Medio De Cultivo.docx

Medio de cultivo Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio (véase microbiología) que consta de un gel o una solución que contiene los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Los virus, por ejemplo, son obligados parásitos intracelulares, por lo que necesitan un medio que contenga células vivas. Según sus cualidades físicas[editar] 

líquidos

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semisólidos

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sólidos Según su formulación[editar] 

Químicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de cada uno de los compuestos que hay en el medio.

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Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre, etc.); no se conoce exactamente cuál es la composición del medio; sin embargo, presenta la ventaja de que ya están presentes todos o casi todos los elementos que una célula puede requerir. Según su uso[editar] 

Medio general: medio en donde crecen todo tipo de microorganismos, excepto los que necesitan condiciones especiales (por ejemplo, agar CLED). El Agar cistina-lactosa deficiente en electrólitos o CLED (Cysteine lactose electrolyte deficient) es un medio de cultivo no inhibitorio usado en el aislamiento y diferenciación de organismos urinarios. Al ser deficiente en electrólitos, previene del crecimiento exagerado de las especies de Proteus. La cistina promueve la formación de colonias enanas dependientes de cistina. Los fermentadores de lactosa producen colonias amarillas en el agar de CLED; las NO fermentadoras de lactosa dan colonias azules. Tiene un pH aproximado de 7.3.

El agar CLED o agar Brolacin tiene la característica de ser semitransparente y por la acción del azul de bromofenol las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa se tiñen de color amarillo mientras que las no fermentadoras se tiñen de azul. El agar de CLED contiene: Peptona 'Lab powder

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4g/l Lemco'

3g/l

Triptona

4g/l

Lactosa

10g/l

L-Cistina

128 mg/l

Azul de bromotimol

20 mg/l

Agar No. 1

15g/l

Medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado (hongos, bacterias entéricas, protozoos...). Un medio selectivo es un medio de cultivo en el que sólo puede crecer un tipo de microorganismo (hongos, bacterias entéricas, protozoos...). Un ejemplo de medio selectivo sería usar un medio rico en un antibiótico, como la ampicilina, para permitir únicamente el crecimiento de las bacterias resistentes a éste. 

Medio diferencial: permite identificar una especie con otra, ambas en el mismo medio. Puede ser por su crecimiento, su metabolismo,su respiración, etc. (por ejemplo, medio de McConkey).Un medio diferencial consiste en un medio de cultivo que es capaz de distinguir dos microorganismos por su crecimiento diferencial en el mismo, usando las propiedades metabólicas de ambos en presencia de un determinado nutriente y de un indicador que evidencia por ejemplo, un pH ácido en su entorno.

Existen muchos medios diferenciales, en la práctica rutinaria se usan los siguientes: Agar TSI: Triple sugar iron (hierro tres azúcares) El Agar-hierro-triple azúcar es un medio de cultivo. Gracias a su composición es uno de los medios de cultivo más empleados para la diferenciación de enterobacterias según:

Fermenten o no glucosa. Fermenten o no lactosa o sacarosa. Produzcan o no ácido sulfhídrico. Produzcan o no gas. Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son: Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificará el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de color rojo. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su superficie volviéndolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuará de color rojo. Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo. La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas. Composición Peptona 159 g Extracto de levadura 3 9.9g Extracto de carne 3 g Sacarosa 10 g Sulfato de hierro 0,20 g Cloruro sódico 5g Tiosulfato de sodio 0,30 g Rojo fenol 0,024 g Agar citrato Agar urea Caldo peptonado: para prueba de indol Caldo MR-VP: para prueba rojo metilo y Voges Proskauer LIA: Lisine iron agar (lisina hierro) SLU: Sacarosa, lactosa y urea. Visualizaciòn de movimiento OF: Oxidación-fermentación. Para diferenciar metabolismo aerobio y anaerobio. 

Medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes tipos de microorganismos en un mismo medio. Un medio de enriquecimiento es un medio de cultivo que contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, entre ellos algunos de los más exigentes. Se utilizan comúnmente para la cosecha de diferentes tipos de microbios que están presentes en la muestra. En general el uso de los medios de enriquecimiento se utiliza para determinar ausencias de un microorganismo determinado, o detectar si tengo alguno pero está en muy baja proporción. Ciertos organismos no crecen en medios de cultivo ordinarios. Requieren ingredientes que promueven el crecimiento, como la sangre, glucosa, suero, huevo, entre otros. Los medios de

enriquecimiento contienen ingredientes que aumentan las cualidades estimulantes del medio propiciando un crecimiento elevado.Otra característica de los medios de enriquecimiento es que pueden contener componentes químicos que inhiben ciertos tipos de microorganismos. De este tipo de Medios de cultivo se puede obtener un subcultivo de una colonia aislada. 1

Este método se utiliza para los microbios que se encuentran en pequeñas cantidades en la muestra y cuyo crecimiento es lento, que las especies presentes. Algunas bacterias tienen requisitos muy específicos para su crecimiento. El principio del cultivo de enriquecimiento es el control de los nutrientes y las condiciones de cultivo (la temperatura, el suministro de aire, luz, etc pH) de tal manera que se adapte sólo a la especie. Si un medio que contiene una solución salina con NaNO2 a pH 8,5 se inocula con una muestra de tierra de jardín y se incubaron en el aire en la oscuridad a 25-30 ° C, las colonias puras de Nitrobacter se puede obtener. Los cultivos de bacterias del suelo, otras pueden ser selectivamente enriquecido por la variación de la composición del medio y las condiciones de incubación2

Algunos ejemplos de medios de cultivo de enriquecimiento son: Agar sangre, un medio enriquecido en el que los suplementos de la sangre les proporciona todos los nutrientes básicos. El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5 % de sangre ovina, 1también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de Virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: 2  alfa: halos verdosos (oxidación de la hemoglobina de los glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio)  beta: halos incoloros (hemolisis total)  gamma: inexistencia de halos (sin hemolisis) FUNDAMENTO: Dada la excelente base nutritiva, permite el crecimiento de prácticamente todos los microorganismos que pudieran estar presentes. Si se añade sangre se pueden determinar las distintas formas de hemólisis que pudieran tener lugar. Si se calienta se obtiene el Agar Chocolate, también muy empleado. Por la adición de distintos antibióticos se obtienen medios con caracteres selectivos. Fórmula (por litro): Infusión de Corazón (a partir de 375 g)........................... 10,0 g Peptona de Carne ...................................... 10,0 g Sodio Cloruro ............................................. 5,0 g Agar Agar............................................................ 15,0 g pH final: 7,3 ±0,2 Preparación: Suspender 40 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullición y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121º C durante 30 minutos (para cantidades de más

de 1 litro). Homogeneizar y distribuir en tubos de ensayo y esterilizar a 121º C durante 15 minutos. Para preparar placas de Agar Sangre incorporar 5 a 8% de Sangre desfibrinada antes de distribuir en placas. Para una mejor conservación de la placa de Agar Sangre y para obtener halos hemolíticos más claros ajustar el pH a 6,8 ±0,2. Si se utiliza como medio basal se obtendrán mejores crecimientos a pH 7,3 ±0,2. Modo de empleo: Sembrar las placas en la superficie del medio. Incubar a 37º C de 24 a 48 horas. Control de Calidad: Control físico-químico: Aspecto: polvo fino. Solubilidad: total. Color: tostado. pH: 7,3 ±0,2 Control microbiológico: A partir de cepas patrón, después de incubación a temperatura de 37ºC y observados a las 24 horas. Placas preparadas con un 5% de sangre de carnero. Neisseria meningitidis ATCC 13090 , Crecimiento : Bueno , Gama Hemolisis Staphylococcus aureus ATCC 25923 , Crecimiento : Bueno , Beta Hemolisis Beta Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 , Crecimiento : Bueno , Gama Hemolisis Streptococcus pneumoniae ATCC 6303, Crecimiento : Bueno , Alpha Hemolisis Alfa Streptococcus pyogenes ATCC 19615 , Crecimiento : Bueno , Beta Hemolisi

Agar CLED Agar McConkey

Una placa de cultivo de McConkey incubada con E. coli. El agar MacConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial para bacterias diseñado para aislar selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados normalmente en el tracto intestinal) y diferenciarlos sobre la base de la fermentación de la lactosa.1 El cristal violeta y las sales biliares inhiben el crecimiento de organismos grampositivos, lo que permite la selección y el aislamiento de bacterias gramnegativas. Las bacterias entéricas que tienen la habilidad de fermentar lactosa pueden ser detectadas utilizando el carbohidrato lactosa y el indicador de pH rojo neutro.2 Ingredientes[editar] Los ingredientes necesarios para este medio son los siguientes: sales biliares (medio inhóspito para el crecimiento de bacterias Gram positivas, excepto Enterococcus y algunas especies de Staphylococcus), colorante cristal violeta (inhóspito para cierto tipo de bacterias Gram-positivo), indicador rojo neutro (el cual marca microorganismos que fermenten la lactosa), lactosa, peptona y cloruro sódico.3 Usos[editar]

Agar MacConkey con colonias Lac+ (izquierda) y colonias Lac- (derecha). Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo así las bacterias gram negativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-). Lac+[editar] Al utilizar la lactosa en el medio, las bacterias Lac+ como lo son Escherichia coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual hace que baje el pH de 7,1 ± 0,2 lo que tiene como consecuencia la aparición de colonias de color rosadas o rojas. Algunas bacterias en cambio fermentan la lactosa de manera lenta, estas siguen siendo Lac+ por ejemplo: Serratia y Citrobacter. Lac-[editar]

Bacterias que no fermenten la lactosa como lo son Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando amoníaco, lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias blancas o incoloras. Agar chocolate Agar Chocolate (CHOC) es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre. Contiene glóbulos rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C. Este agar se usa para el delicado y exigente crecimiento de bacterias respiratorias, como por ejemplo Haemophilus influenzae. Estas bacterias necesitan factores de crecimiento, como el NAD y hemina, componentes que podemos encontrar dentro de los glóbulos rojos; por lo tanto, un prerrequisito lógico para el crecimiento es la lisis de los glóbulos rojos. El agar se llama así debido a su parecido con el chocolate, pero no contiene nada de este. Debido a que este medio soporta muchos tipos de bacterias, no es muy útil para coprocultivos. Agar Sabouraud El agar Sabouraud es un medio de cultivo que por sus características funciona como medio de enriquecimiento para hongos y que en caso de contener cloranfenicol u otro antibiótico, se convierte en un medio selectivo para los mismos. El medio contiene peptonas1 y una elevada concentración de glucosa que favorece el crecimiento de los hongos sobre las bacterias. Es utilizado para el cultivo de hongos, especialmente dermatofitos, aunque también pueden desarrollarse en él cierto tipo de bacterias filamentosas tales como Nocardia.234 Fue utilizado por primera vez por Raymond Sabouraud en 1870. Más tarde Chester W. Emmons mejoró el medio acercando el pH al neutro (pH entre 5,5 y 6,0) y disminuyendo el nivel de glucosa para permitir el crecimiento de otros subcultivos de hongos. 5 Composición típica Contiene normalmente:6  40 g/L glucosa  10 g/L pluripeptona  15 g/L agar  0,05 g/L [cloranfenicol]  pH 5.6 como máximo Caldo Selenito 

Medio mínimo: contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento de una especie.

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Medio de transporte: preparado para servir como almacenamiento temporal a especímenes transportados o en transferencia; mantienen su viabilidad y su concentración simple.