringkan matriks kolom.

10. Pindahkan kolom PDH yang telah dikeringkan ke tabung sentrifugasi 1,5 ml yang baru. Lalu tambahkan 50 μL Elution Buffer, TE atau air ke bagian tengah membran matriks kolom untuk mengelusi DNA plasmid

(tip

mikropipet tidak boleh menyentuh membran kolom). 11. Tabung kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang, agar Elution Buffer, TE atau air

dapat diserap sempurna. Lalu disentrifugasi pada

Praktikum Bioteknologi Farmasi

22

kecepatan 10.000 rpm (14-16.000 x g) selama 2 menit pada suhu ruang untuk mengelusi DNA yang telah dimurnikan. 12. DNA plasmid hasil isolasi dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu -20°C.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

23

Modul 5. Pemetaan DNA Plasmid

5.1 Tujuan Memahami pemetaan DNA plasmid melalui tahapan reaksi pemotongan/restriksi DNA dengan menggunakan beberapa enzim restriksi yang berbeda. 5.2 Prinsip DNA yang telah dipurifikasi di inkubasi pada suhu 37 ºC dengan enzim restriksi (endonuklease restriksi) menghasilkan DNA yang terpotong pada posisi yang sesuai dengan sisi restriksi. Kontrol negatif, yaitu sample yang diinkubasi tanpa penambahan enzim restriksi, akan tetap utuh. 5.3 Teori Sebelum DNA dapat dimanipulasi dan dilakukan rekombinasi, peta DNA restriksi perlu diketahui terlebih dahulu. Peta restriksi suatu DNA adalah tempat pemotongan enzim restriksi pada DNA tersebut. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah pemotongan/restriksi DNA plasmid dan DNA kromosom menggunakan enzim restriksi endonuklease. Enzim-enzim restriksi, seperti BamHI, EcoRI dan PstI, berasal dari beberapa bakteri. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4-8 bp yang berupa pasangan basa palindrom. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda–beda pada suatu fragmen DNA, misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan

−G−G−A−T−C−C− −𝐶−𝐶−𝑇−𝐴−𝐺−𝐺

yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing–masing strand (Lodish et al.), AGCT merupakan sisi pengenalan AluI, GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended), namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky endedatau overhanging end). Molekul DNA yang dihasilkan dapat memiliki ujung lengket maupun ujung tumpul. Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada: ukuran fragmen, blunt-ended atau sticky-ended

Praktikum Bioteknologi Farmasi

24

fragment, sensitivitas terhadap metilasi, kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Enzim restriksi dengan sekuens pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Sticky ended biasanya lebih efisien dalamligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzim khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Metilasi biasanya terjadi pada DNA makhluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama.

Gambar 4. Sisi restriksi dari enzim restriksi XbaI, AluI, dan PstI yang berupa sticky ends atau blunt ends. Sisi restriksi diperlihatkan dengan tanda panah merah (Wink, 2011). Komponen reaksi (master mix) restriksi terdiri dari: air, DNA, buffer dan enzim. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10–50 µL. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion), diantaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 µg DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim: DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam Praktikum Bioteknologi Farmasi

25

menentukan reaksi. Meskipun demikian, sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/µg untuk dapat terpotong sempurna. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA. Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasilyang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

26

Gambar 5. Struktur umum plasmid pUC19 5.4 Bahan 1.

Plasmid pUC19

2.

Enzim restriksi BamHI

3.

Enzim restriksi HinDIII

4.

Enzim restriksi PstI

5.5 Alat 1.

Mikrosentrifuga

2.

Tabung mikrosentrifuga

3.

Sarung tangan

4.

Mikropipet

5.

Tip mikropipet

6.

Pemanas air (water bath)

7.

Termometer

8.

Lemari pendingin dan frezeer -20 °C

Praktikum Bioteknologi Farmasi

27

5.6 Persiapan Praktikum ini menggunakan sampel DNA plasmid yang telah diisolasi oleh masing-masing kelompok praktikan pada modul isolasi DNA plasmid. 5.7 Prosedur 1.

Sebanyak 5-10 µg DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmenfragmen, 2 µl larutan penyangga reaksi 10x (10%), 1 µl enzim restriksi (10 unit/µl) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 µl dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 µl (dengan urutan: dH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.

2.

Selesai inkubasi, dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzimtelah memotong DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C.

3.

Selanjutnya, dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya. Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: BamHI, HindIII, dan Nde I.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

28

Modul 6. Polymerase Chain Reactions (PCR)

6.1 Tujuan Memahami prinsip mekanisme PCR dalam perbanyakan suatu gen. 6.2 Prinsip Sejumlah DNA ditambahkan ke dalam campuran buffer yang mengandung DNA polymerase, primer-primer oligonukleotida, deoksinukleotida, dan kofaktor Mg2+. Campuran reaksi dalam tabung dimasukkan ke dalam thermal cycler dan rangkaian reaksi diawali dengan denaturasi, penempelan (annealing), dan pemanjangan (ektension). Campuran PCR tadi direplikasi sebanyak 20-30 siklus, setiap siklus akan diamplifikasi secara eksponensial. 6.3 Teori PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90 oC. Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu: 1. Denaturasi Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94

o

C yang

menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.

Gambar 6. Untai DNA mengalami denaturasi (Innis M., et al., 1990)

Praktikum Bioteknologi Farmasi

29

2. Penempelan (Annealing) Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik. Untai cetakan

Daerah target

Primer

Primer

Untai cetakan

Gambar 7.

Penempelan primer dengan untai DNA yang telah terdenaturasi (Innis M., et al., 1990)

3. Pemanjangan (Ektension) Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

Gambar 6. Perpanjangan DNA secara semi-konservatif (Innis M., et al., 1990) Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan

Praktikum Bioteknologi Farmasi

30

menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial (Marks Dawn, et al., 2000). Gen target

Amplifikasi secara eksponensial

Juta kopi

Gambar 7. Proses amplifikasi DNA target (Innis M., et al., 1990)

Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu: 1. DNA cetakan / DNA target Merupakan

keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung

fragmen DNA target. 2. Primer Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb(pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu : a. Panjang primer : 15-30 pb b. Kandungan GC sekitar 50 c. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda. d. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari e. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin 3. DNA Polimerase Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. Praktikum Bioteknologi Farmasi

31

4. Buffer / Dapar Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. 5. dNTPs dNTPs atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target (Innis M. and Gelfand D. in White Thomas, 1990). 6.4 Bahan 1.

Air suling

2.

Agarosa

3.

Primer forward (5’GGTTAC(G/C)TTGTACGACTT3’)

4.

Primer reverse (5’AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG 3’)

5.

Deoksinukleotida trifosfat (dNTP)

6.

Taq DNApolymerase

7.

Magnesium klorida (MgCl2)

8.

Marka DNA

9.

Etanol 96%

10. Aquabidest 11. Loading Dye 12. SYBR® Green 13. DNA kromosom E. coli 6.5 Alat 1. Mesin Thermo Cycler / PCR 2. Mikropipet 3. Tip Mikropipet 4. PCR working chamber 6.6 Persiapan Komponen-komponen yang diperlukan dalam proses PCR dicampurkan dalam Eppendorf dengan total volume 50 µL. Campuran terdiri dari : 1 µL templat DNA,

Praktikum Bioteknologi Farmasi

32

sepasang primer forward 16s rRNA dan reverse 16s rRNA masing-masing 20 pmol sebanyak 2 µL ,10 mM dNTP sebanyak 1 µL, 5 µL dapar PCR, 25 mM Mg2+ sebanyak 5 µL, 5 unit/µL Taq polymerase sebanyak 0,4 µL dan ditambahkan air suling ganda hingga 50 µL. 6.7 Prosedur PCR dilakukan dengan tahap denaturasi awal 94 oC selama dua menit; siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 oC selama satu menit, penempelan (annealing) pada suhu 48 oC selama satu menit, dan pemanjangan fragmen DNA oleh Taq polimerase (polimerisasi) pada 72 oC selama satu menit, reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus. Pemanjangan fragmen DNA akhir pada 72 oC selama 10 menit.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

33

Modul 7. Transformasi Plasmid

7.1 Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi DNA rekombinan (plasmid/vektor yang disisipi gen insert) menggunakan sel kompeten. 7.2 Prinsip 1. Pembuatan sel kompeten. 2. E. coli BL21 dibiakkan dalam suspensi media, pada saat mid-log phase diambil dengan cara sentrifugasi dan inkubasi dalam es dengan penambahan larutan CaCl2 dingin. 3. Transformasi E.coli BL21 dengan plasmid rekombinan. 4. DNA rekombinan ditambahkan ke dalam sel kompeten disertai dengan kontrol. Campuran sel kompeten dan DNA plasmid diinkubasi dalam es kemudian diberi kejut panas (heat-shock) pada suhu 42 oC dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC. 5. Seleksi koloni E. coli BL21 yang telah disisipi DNA plasmid rekombinan dengan menggunakan cawan LB cair steril yang mengandung antiobiotik spesifik, X-Gal, dan IPTG. 7.3 Teori Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mula‐mula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNA‐nya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri yang lain dalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra. Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E. coli. Sel E. coli ditambahkan gen insert yang disisipkan ke dalam plasmid rekombinan.

Setelah diinkubasi, sel tersebut akan memperbanyak diri

Praktikum Bioteknologi Farmasi

34

sehingga jumlahnya menjadi banyak. Pada percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif terhadap ampisillin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisillin. Jika transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan mengekspresikan gen resisten ampisillin sehingga dapat bertahan hidup pada media yang mengandung ampisillin. Transformasi hanya dapat dilakukan pada sel yang kompeten. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk menerima DNA telanjang. Terdapat beberapa bakteri yang mampu menjadi kompeten secara alami sedangkan bakteri lain umumnya harus dibuat menjadi kompeten. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

Gambar 8. Beberapa jenis teknik transfer molekul DNA. (a) Transformasi; (b) Transduksi; (c) Konjugasi (www.nature.com). Bakteri memiliki kemampuan untuk mengambil DNA telanjang dari lingkungannya (DNA eksogenous) dengan tiga cara yakni konjugasi, transduksi dan transformasi. Hanya transformasi yang merupakan jalur langsung pengambilan DNA, dikarenakan untuk konjugasi dibutuhkan kontak antar sel via sex pilus dan transduksi

Praktikum Bioteknologi Farmasi

35

membutuhkan peran bakteriofaga untuk mentransfer DNA dari satu sel ke sel bakteri lain. Sel bakteri mampu mengambil eksogenous DNA jika sel tersebut berada dalam kondisi kompeten. Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat fenotip sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan karakterisasi dari fenotip gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut. 7.4 Bahan 1. Sel E. coli BL21 2. Medium Luria Bertani cair steril 3. Medium Luria Bertani agar steril 4. Antibiotik spesifik (menyesuaikan dengan gen resistensi yang terkandung dalam DNA plasmid) 5. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 6. 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl -D-Galactopyranoside (X-Gal) 7.5 Alat 1.

Termometer

2.

Tabung mikrosentrifuga

3.

Mikropipet

4.

Tip Mikropipet

5.

Microsentrifugator

6.

Pemanas air (water bath)

7.

Jarum Ose

8.

Cawan Petri

9.

Erlenmeyer

10. Shaker-incubator

Praktikum Bioteknologi Farmasi

36

7.6 Prosedur 1.

Kultur semalam strain E. coli Top 10 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli Top 10 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam).

2.

Pindahkan kultur E. coli Top 10 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli Top 10 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC.

3.

Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4.

Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

5.

Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam.

6.

Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan plasmid.

7.

Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

8.

Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.

9.

Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

37

10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19

rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun

(tabung nomor 5). 11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. 12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC. 13. Disiapkan media cawan LB/Kloramfenikol/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/kloramfenikol, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. 14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/kloramfenikol/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. 15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/kloramfenikol/X-Gal/IPTG. 16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. 17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pCAMBIA dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.

Metode lain yang dapat digunakan untuk proses transformasi adalah dengan menggunakan metode heat shock di media TSS. Terdapat dua tahap utama pada metode ini, yaitu: 1.

Pembuatan Sel Kompeten Metode Heatshock dengan Media TSS Hasil ligasi atau plasmid yang akan ditransformasikan ke E. coli TOP10, terlebih

dahulu dibuat kompeten dengan media TSS menggunakan metode heat shock (Chung dkk, 1989). Sel E. coli TOP10 dikultur ke dalam 5 mL media LB cair dan diinkubasi pada 37 °C, 150 rpm selama 18 jam. Sebanyak 2,5 mL kultur dimasukkan ke dalam Praktikum Bioteknologi Farmasi

38

50 mL LB cair dan diinkubasi pada 37 °C, 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD600 mencapai 0,3-0,4. Kultur dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL yang sebelumnya telah didinginkan di dalam es. Pelet sel dipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan 3270 g, 4 °C selama 5 menit. Selanjutnya sebanyak 5 mL pelet sel diresuspensikan dengan 200 μL media TSS. Sel E. coli TOP10 kompeten disimpan pada 4 °C. 2.

Proses Transformasi Sel E. coli TOP10 kompeten sebanyak 200 μL ditambahkan hasil ligasi sebanyak

15 μL. Kontrol viabilitas digunakan air bebas nuklease steril serta kontrol positif berupa pETDUET1 tanpa DNA sisipan. Campuran tersebut diinkubasi pada 4 °C selama 30 menit. Proses heat shock dilakukan pada 42 °C selama 90 detik dan tabung sampel segera diinkubasikan ke dalam es selama 2 menit. Media LB cair sebanyak 750 μL ditambahkan ke dalam tabung, lalu tabung tersebut diinkubasi kembali pada 37 °C, 150 rpm, selama 90 menit. Selanjutnya campuran hasil heat shock dipekatkan menjadi 100 μL dengan cara sentrifugasi 3270 g selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi kembali dengan media 100 μL yang tersisa dan disebar pada media LB padat yang mengandung ampisilin 100 μg/mL. Sebanyak 100 μL kontrol negatif dan kontrol positif diperlakukan sama seperti sampel. Setelah itu, media LB padat tersebut diinkubasi pada 37 °C selama 18 jam.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

39

Modul 8. Elektroforesis Gel Agarosa

8.1 Tujuan Mahasiswa dapat memahami teknik untuk memisahkan berbagai sampel DNA berdasarkan ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekul menggunakan elektrofosesis gel agarosa. 8.2 Prinsip Pada tahapan ini, loading buffer ditambahkan ke dalam suspensi DNA dengan tujuan untuk menambah densitas dan mewarnai DNA sehingga memudahkan penandaan migrasi DNA. Suspensi DNA tersebut lalu dipipet ke dalam sumur gel agarosa. Larutan etidium bromida (1µl/100mL) ditambahkan ke dalam larutan gel agarosa sebelum gel membeku. Visualisasi DNA hasil elektroforesis dilakukan dengan mengamati pita DNA yang terdifusi dalam gel agarosa pada transluminator UV. Berat molekul dan kuantitas jumlah DNA diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi fragmen-fragmen DNA standar (DNA marker). 8.3 Teori Elektroforesis gel merupakan metode untuk mendeteksi keberadaan DNA dan memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan muatan dan ukurannya. DNA merupakan molekul bermuatan negatif. Jika diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda) melalui matriks gel. Kecepatan migrasi DNA dalam gel ditentukan oleh: 1. Ukuran molekul DNA Semakin kecil ukuran DNA, semakin cepat migrasinya. 2. Konsentrasi/kerapatan gel Semakin tinggi konsentrasi/kerapatan gel, semakin lambat migrasi DNA. 3. Arus listrik yang digunakan Semakin besar arus listrik yang digunakan, semakin cepat DNA bermigrasi. Gel yang biasa digunakan adalah agarosa dan poliakrilamida. Elektroforesis gel agarosa dapat memisahkan fragmen DNA berukuran beberapa ratus base pair (bp) sampai 20.000 bp tergantung dari konsentrasi gel.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

40

Gambar 9. Prinsip pemisahan fragmen DNA menggunakan metode elektroforesis (genome.cbs.dtu.dk) Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus ditambahkan loading buffer yang mengandung bromofenol biru dan xylene cyanol, lalu dipipet ke dalam sumur gel. Loading buffer berfungsi sebagai: 1. Penambah densitas, sehingga suspensi DNA akan jatuh ke dasar sumur gel. 2. Pewarna untuk memudahkan memipet suspensi DNA ke dalam sumur. 3. Penanda migrasi dengan laju yang dapat diperkirakan, sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA ke arah anoda. Deteksi atau visulisasi DNA dilakukan dengan menambahkan larutan etidium bromida pada gel. Cara lainnya adalah merendam gel dalam larutan etidium bromida, sebelum diamati di atas transluminator UV. Etidium bromida akan terinterkalasi di antara molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat berfluoresensi di atas sinar ultra violet. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi fragmen-fragmen DNA standar (DNA marker). DNA marker adalah fragmen-fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya. Pembandingan pita-pita DNA dalam gel dengan DNA standar juga dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

41

8.4 Bahan 1.

DNA marker, seperti gene ruler 1Kb dan DNA λ/HindIII.

2.

Suspensi DNA berupa DNA kromosom bakteri, DNA plasmid dan DNA plasmid hasil restriksi.

3.

Agarosa.

4.

Larutan dapar TAE 50x (242 g Tris-base; 57,1 g asam asetat glasial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 mL).

5.

Akuades.

6.

Loading dye 6x (0,25% bromofenol biru; 0,25% xylene cyalol FF, sukrosa 40%).

7.

Etidium bromida.

8.5 Alat 1.

Gelas ukur 1000 mL

2.

Labu Erlenmeyer 50 mL

3.

Tabung Eppendorf

4.

Sarung tangan

5.

Mikropipet

6.

Tip mikropipet

7.

Kertas parafilm

8.

Alat elektroforesis gel

9.

Transluminator UV

10. Kaca mata UV 11. Kamera digital 8.6 Persiapan Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencampurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.

Praktikum Bioteknologi Farmasi

42

8.7 Prosedur 1.

Gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,2 g agarosa ke dalam larutan dapar TAE 1x hingga volume 20 mL dalam Erlenmeyer. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna (jernih).

2.

Baki gel agarosa disiapkan dengan melekatkan selotip di kedua ujung baki, lalu sisir elektroforesis dipasang pada salah satu ujung baki.

3.

Diamkan larutan agarosa hingga bersuhu sekitar 50-60

0

C kemudian

tambahkan larutan etidium bromida 0,2 µl (1µl/100mL), goyang erlenmeyer sehingga larutan gel menjadi homogen. 4.

Tuangkan larutan gel ke dalam baki gel agarosa, lalu dibiarkan sampai beku. Sisir elektroforesis dicabut dengan hati-hati, lalu selotip pada ujung-ujung baki dilepaskan.

5.

Gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi larutan dapar TAE 1x. Seluruh permukaan gel harus terendam dalam TAE.

6.

Buatlah 10 µL suspensi DNA (masing-masing DNA marker, DNA kromosom, DNA plasmid dan DNA plasmid hasil restriksi) dan 2 µlL loading dye 6x di dalam tabung eppendorf 1,5 mL. Homogenkan campuran melalui pemipetan berulang menggunakan mikropipet.

7.

Campuran DNA masing-masing dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa. Nomor sumur dan jenis suspensi DNA yang dimasukkan harus dicatat.

8.

Kabel dari sumber arus dihubungkan ke tangki elektroforesis, dimana kabel yang tersambung ke kutub negatif harus berada di dekat sumur). Sumber arus dinyalakan sumber arus, voltase diatur pada 90 Volt, kekuatan arus 400 mA dan waktu running selama 45 menit. Elektroforesis dirunning dengan menekan tombol run pada sumber arus.

9.

Setelah elektroforesis selesai, maka sumber arus dimatikan dan baki diangkat dari tangki elektroforesis. Gel dikeluarkan dari baki elektroforesis (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).

10. Gel diletakkan di atas transluminator UV. Tansluminator dinyalakan, lalu pita-pita DNA yang tervisualisasi diamati (jangan lupa menggunakan kacamata UV).

Praktikum Bioteknologi Farmasi

43

11. Berat

molekul

dan

kuantitas

jumlah

DNA

diperkirakan

dengan

membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi fragmen-fragmen DNA standar (DNA marker).

Praktikum Bioteknologi Farmasi

44

Modul 9. Elektroforsesis Gel Poliakrilamid

9.1 Tujuan Mahasiswa dapat memahami teknik untuk memisahkan berbagai sampel protein berdasarkan ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekul menggunakan elektrofosesis gel poliakrilamid. 9.2 Prinsip Protein memiliki ikatan hidrofobik yang signifikan dan memungkinkan berikatan kuat dengan molekul lainnya, seperti lipid, melalui interaksi hidrofobik. Pemanasan sampel pada suhu minimal 60 °C dapat merusak molekul tersebut, sehingga memudahkan SDS untuk berikatan dengan daerah hidrofob dan menyempurnakan denaturasi. 9.3 Teori Protein terdiri dari satu atau lebih polipeptida dan atau molekul samping, yang disatukan oleh sejumlah interaksi molekuler, umumnya ikatan kovalen. Interaksi tersebut menghasilkan protein dengan level struktur yang berbeda, yaitu primer, sekunder, tersier, dan kuartener. Protein utuh umumnya sulit untuk dipecah secara reprodusibel. Pola pita bervariasi tergantung dari suhu, buffer, variasi pH, kualitas preparat dan lain lain. Untuk mengkarakterisasi tipe preparat, maka perlu dilakukan pemecahan bagian protein sehingga diperoleh bentuk primernya saja.

Gambar 10. Prinsip analisis migrasi menggunakan SDS-PAGE. (A) arah migrasi elektroforesis; (B) elektroforesis berdasarkan perbadaan molekul

Praktikum Bioteknologi Farmasi

45

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan salah satu teknik yang umum digunakan untuk mengkarakterisasi protein berdasarkan ukuran bobot molekulnya. SDS berikatan dengan bagian hidrofob protein, merusak lipatan struktur, dan membuatnya stabil dalam larutan dengan konformasi yang dipanjangkan. Dengan demikian, panjang komplek SDS-protein sebanding dengan bobot molekul proteinnya. 9.4 Bahan 1.

Biakan E. coli

2.

Media LB cair

3.

Media LB padat

4.

Acrylamide

5.

Bis- acrylamide

6.

Tris

7.

Sodium Duodecyl Sulphate

8.

TEMED

9.

Ammonium persulfate

10. 2-mercaptoethanol 11. Gliserol 12. Bromophenol blue 13. Glisin 14. HCl 15. DTT 9.5 Alat 1.

Tray untuk mencetak gel poliakrilamid

2.

Comb untuk membuat well pada gel poliakrilamid

3.

Satu set alat elektroforesis gel poliakrilamid

4.

Power supply

5.

Waterbath

6.

Mikropipet

7.

Tabung Eppendorf

8.

Sentrifuga

Praktikum Bioteknologi Farmasi

46

9.6 Persiapan Persiapan yang dilakukan meliputi penyiapan pereaksi dan buffer, dengan komposisi yang tercantum dalam prosedur. 9.7 Prosedur 1. Bakteri E. coli top 10 dibiakkan dalam 10 mL LB cair kemudian diinkubasi pada 37 oC selama 18 jam dengan 150 putaran per menit 2. Sel kemudian dipanen dengan cara sentrifugasi pada 7000 putaran per menit selama 10 menit pada suhu 4 oC. 3. Pelet sel dicuci dengan 1,5 mL dapar Phosphat Buffer Saline (PBS) steril untuk memisahkan sel dari media dan disentrifuga pada 7000 putaran per menit selama 10 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang diperoleh dibuang. 4. Pelet sel kemudian diresuspensikan kembali dengan 1,5 mL PBS steril dan ditambahkan Phenyl methyl sulfonyl flourida (PMSF) 1 mM. 5. Untuk memperoleh protein total maka sel harus dipecah dengan

penambahan buffer lisis sebanyak 0,75 mL. Komponen buffer lisis adalah sebagai berikut :

50 mM Tris-HCl pH 7.5 100 mM NaCl 1 mM DTT (untuk protein intrasel) 5% glycerol 6. Suspensi tersebut diinkubasi pada suhu 30ºC selama 15 menit atau 30 menit dalam es 7. Tabung dikocok dengan cara dibolak-balik 4-6 kali sampai larutan menjadi kental dan agak jernih. 8. Protein dipisahkan dari pecahan sel dengan cara sentrifugasi selama 10 menit, 10.000 putaran per menit, 4 oC. 9. Protein total yang diperoleh kemudian ditambahkan dengan buffer sampel yang terdiri dari 0,6 mL trisHCl 1 M pH 6,8; 5 mL gliserol 50 %; 2 mL SDS 10 %; 0,5 mL 2-merkaptoetanol; 1 mL bromofenol biru 1 %; dalam

Praktikum Bioteknologi Farmasi

47

10 mL air suling, dengan perbandingan sampel : sampel buffer = 1:1, kemudian dipanaskan dalam air selama 10 menit pada suhu 60 oC. Campuran ini dan marka protein dimasukkan ke dalam masing-masing sumur pada gel elektroforesis sebanyak maksimal 20 µL. 10. Profil protein total diketahui menggunakan SDS-PAGE dengan konsentrasi poliakrilamid 15 % (b/v).

SDS PAGE diawali dengan

pembuatan separating gel 15 % dan stacking gel

4 %. Komposisi gel

tersebut adalah sebagai berikut : Bahan

“Separating gel”

“Stacking gel”

15%

4%

Akrilamid/bis-Ak 30%

4,00 ml

333 l

Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)

2,50 ml

–

Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8)

–

0,5 ml

SDS 10% (b/v)

100 l

100 l

Air suling

2,35 ml

1,00 ml

APS 10% (b/v)

50 l

15 l

TEMED

5 l

5 l

11. Akrilamid/bis 30% (b/v) dibuat dari bahan sebagai berikut : 29,2 g akrilamid; 0,8 g bis-akrilamid dilarutkan dalam air suling hingga volume 100 mL. 12. Gel yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam alat elektroforesis dan direndam

dalam

dapar

elektroforesis.

Komposisi

larutan

dapar

elektroforesis adalah sebagai berikut : 3 g Trisma basa; 14,4 g glisin; 1 g SDS; dan air suling hingga 1 L, dengan pH 8,3. 13. Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 150 Volt selama 45 menit. 14. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan larutan pewarna (staining). Larutan staining dibuat dari bahan-bahan sebagai berikut : 1 g “Coomassie Blue R-250; 450 metanol; 100 ml asam asetat glasial; 450 ml air suling. Gel yang telah terwarnai tersebut dibilas dengan air suling, kemudian direndam dalam larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel yang tidak mengandung pita protein. Larutan destaining dibuat dari bahan

Praktikum Bioteknologi Farmasi

48

sebagai berikut : 400 ml metanol; 100 ml asam asetat glasial; 500 ml air suling 15. Ukuran protein sebagai pita dideteksi berdasarkan bobot molekul relatif protein menggunakan marka protein sebagai acuan

Praktikum Bioteknologi Farmasi

49