Preparacion De Medio De Cultivo.docx

INFORME DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO

INFORME DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

INTRODUCCION

El presente trabajo de laboratorio se refiere al tema de “PREPARCION DE MEDIOS DE CULTIVOS” se puede definir como un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas optimas recalcar que

permiten el crecimiento adecuado de los microorganismos. Cabe una forma muy útil de poder aislar, identificar y conservar los

microorganismos es mediante el uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya sabemos se considera el padre de la microbiología), quien se dio cuenta que los microorganismos podían crecer en soluciones que tuvieran azúcar y una fuente de nitrógeno. En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo. Lo que comúnmente se utiliza es el MEDIO COMUN que pueden ser preparados en forma líquida, sólida y semisólida. El medio común es aquel que posee los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. La forma más sencilla de clasificar los medios de cultivo es por su consistencia, entonces aparecen los medios de cultivo sólidos y los medios de cultivo líquidos o también llamados caldos que ya se mencionaron anteriormente. En ambos medios debe haber una buena cantidad de nutrientes que faciliten el crecimiento bacteriano y la diferencia radica en la presencia de una sustancia que se llama Agar o “Agar-Agar” y que es la encargada de darle la solidez y consistencia al medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium, aunque muchos otros géneros pueden servir como fuente de este polisacárido (es decir, un azúcar grande formado por la unión de azúcares pequeños). La ventaja fundamental de usar un medio de cultivo líquido, que se utilizó en la práctica de laboratorio nos permite que crezcan las bacterias que se encuentran en muy poca cantidad, es decir, cuya concentración es muy baja en la muestra que estamos analizando. También es llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. Para el caso del medio de cultivo sólido, la ventaja radica en que permite detectar los diferentes tipos de bacterias que puedan encontrarse en una sola muestra, entonces el usar uno u otro medio de cultivo dependerá de lo que busquemos o queramos: aislar una bacteria que

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se encuentre en cantidades muy pequeñas (medio líquido) o todas las bacterias que puedan haber en una muestra (medio sólido). Los medios de cultivo son uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos, pues se trata de observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución. La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas

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MARCO TEORICO

1. TEMA: “Preparación de medios de cultivo”

2. PROPOSITO:  Identifica los requerimientos nutricionales de los microorganismos y prepara diferentes medios de cultivo.

3. OBJETIVOS:  Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes.

4. FUNDAMENTO:  La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio.

5. FUNDAMENTO TEÓRICO: a. MEDIOS DE CULTIVO Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígenos adecuados, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por

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eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante, pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

b. TIPOS BÁSICOS DE MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU ESTADO FÍSICO:  Líquido: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.  Semisólido: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias. Contienen 0.5% de agar en su formulación.  Sólido: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación

SEGÚN SU COMPOSICIÓN Definidos: Es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.

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Complejos: Es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas, pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.

SEGÚN LA NATURALEZA DE SUS CONTITUYENTES: Medios naturales o complejos: Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. Medios definidos o sintéticos: Son los medios que tienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. SEGÚN EL USO DEL MEDIO DE CULTIVO:  Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.  Medios selectivos: Son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.  Medios diferenciales: Son medios que contienen indicadores de productos

derivados

de

la

actividad

microbiana

de

los

microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana, permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.

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c. CONDICIONES

GENERALES

PARA

EL

CULTIVO

DE

MICROORGANISMOS El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

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PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos.

LUZ AMBIENTAL La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. PH La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. TEMPERATURA Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas

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generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprófitos tienen rangos más amplios. ESTERILIDAD DEL MEDIO Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

6. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS a. EQUIPO CANT. 01

EQUIPO Hornilla eléctrica

CARACTERISTICA

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Balanza eléctrica

De presión de 3 ejes.

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IMAGEN

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b. MATERIALES CANT. 01

EQUIPO Probeta graduada

CARACTERISTICA 100mL

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Varilla de vidrio

Ayuda a homogenizar

Vaso precipitado

600mL

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C. REACTIVOS CANT. 01

EQUIPO Frasco de Peptona

CARACTERISTICA 100mL

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Frasco de extracto de carne

Ayuda a homogenizar

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Frasco de NaCl

600mL

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IMAGEN

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Cintas de pH

Se utilizó para saber el pH del caldo nutritivo.

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Frascos Se utilizó para alcanzar NaOH 0.1N un pH 7

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Agua destilada

Solución liquida

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7. PROCEDIMIENTO a. Primero pesamos los ingredientes según la cantidad requerida por los medios a preparar. A continuación se explica detalladamente:

Cloruro de sodio: 0,125g/mL

Extracto de carne: 0,25g/mL

Peptona: 0,25g/mL

b. Colocar la cantidad pesada en el matraz Erlenmeyer (con excepción del agar granulado que se adiciona en caliente), adicionar agua destilada en la proporción requerida. Homogenizar la mezcla mediante la varilla de vidrio.

Mezcla homogénea de peptona, extracto de carne y cloruro de sodio.

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c. Calentamos la muestra (mezcla), empleando la cocina eléctrica, hasta lograr la total disolución de los ingredientes.

d. Después de la disolución total de los ingredientes, enfriar a 50-55°C y luego ajustamos el pH a 7,0 – 7,2 con NaOH 0.1 N.

En la imagen se observa que a la solución se incrementa NaOH 0.1 N para ajustar el pH, al final se obtuvo un pH igual a 7.

e. Esterilizar a la autoclave a 15 Ib de presión (121 ° C) por 15 minutos. Terminado el tiempo de esterilización, esperar que la aguja del manómetro descienda y extraer los medios. f.

Los medios sólidos sometidos al proceso de esterilización y enfriados a 50-55°C, deben de repartirse en alícuotas de 12 a 15 mL en 1-2 placas

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Petri en condiciones asépticas; para ello se tendrá que seguir las siguientes indicaciones:

No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 

Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda, sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml a 20 ml de Agar por placa procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente.



Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja. Esperar a que el medio solidifique.



Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar.



Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C por 24 h, para control de esterilidad.

g. Si se desea añadir medio sólido en tubos, entonces se esterilizará el Agar directamente en los tubos a 121·C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20° a 30° sobre una varilla de vidrio.

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8. RESULTADOS 

En la práctica de laboratorio se realizó un medio de cultivo (CALDO NUTRITIVO) en la cual se midió el pH con ayuda del papel tornasol, enseguida se evidencio un pH resultante igual a 5, el cual no favorece al crecimiento de microrganismos ya que el pH adecuado para un medio de cultivo varía entre 7- 7,2.

En la imagen se observa que la solución diluida tiene un pH igual a 5.

 Después se agregó a la solución una base “NaOH 0.1 N” de tres a cuatro gotas para ajustar el pH y luego se obtuvo un pH igual a 7, como bien sabemos para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo debe reunir una serie de condiciones entre ellas un pH adecuado o un grado correcto de acidez o alcalinidad, cabe recalcar que la mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro.

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Se observa que el pH neutro.

 Al final se obtuvo un medio de cultivo óptimo para el crecimiento de las bacterias.

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CONCLUSIONES  El preparado del caldo nutritivo tiene que poseer un pH de 7 ó +- 0,2, si este no llegara a ser el caso, existen dos posibles formas de solucionarlos. En el caso de que tenga un pH acido se le tiene que agregar NaOH, y en el caso de que tenga un pH básico se le debe de agregar HCl, y estas acciones se realizan para lograr un pH apto para el crecimiento microbiano.  En la práctica realizada en el laboratorio se logró identificar los requerimientos nutricionales que necesitan los microorganismos, para su crecimiento o asilamiento.  En conclusión, la ventaja fundamental de un preparado de medio de cultivo liquido es el crecimiento óptimo de microorganismos que se encuentran en poca cantidad, es decir, cuya concentración es muy baja de la muestra que se quiere analizar.  El resultado obtenido se dio gracias al buen manejo de cantidades de componentes del medio de cultivo. Ya que, si este no hubiese sido el caso, no se hubiera llegado al resultado obtenido.  El resultado del experimento fue un medio nutritivo para el crecimiento microbiano, pero este no estuvo completo ya que no puede ser finalizado sin una esterilización en el autocontrol.

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RECOMENDACIONES  De acuerdo con lo realizado en laboratorio debemos tener en cuenta la etiqueta que tienen los frascos de advertencia, para así tener más cuidado con lo que manipulamos y así utilizar los adecuadas indumentarias como son: los guantes, cofia, mascaría, guardapolvo y un lentes adaptable al rostro.

 Al preparar el CALDO NUTRITIVO debemos tener en cuenta las cantidades que se debe de utilizar de peptona, cloruro de sodio (NaCl), extracto de carne y el agua destilada.  De acuerdo a la práctica realizada en el laboratorio si el CALDO NUTRITIVO tiene un pH menor a 7 se le debe de agregar “hidróxido de sodio” (NaOH) para así tener un pH adecuado, pero si tiene un pH mayor a 7 se le debe de agregar “ácido clorhídrico” (HCl) para que llegue a un pH 7 ya que es recomendable que tenga este pH para un buen medio de cultivo.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela  Dugas Beverly Tratado de Enfermería Práctica Nueva Editorial Interamericana México, 1999. http://es.pdfcoke.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacionde-Medios-de-Cultivo  Sofía

Gutiérrez

de

Gamboa,

Octubre

2001.

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Pre paraci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf  http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm  https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-unlaboratorio-de- microbiologc3ada.pdf

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