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Significado Los déficits óseos son complicaciones frecuentes observadas en pacientes infectados por VIH-1. Nuestro estudio demuestra que el VIH-1 infecta los osteoclastos, las células especializadas en la degradación ósea, que utilizan diferentes modelos, incluidos los ratones humanizados infectados por el VIH1. Desciframos los mecanismos celulares mediante los cuales el VIH-1 contribuye a una mayor degradación ósea en los osteoclastos humanos, mostrando que el virus modifica la estructura y función de la zona de sellado, la maquinaria de resorción ósea de los osteoclastos. Identificamos la proteína viral Nef como el factor clave responsable de tales efectos. Como prueba de concepto, correlacionamos el déficit óseo en ratones transgénicos que expresan Nef con una mayor actividad de osteoclastos. Por lo tanto, nuestros hallazgos proporcionan evidencia formal de que los osteoclastos constituyen células diana del hospedador VIH-1, lo que contribuye a los déficits óseos in vivo.

Resumen Los déficits óseos son frecuentes en pacientes infectados por VIH-1. Aquí informamos que los osteoclastos, las células especializadas en la reabsorción ósea, están infectados por el VIH-1 in vivo en ratones humanizados y ex vivo en biopsias de articulaciones humanas. In vitro, la infección de osteoclastos humanos ocurre en diferentes etapas de la osteoclastogénesis a través de virus libres de células y, más eficientemente, por transferencia de células T infectadas. La infección por VIH-1 mejora notablemente la adhesión y la actividad osteolítica de los osteoclastos humanos al modificar la estructura y función de la zona de sellado, la maquinaria de degradación ósea específica para osteoclastos. De hecho, la zona de sellado es más amplia debido al enriquecimiento con F-actina de sus unidades basales (es decir, los podosomas). La proteína viral Nef está involucrada en todos los efectos inducidos por el VIH-1, en parte a través de la activación de Src, un regulador de los podosomas y de su ensamblaje como zona de sellado. Apoyando estos resultados, los ratones transgénicos Nef exhiben un aumento de la densidad de osteoclastos y defectos óseos, y los osteoclastos derivados de estos animales muestran una alta actividad osteolítica. En conjunto, nuestro estudio muestra a los osteoclastos como células hospedadoras del VIH-1 y su contribución patológica a los trastornos óseos inducidos por este virus, en parte a través de Nef. 

osteoclasto

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Infección por VIH-1

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pérdida de hueso

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Nef

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podosoma

La reducción de la densidad mineral ósea es una complicación frecuente de los pacientes infectados por el VIH-1 y con frecuencia progresa a osteoporosis y alta prevalencia de fracturas. Un riesgo seis veces mayor de baja densidad mineral

ósea se observa en individuos VIH-1 + en comparación con la población general ( 1 ). El uso de la terapia antirretroviral altamente activa (TARGA) ha mejorado significativamente la vida útil de los pacientes, revelando estos efectos a largo plazo de la infección y la persistencia de provirus latentes en las células del reservorio ( 2). Múltiples factores pueden contribuir a la pérdida ósea en pacientes infectados. La TARGA es uno de estos factores, especialmente durante los primeros años de terapia. Además, hay evidencia de déficit óseo en pacientes no tratados, que muestra que el virus solo altera la homeostasis ósea ( 3 ⇓ ⇓ - 6 ). Los huesos se someten a una remodelación continua, que se basa principalmente en las acciones secuenciales de los osteoclastos (OC) y osteoblastos formadores de hueso, bajo el control de los osteocitos ( 7 , 8 ). En el caso de envejecimiento o infección por VIH-1, este equilibrio se puede interrumpir en favor de la pérdida ósea. Los trastornos óseos inducidos por el VIH-1 están asociados con un aumento de biomarcadores sanguíneos para la reabsorción ósea y cambios menores en los marcadores específicos de formación ósea, lo que sugiere una contribución importante de AO en este proceso ( 6 , 9). Las OC son células multinucleadas derivadas del linaje monocítico, que tienen la capacidad única de reabsorber la matriz ósea. Se diferencian finalmente por fusión a partir de precursores mononucleados, incluidos los monocitos que circulan en la sangre y los precursores que residen en los huesos ( 10 ). Este proceso está regulado por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y la citoquina osteoclastogénica clave, activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL), secretado principalmente por los osteocitos pero también por los osteoblastos y las células B y T activadas ( 10 , 11). La OC diferenciada terminalmente expresa altos niveles del receptor de adhesión de integrina αvβ3 y las enzimas involucradas en la reabsorción, incluidas la catepsina K, la metaloproteasa de matriz 9 (MMP9) y la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP). La unión y la resorción óseas están mediadas por una estructura específica de OC llamada zona de sellado (SZ). Está compuesto por una densa matriz de estructuras de actina F interconectadas, los podosomas. El SZ ancla las células a la superficie del hueso y crea un entorno resorción confinado donde se secretan protones y enzimas osteolíticas ( 11 ⇓ ⇓ - 14 ). La alteración en la formación de SZ y la dinámica están vinculadas a la reabsorción ósea defectuosa y, en última instancia, a los trastornos óseos, como se demuestra al eliminar los reguladores o constituyentes de la SZ14 ⇓ ⇓ - 17 ). Para explicar el aumento de la actividad osteolítica asociada a la pérdida ósea inducida por el VIH-1, solo se han propuesto algunos mecanismos: alteración del sistema inmunitario ( 6, 18 ), aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias ( 19 ) e infección directa de OC ( 20 ). Con respecto al sistema inmunológico, los estudios del modelo de rata transgénica VIH-1 revelaron que el daño al hueso resulta, en parte, de una producción alterada de factores reguladores de la osteoclastogénesis secretada por las células B ( 18). Este perfil de citoquinas modificado se correlaciona con algunos defectos minerales óseos en pacientes infectados con VIH-1 no tratados ( 6 ). Junto con CD4 +Los linfocitos T, macrófagos, sirven como células diana primarias para el VIH-1 in vivo ( 21 ⇓ - 23 ). Debido a que los OC comparten un origen mieloide común con los macrófagos, la última hipótesis propuesta es que los OC son objetivos para el VIH1 y su infección contribuiría a la pérdida ósea. De hecho, recientemente se ha demostrado que el VIH-1 puede replicarse in vitro en el OC derivado de monocitos humanos y mejorar su actividad de resorción ósea ( 20 ). Sin embargo, la

relevancia de esta observación aún no se ha proporcionado en vivo, junto con los mecanismos celulares y virales correspondientes involucrados en el proceso de resorción ósea. Aquí, informamos la aparición de OC infectados en los huesos de ratones humanizados infectados con VIH-1 y en explantes sinoviales humanos expuestos al VIH-1. Además, demostramos que la actividad osteolítica exacerbada de los OC infectados resulta de la estructura y función modificada de la SZ, se correlaciona con la activación de Src y es dependiente de la proteína viral Nef.

Resultados Los OC infectados se encuentran en los huesos de ratones humanizados infectados con VIH-1 y en explantes sinoviales humanos expuestos al VIH-1. Primero investigamos si los OC están infectados in vivo. Debido a que los ratones humanizados de médula ósea / hígado / timo (BLT) infectados con VIH-1 reproducen la mayoría de los signos de infección en humanos ( 22 , 24 , 25 ), utilizamos estos ratones infectados durante 14 a 21 días (2 × 10 4 –8 × 10 4 copias de ARN / mL en sangre, n= 4) para examinar la placa de crecimiento de fémures y tibias, la zona enriquecida con OC. Para cada sección ósea (cabeza de fémur o tibia de cuatro ratones), cuantificamos 85 ± 22 células que exhiben características OC (núcleos múltiples, actividad de TRAP y localización en la superficie ósea). De manera importante, para cada animal infectado, identificamos por inmunohistoquímica (IHC) uno o dos OC positivos para la proteína viral p24, que se usa como un indicador de infección viral productiva ( Fig. 1 A y Fig. S1 ). Se incluyeron controles negativos para cada muestra al omitir el anticuerpo primario.

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Figura 1. Los tejidos OC están infectados con VIH-1 in vivo y ex vivo. ( A ) El VIH-1 infecta OC in vivo en ratones humanizados con BLT infectados con VIH-1. Dos secciones en serie (3 µm de espesor, 1 y 2 ) de la cabeza de una tibia de ratones VIH-1-BLT se tiñeron para determinar la actividad TRAP (en púrpura, 1 ) y con un anticuerpo monoclonal dirigido hacia la proteína viral humana p24 (en marrón, 2 ). Secciones representativas ( n = 4 ratones, dos secciones por ratón de tibia y cabezas de fémur). Las puntas de flecha muestran un OC infectado. (Barra de escala, 50 µm.) Marcos ampliados, zoom 2 ×. ( B) Los OC humanos están infectados con VIH-1 en explantes sinoviales. Se cultivaron fragmentos de tejido sinovial humano no inflamatorio con M-CSF y RANKL y se infectaron con VIH-1 (cepa ADA). Dos semanas después de la infección, se realizaron análisis histológicos [actividad TRAP en púrpura ( 1 ), p24 ( 2 ) y catepsina K (CtsK) ( 3 ) IHC en marrón, núcleos en azul] en tres secciones en serie (3 µm de espesor, 1 - 3 ). Secciones

histológicas representativas ( n = 3 tejidos sinoviales, cuatro piezas por tejido). (Barra de escala, 100 µm.) Marcos ampliados, zoom 2.3 ×. Luego evaluamos si el OC puede infectarse en tejido humano utilizando explantes de membrana sinovial, que contienen fibroblastos, macrófagos, linfocitos, células dendríticas y OC, en una abundante matriz extracelular ( 26 ). Los tejidos sinoviales humanos frescos se incubaron ex vivo con la cepa ADA del macrófago R5-trópico del VIH-1 y se mantuvieron en cultivo con citoquinas osteoclastogénicas para mantener vivos los precursores de OC y OC residentes durante todo el experimento. Quince días después de la infección, los OC se caracterizaron por múltiples núcleos, TRAP y catepsina K-positividad por IHC. Notablemente, observamos que aproximadamente el 10% de estas células eran positivas para el p24 viral ( n = 5 explantes sinoviales examinados) ( Fig. 1 B ). En conjunto, estos datos muestran que la infección de OC ocurre tanto in vivo en ratones humanizados como ex vivo en tejidos humanos.

Los OC humanos son permisivos a la infección por VIH-1 por virus sin células en diferentes etapas de diferenciación. Para examinar la etapa de diferenciación en la que las células se vuelven capaces de infectarse, recurrimos a OC humanas derivadas de monocitos primarios diferenciados in vitro en presencia de M-CSF y RANKL. El proceso de diferenciación de OC se evaluó midiendo el nivel de proteína OC en diferentes etapas. Mientras observamos un rápido aumento de TRAP y la integrina β3 tan pronto como el día 1, notamos la adquisición de catepsina K (un marcador de diferenciación de etapa tardía) en el día 6; el nivel de expresión para todas estas proteínas aumentó hasta el día 10, cuando las células presentaron características de OC madura, que incluyen alto índice de fusión, altas actividades de TRAP y MMP9 y actividad de degradación ósea ( Fig. S2 A - E). Es de destacar que los macrófagos derivados de monocitos (MDM) de los mismos donantes diferenciados con M-CSF (en el día 10) solo mostraron niveles indetectables o bajos de marcadores de OC, bajo índice de fusión y ausencia de actividad osteolítica ( Fig. S2 B - E) . Las células se infectaron in vitro con la cepa ADA de VIH-1 R5 en los días 0, 1, 6 o 10 de diferenciación ( Fig. 2 A ). La extensión de la infección por VIH-1 y la replicación se evaluó el día 10 después de la infección mediante análisis de inmunofluorescencia (IF) de p24 y se cuantificó midiendo la concentración de p24 liberada en el sobrenadante. Mientras que los monocitos (día 0) eran poco capaces de mantener la infección, las células se volvieron cada vez más permisivas a la infección a lo largo del proceso de diferenciación ( Fig. 2 By C , barras negras); esto se correlacionó con el aumento de la expresión del correceptor de entrada CCR5 desde el día 1 ( Fig. S2 F ). Además, observamos que la producción de virus fue inhibida por el tratamiento previo de OC con el antagonista de CCR5 Maraviroc, el inhibidor de transcriptasa inversa AZT, el inhibidor de integrasa Raltegravir o el inhibidor de proteasa Ritonavir ( Fig. S2 G ), lo que indica que la señal p24 corresponde a Células productivamente infectadas. Nos dimos cuenta de que MDM y OC también sufrieron una infección ( Fig. 2 B y C ) (≥95% de los donantes apoyaron la infección, n = 29), lo cual es consistente con niveles similares de receptores CD4 y CCR5 expresados durante la diferenciación (Fig. S2 F ) y en el día 10 ( 20 ). Además, las partículas virales producidas por OC o MDM infectadas tenían una infectividad comparable, según se evaluó utilizando la línea celular informadora TZM-bl (27 ± 5% de p24 + TZM-bl

para partículas producidas con OC versus 26 ± 7% para MDM, n = 5), lo que indica que ambos tipos de células liberaron viriones infecciosos. Es importante destacar que el VIH-1 no afectó la viabilidad del OC, ya que la densidad celular no se alteró incluso en el día 20 posterior a la infección (1.580 ± 276 núcleos / mm 2 para el OC no infectado vs. 1.560 ± 352 para el OC infectado, n= 6 donantes, ≥3,000 células por condición). Finalmente, observamos brotes de virus en OC y partículas de virus maduras e inmaduras que se acumulan en los compartimentos intracelulares delimitados por la membrana mediante microscopía electrónica ( Fig. 2 D ).

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Figura 2. El VIH-1 infecta el OC humano y sus precursores in vitro. ( A - C ) Los OC están infectados por virus sin células en diferentes etapas de diferenciación. ( A ) Diseño experimental de la infección (cepa ADA). ( B y C ) Cinética del porcentaje de células p24 ( B , determinado por IF) y de la liberación de p24 en los sobrenadantes ( C , determinado por ELISA) en células mantenidas en M-CSF más RANKL (OC, barras negras) o Se muestra M-CSF solo (MDM, barras azules) +

de los mismos donantes. Los resultados se expresan como media ± SEM ( n = 3 donantes y 5 donantes para el día 10). Día de i, día de la infección. ( D) Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de OC infectadas. Los OC maduros se infectaron con VIH-1 y se examinaron 10 d después de la infección. Imágenes de un virus en ciernes ( izquierda , punta de flecha roja) y virus contenidos en un compartimento de membrana citoplásmica ( derecha , las puntas de flecha negras muestran virus maduros). (Barra de escala, 100 nm.) En conjunto, estos resultados muestran que el VIH-1 infecta y se replica en OC y sus precursores, sin un efecto citotóxico significativo.

Los OC humanos se infectan preferentemente por la transmisión de células T infectadas. El VIH-1 se propaga al infectar a las células diana como partículas libres de células o de manera más eficiente a través de la transmisión de célula a célula, tanto in vitro como in vivo ( 27 ⇓ ⇓ - 30 ). Por lo tanto, examinamos si el OC maduro podría infectarse por contacto con linfocitos T CD4 + infectados , utilizando primero células Jurkat T infectadas con la cepa NLAD8-VSVG del trópico R5 del VIH-1 (> 50% de las células T infectadas, n = 8). Brevemente, después de 6 h de contacto con OC, las células Jurkat se lavaron (más del 99% de las células T se eliminaron) ( Fig. S3 A ) y las OC se recogieron inmediatamente (día 0) o 5 días más tarde (día 5). ) y se tiñeron para detectar la p24 viral intracelular mediante IF ( Fig. 3 A yB ). Observamos que el contacto de 6 h (día 0) fue suficiente para la transferencia del virus de células T a OC con aproximadamente el 15% de p24 + OC, mientras que en este momento no se observó ninguna infección detectable cuando se cultivaron OC con viriones libres de células. Producido por las células T. La diferencia se mantuvo en el día 5. En este momento, la alta tasa de OC infectada podría resultar de la infección inicial por la transmisión de células T a OC y de una mayor fusión de las células OC. Cabe destacar que la transferencia de virus a través de células T infectadas condujo a una infección productiva de OC, como lo demuestra la cantidad de p24 detectada en el sobrenadante en el día 5 ( Fig. 3 C), que es mayor que en el caso de la infección con viriones libres de células. Finalmente, confirmamos la transferencia eficaz de virus de las células T infectadas que conduce a una infección productiva de OC mediante el uso de linfocitos T infectados autólogos como células donadoras de virus ( Fig. S3 B y C ).

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Fig. 3. El VIH-1 se transmite de los linfocitos T infectados a OC. ( A - C ) Las OC han estado en contacto durante 6 h con linfocitos Jurkat T no infectados ( izquierda ), con linfocitos T infectados con VIH-1 ( Centro ) o con partículas virales libres de células producidas por las células T durante 6 h ( derecha) ); se lavaron, luego se cosecharon inmediatamente (día 0) o 5 días más tarde (día 5). ( A ) Mosaico representativo de 3 × 3 campos confocales de ampliación original 20 ×, después de la tinción para p24 (verde), F-actina (faloidina-Texas rojo, rojo) y núcleos (DAPI, azul) en el día 5. (Escala bar, 50 µm.) ( B y C ) Cuantificaciones (media ± DE, n= 8 donantes) del porcentaje de células p24 evaluadas por IF ( B ) inmediatamente (día 0) o 5 d (día 5) después de la infección y de liberación de p24 en los sobrenadantes determinados por ELISA después de 5 d (día 5) ( C ) . ** P ≤ 0.01; **** P ≤ 0.0001. +

Estos resultados muestran que los OC no solo se infectan por transferencia de célula a célula a través de células T infectadas, sino que también son más eficientes que la infección por viriones libres de células.

La infección por VIH-1 mejora la migración del precursor de OC y la actividad de reabsorción ósea de OC. En ratas transgénicas de VIH-1, la pérdida ósea grave se ha correlacionado con un aumento en el número y tamaño de OC ( 18 ). Este aumento podría reflejar un reclutamiento mejorado de precursores de OC o una diferenciación estimulada de OC. Probamos ambas hipótesis. Se sabe que la migración de precursores de OC de la sangre a los huesos requiere proteasas in vivo ( 31 ), y que los defectos en la migración mesenquimal dependiente de la proteasa 3D de estas células in vitro se correlacionan con un menor reclutamiento de OC en los huesos ( 16 ). Por estas razones, evaluamos si la infección por VIH-1 altera la migración mesenquimatosa del precursor de CO ( 32 , 33). Los precursores de OC humanos se infectaron el día 1 de la diferenciación, se sembraron el día 2 en Matrigel y la migración se midió 48 h más tarde ( Fig. 4 ). Es de destacar que los precursores de OC dentro de Matrigel mostraron la forma alargada característica de la migración mesenquimal ( 32 ). El porcentaje de células migratorias y la distancia cubierta por las células aumentaron significativamente en la infección por VIH-1.

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Fig. 4. HIV-1 mejora la migración 3D de los precursores de OC en Matrigel. Los precursores de OC se infectaron o no el día 1, se sembraron el día 2 en capas gruesas de Matrigel polimerizado en cámaras de transwell, y la migración se midió 48 h más tarde. ( A ) Imágenes representativas de campo claro de células vivas ya sea en la superficie (arriba) o dentro de la matriz (adentro), tomadas después de 48 h de migración utilizando un microscopio de video invertido. (Barra de escala, 50 μm.) ( B ) Se midió el porcentaje de células migratorias (media ± SEM, n = 7 donantes) (NI, no infectadas). *** P ≤ 0.001. ( C ) Las posiciones tridimensionales

de los precursores de OC en la matriz y la distancia media de migración (d la ) de un experimento representativo de siete se muestran usando el software TopCat. media

A continuación, para comprobar si la infección por VIH-1 afecta a la diferenciación de OC, examinamos las consecuencias de la infección en el grado de fusión de OC y la actividad de resorción ósea. La infección por VIH-1 mejoró significativamente la fusión celular, según lo medido por el índice de fusión y el área cubierta por el OC infectado versus no infectado ( Fig. 5 A ), el porcentaje de células multinucleadas TRAP + y el número de núcleos por célula multinucleada ( Fig. S4 A y B ). Cuando las células se trataron con Maraviroc antes de la infección, el índice de fusión se redujo a un nivel similar al de los controles ( Fig. S4 C). Además, para explorar los efectos de la infección por OC en la actividad de resorción ósea, caracterizamos la morfología de las lagunas de resorción. El área total de reabsorción ósea aumentó con la infección por VIH-1 ( Fig. 5 B - D ) y las fosas de reabsorción mostraron profundas modificaciones morfológicas ( Fig. 5 B - F ). Los OC infectados generaron pozos de resorción que aparecieron más profundos (28 ± 1.2 μm frente a 17 ± 0.7 μm para los controles, **** P <0.0001) ( Fig. 5 C ) y menos alargados ( Fig. 5 E ) que los de OC no infectados , que forman sendas de reabsorción que recuerdan a la "migración parecida a un gusano centímetro" ( 34). Estas modificaciones se correlacionaron con una importante regulación al alza del volumen óseo reabsorbido por pozo en el contexto de la infección por VIH-1 ( Fig. 5 F ). Además, también encontramos un aumento significativo en la concentración del telopéptido C-terminal del colágeno tipo 1 (CTX) liberado en los sobrenadantes y utilizado como un marcador adicional de la reabsorción ósea ( Fig. 5 G ).

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Fig. 5. El VIH-1 mejora la fusión de OC, la actividad osteolítica y la adhesión de OC. ( A ) El VIH-1 desencadena la fusión de OC. Diez días después de la infección, las células se tiñeron para detectar p24 (verde), F-actina (rojo) y núcleos (azul). Imágenes de un mosaico de 4 × 4 campos confocales de ampliación original 20 ×. (Barra de escala, 150 μm.) El índice de fusión celular (número de núcleos en células multinucleadas / número total de núcleos) y el porcentaje de superficie cubierto por células multinucleadas (índice de superficie) se midieron para> 3,000 células en cada condición, n = 6 donantes. Los resultados se expresan como media ± SEM. ( B - G) La infección por VIH-1 aumenta la actividad de resorción ósea de OC. Los días 10 no infectados y los infectados por VIH-1 se sembraron en portaobjetos de hueso cortical durante 48 h. Luego, se eliminaron los OC, se recogieron los sobrenadantes y se tiñeron las rodajas de hueso con azul de toluidina para visualizar los hoyos de reabsorción en púrpura. Los datos se obtuvieron de seis donantes. ( B ) Imágenes representativas de campo claro de pozos de resorción ósea (púrpura). (Barra de escala, 20 μm.) ( C ) Imágenes confocales representativas de fosas. Códigos de color para la profundidad de las picaduras de reabsorción (barra de escala de color). (Barra de escala, 20 μm.) Cuantificación del porcentaje de área de degradación ( D ) y circularidad ( E ) de imágenes de campo claro y volumen reabsorbido ( F ) de imágenes confocales. EnD , el área de degradación del OC no infectado, normalizado al 100%, correspondió al 9% del área total. ( G ) La concentración de CTX en el sobrenadante se midió mediante ELISA y se normalizó al 100% para las células no infectadas (concentración media de CTX = 1,790 pg / mL), n = 6 donantes. ( H - K ) Efectos de la infección en la disolución de minerales y enzimas osteolíticas extracelulares. ( H ) Los días 10 no infectados y los infectados por VIH-1 se sembraron en pocillos múltiples inorgánicos recubiertos con fosfato de calcio cristalino. Las células se retiraron y los pocillos se tiñeron para revelar el área desmineralizada (negro). (Barra de escala, 50 µm.) El gráfico muestra el área cubierta por fosas de disolución de minerales de 10 campos por condición y por donante, n= 3 donantes. ( I - K ) Los sobrenadantes de OC no infectados y infectados por VIH-1 sembrados en vidrio se recolectaron el día 10. Se cuantificaron los niveles de expresión de TRAP y CtsK (Western blot, I y J ) y la actividad de MMP9 (análisis zimográfico, K ). La carga de proteínas se ha controlado mediante tinción con azul de Coomassie, n = 4 donantes. ( L ) La

infección por VIH-1 aumenta las propiedades adhesivas OC. Los OC no infectados y con infección por VIH-1 se eliminaron el día 10 con Accutase durante 10 minutos y el porcentaje de células adherentes restantes se cuantificó contando los núcleos (índice de adhesión). El gráfico representa el promedio de cinco campos por condición de n = 3 donantes (NI, no infectados). *P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001. La actividad osteolítica está mediada por la disolución ácida de los minerales y la digestión enzimática de los componentes orgánicos ( 35 ). La infección por VIH-1 mejoró estas dos actividades, como lo demuestra el aumento en la capacidad de OC para disolver minerales ( Fig. 5 H ) y liberar TRAP ( Fig. 5 I ). No se observó variación en la expresión y actividad de la proteína con respecto a la catepsina K y MMP9 secretadas ( Fig. 5 J y K ). Finalmente, examinamos el acoplamiento / desprendimiento de OC, un factor crítico para la degradación ósea ( 12 ), dado que la reabsorción de OC se produce en parte a través de una sucesión de fases migratorias que alternan con fases estacionarias de resorción ósea ( 12 , 36 ). Cuando se infectaron, las OC fueron más resistentes al desprendimiento inducido por el tratamiento con Accutase que las contrapartes no infectadas ( Fig. 5 L ). Este aumento de la adhesión probablemente ralentiza la motilidad OC en el hueso, lo que debería contribuir a la morfología modificada de las lagunas de resorción y a la mayor actividad de degradación ósea. En general, estos resultados indican que la infección por VIH-1 mejora la migración 3D de los precursores de OC, lo que puede favorecer el reclutamiento de OC en los huesos, así como la adhesión y la actividad de reabsorción ósea de la OC madura.

La infección por VIH-1 altera la arquitectura de la SZ y activa la quinasa Src. Debido a que la SZ se ha relacionado con las capacidades de adhesión y degradación ósea del OC ( 11 , 37 ), caracterizamos la arquitectura de esta estructura en el OC infectado. Observamos que en OC sembradas en huesos, se incrementó el número de células que albergan SZ ( Fig. 6 A y B ). Este efecto no fue duplicado por la infección con Mycobacterium tuberculosis , Francisella novicida o Salmonella typhimurium (tasas de infección ≥50% para cada bacteria, porcentaje de células que albergan SZ: 18 ± 9 para M. tuberculosis , 22 ± 6 para F. novicida , 25 ± 4 para S. typhymuriumvs. 25 ± 10 en el OC no infectado, media ± SD, n = 4), lo que sugiere que este parámetro no fue generalmente influenciado por la infección por OC. Además, el tamaño de la SZ se incrementó ( Fig. 6 Ay C ), delimitando un área correspondiente a 25 ± 1% de la superficie celular de OC infectada vs. 18 ± 2% en las células de control ( Fig. 6 D ) . También notamos que la intensidad de fluorescencia de F-actina fue mayor en la SZ de las células infectadas ( Fig. 6 A y E ) y que el núcleo de F-actina de los podosomas, el elemento basal de la SZ, fue mayor ( Fig. 6 F y G). La tirosina quinasa Src desempeña un papel clave en la homeostasis ósea al controlar la formación y estabilidad de la SZ y la tasa de recambio de actina en los podosomas OC ( 14 , 16 , 38 ). En consecuencia, los OC de ratones Src - / -no ensamblan SZ

funcional y los ratones exhiben un fenotipo osteopetrótico fuerte ( 15 ). De manera interesante, demostramos que en el contexto del OC infectado por VIH-1, la actividad de la familia de quinasas Src se incrementó según se mide por la fosforilación de la tirosina reguladora ( Fig. 6 H ).

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Fig. 6. El VIH-1 modifica la organización de la SZ e induce la activación de la Src-quinasa en el OC humano. ( A - E ) La infección por VIH-1 aumenta el tamaño y la intensidad de la actina F de la SZ. ( A ) Imágenes confocales de AO no infectados o infectados por VIH-1 sembrados en portaobjetos de huesos. Las células se tiñeron para p24 (verde) y F-actina (rojo). (Barra de escala, 10 μm.) ( B ) Cuantificación del porcentaje de células que forman SZ ( n= 4 donantes, 300 células por donante). ( C - E ) Gráficos de dispersión vertical que muestran para cada SZ, la superficie ( C ), el porcentaje de la superficie celular ocupada por SZ ( D ) y la intensidad de actina F ( E ) ( n= 3 donantes,> 25 SZ). Las gráficas muestran valores individuales de SZ y la media ± SEM. ( F y G ) La infección por

VIH-1 aumenta el tamaño de los podosomas individuales. Los OC sembrados en vidrio se infectaron con VIH-1 y se tiñeron para la F-actina. ( F ) IF imágenes. (Barra de escala, 10 μm.) ( G ) Cuantificación automatizada del área de fluorescencia de actina F de podosomas individuales. Media ± SEM, n = 3 donantes (> 2,000 podosomas, 10 células por donante). ( H) La infección por VIH-1 induce la activación de la Src-quinasa. Los lisados de células completas se sometieron a transferencia de Western usando anticuerpos contra el fosfo-Tyr416 de las quinasas Src, Src y Actina. Se muestran una transferencia representativa y la cuantificación de la relación de quinasa fosfo-Tyr416 sobre el total de Src. Los resultados se expresan como media ± SEM, n = 6 donantes (NI, no infectados). ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001. Estos resultados muestran que el aumento en la adhesión ósea y la reabsorción observada en el OC infectado se asocia con una SZ mayor y más numerosa, así como con una mayor actividad de la quinasa Src.

El factor viral Nef está involucrado en los efectos inducidos por el VIH1 en el OC tanto in vitro como in vivo. Para comprender mejor los mecanismos virales implicados en los efectos inducidos por el VIH-1 en el OC, nos centramos en el factor accesorio viral Nef porque se sabe, entre otras funciones, modular la organización de la actina F y estimular tanto la actividad quinasa de la Src ( 39 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 44 ) y fusión celular ( 45 ). Con este fin, se utilizó en peso VIH-1 y nef -eliminado VIH-1 ( δnef VIH-1) de las cepas de la ADA que presentan el mismo nivel de infectividad en los macrófagos ( 33 , 45 ⇓ - 47 ) y en OC ( Fig. S5 A). Es importante destacar que las partículas virales producidas por OC infectadas con las cepas wt o mutantes mostraron el mismo nivel de infectividad (26 ± 7% de las células p24 + TZM-bl para la cepa wt frente a 22 ± 5% para δnef VIH-1, n = 4). Como se muestra en la Fig. 7 A , la migración mesenquimática en 3D de los precursores de OC infectados con HIVnef VIH-1 fue similar a las células no infectadas . En el OC maduro, la fosforilación de la quinasa Src, la actividad de resorción ósea, el porcentaje de células con SZ, el índice de fusión y el área SZ se redujeron en el OC infectado con VIH-1 en comparación con las células infectadas con el virus wt ( Fig. 7 B -F ).

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Fig. 7. Los efectos del VIH-1 sobre la diferenciación y la función de los AO involucran la proteína viral Nef. ( A - F ) Nef es necesario para los efectos inducidos por el VIH-1 en el OC. Los precursores de OC humanos ( A ) o los OC maduros ( B - F ) se infectaron con wt HIV-1 o con delta nef HIV-1 (NI, no infectados ). ( A ) Porcentaje de precursores de OC migrantes después de 48 h medido como en la Fig. 4 , n = 4 donantes. ( B ) Cuantificación de los análisis de transferencia de Western en lisados de células completas utilizando anticuerpos contra el fosfo-Tyr416 de las quinasas Src, Src y Actina como en la Fig. 6 H. Los resultados se expresan como media ± SEM, n= 6 donantes. Cuantificación de ( C ) área ósea reabsorbida ( n = 4), ( D ) el porcentaje de células que forman SZ ( n = 4 donantes, 300 células por donante), ( E ) el índice de fusión (> 3,000 células por condición, n = 6 donantes) ilustrados por mosaicos de 4 × 4 campos confocales (F-actina en rojo y núcleos en verde), ( F ) la superficie SZ en OC sembrada en huesos y teñida para F-actina (faloidina), ( n = 3 donantes) ,> 25 SZ). (Barras de escala, 150 μm en E , 10 μm

en F ). Los resultados se expresan como media ± SEM. ( G y H) Expresión de NefGFP en OC. Los OC se transfectaron con Nef -GFP o GFP (control) y se tiñeron con F-actina (faloidina, roja) y núcleos (azul). ( G ) Una fracción de Nef se localiza en la SZ. Imágenes confocales de OC expresando Nef -GFP. Las puntas de flecha muestran la colocalización de Nef-GFP con F-actina en la SZ. (Barra de escala, 10 µm, inserciones , zoom 2 ×). ( H ) La expresión Nef aumenta el tamaño de los podosomas individuales. Cuantificación automatizada del área de fluorescencia de actina F de podosomas individuales. Media ± SEM, n = 4 donantes (> 2,000 podosomas de más de cinco células por donante). * P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001. SF2

SF2

A continuación, consideramos realizar la expresión ectópica de Nef-GFP en OC, pero encontramos una limitación técnica; solo se obtuvo el 5% de las células que expresan Nef, lo que excluye una cuantificación rigurosa del tamaño de SZ y la actividad de resorción ósea. No obstante, cuando las células transfectadas se colocaron sobre vidrio, observamos una fracción de Nef-GFP localizada en la SZ de los huesos y que los podosomas ocupaban un área más grande que las de las células de control ( Fig. 7 G y H ), imitando así los resultados. obtenido con OC infectado con el virus wt ( Fig. 6 F y G ). A continuación, aprovechamos los ratones transgénicos (Tg) que expresan Nef bajo la secuencia reguladora del gen CD4C humano para superar la dificultad de transfección de la OC humana. El elemento regulador de CD4C impulsa la expresión de Nef en células T CD4 + , macrófagos y células dendríticas ( 48 , 49 ), y también en OC ( Fig. S5 B ). De hecho, en ausencia de cualquier anticuerpo Nef disponible para IHC, utilizamos ratones Tg CD4C / HIV-1- GFP . Verificamos que la GFP se expresó en todos los OC, lo que indica que CD4C controla la expresión de los genes ectópicos en OC ( Fig. S5 B). Para caracterizar los efectos de la expresión de Nef en OC, los precursores de OC se aislaron de la médula ósea de ratones Nef-Tg y no Tg y se diferenciaron ex vivo. Si bien la fusión de OC de ratones Nef-Tg no se modificó en comparación con los OC derivados de ratones de control ( Fig. 8 A ), la reabsorción ósea ( Fig. 8 B ) y el ancho de la tinción con F-actina en la SZ mejoraron ( Fig. 8 C y D ), lo que indica que la expresión de Nef es suficiente para aumentar la actividad osteolítica de OC.

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Fig. 8. En ratones Nef-Tg, la actividad osteolítica de OC y defectos óseos aumenta. ( A - D ) Los OC diferenciados de los ratones Tg son más osteolíticos. Los OC se diferenciaron de los precursores de la médula ósea aislados de ratones Nef-Tg y no Tg y se cuantificaron el índice de fusión ( A ), el área de resorción ósea ( B ) y el espesor de la banda de actina F ( C ) (50 SZ por condición, n = 3 ratones por genotipo). ( D ) Imágenes representativas de estructuras de cinturón de OC de ratones no Tg y Nef-Tg teñidos para F-actina (rojo), vinculina (verde) y DAPI (azul). Marcos ampliados, zoom 2 ×. (Barras de escala, 10 μm.) ( E y F) Los ratones Nef-Tg presentan defectos óseos. ( E ) Secciones histológicas representativas de tibia de ratones de 7 semanas de edad teñidos para TRAP para visualizar OC (púrpura), y contrastados con verde de metilo y azul de Alcian: el tejido óseo aparece en gris, núcleos en verde (correspondiente a los núcleos de células de la médula ósea), y cartílago en azul. (Barra de escala, 200 µm.) Marcos ampliados: × 4 zoom. ( F ) Se muestra

la cuantificación de la superficie ocupada por el hueso trabecular y la superficie ocupada por la señal TRAP positiva en tres secciones histológicas separadas por ratón ( n = 3 ratones por genotipo). * P ≤ 0.05; ** P ≤ 0.01; *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001. Finalmente, abordamos el papel de Nef en la remodelación ósea in vivo. Los ratones Nef-Tg mostraron defectos óseos como lo demuestra la fragilidad ósea anormal durante la disección y una disminución general de la densidad ósea ( Fig. S5 C ). En las placas de crecimiento de tibia de ratones hembra de 7 semanas de edad, observamos una disminución del área ósea (superficie trabecular) en ratones Nef-Tg en comparación con ratones no Tg ( Fig. 8 E y F , grises), y una desorganizada Zona de condrocitos hipertróficos ( Fig. 8 E , delineada por la línea roja), que aparece más delgada e irregular. Además, se notó un aumento marcado en la señal TRAP + ( Fig. 8 E y F, púrpura), lo que indica que los OC eran más grandes y más numerosos en los ratones Nef-Tg en comparación con los compañeros de camada de control. En conjunto, estos resultados apoyan que la proteína viral Nef es suficiente para aumentar la actividad osteolítica de OC y, por lo tanto, contribuir potencialmente a la pérdida ósea in vivo.

Discusión Los defectos óseos resultantes de la infección por VIH-1 se han descrito durante mucho tiempo, pero las causas siguen siendo poco investigadas ( 1 ). Informamos que el VIH-1 infecta OC in vivo, ex vivo e in vitro. En el OC infectado, la estructura y la función de la SZ se modifican, lo que afecta la adhesión y la reabsorción del hueso. La proteína viral Nef es instrumental en estos procesos. Por lo tanto, los OC son objetivos celulares para el VIH-1, que es, según nuestro conocimiento, el único patógeno capaz de manipular la SZ. Usando ratones humanizados con BLT infectados con VIH-1, obtuvimos evidencia de la presencia de OC infectada en los huesos. OC infectados aparece como un evento raro, ya sea debido a la viremia moderado (trabajamos poco después de la infección) y la baja sensibilidad de la detección de IHC, o al hecho de que infectó OC están mal detectado en los tejidos de manera similar a los macrófagos infectados ( 22 , 50 ⇓ ⇓ ⇓ - 54). OC también puede infectarse ex vivo en explantes sinoviales humanos frescos. Es importante destacar que la infección por OC in vivo y ex vivo fue detectada por la IHC del p24 viral, lo que sugiere una replicación viral. In vitro, imágenes de microscopía electrónica de OC infectada revelaron que las partículas del virus del brote y se acumulan en compartimentos intracelulares, sugerente de los compartimentos que contienen virus descritos en los macrófagos ( 55 ⇓ - 57 ). La producción de virus por OC fue cuantitativamente similar a la de los macrófagos, una célula huésped del VIH-1 bien conocida ( 21 , 22 , 58).). La infección de OC ocurrió en diferentes puntos de tiempo a lo largo del proceso de diferenciación, comenzando en el día 1 en los precursores de OC y correlacionando con la expresión de CCR5. Esto sugiere que los precursores circulantes de OC, que se encuentran con el virus en la sangre, podrían infectarse y migrar a los huesos, donde se diferencian finalmente ( 59 , 60 ) ( Fig. 9 ). Es difícil explorar si la OC madura puede infectarse directamente en los

huesos. Hasta ahora, la presencia del VIH-1 en los huesos no ha sido documentada. Como se mostró recientemente para macrófagos ( 61 ), contacto directo de OC con Jurkat infectado o CD4 + primarioLos linfocitos T conducen a la transferencia de virus y la infección productiva de OC, que es claramente más eficaz que la infección por virus sin células. Esto es probable que sea la ruta fisiopatológico para infectar OC in situ, lo que sería coherente con los datos que muestran que la infección célula a célula es crítico para la propagación viral eficiente in vitro e in vivo ( 25 , 29 , 61 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ - 69 ). En conjunto, estos resultados muestran que las OC son células hospedadoras del VIH-1.

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Fig. 9. Resumen gráfico propuesto para explicar los defectos óseos inducidos por el VIH-1 en pacientes. La infección por VIH-1 afecta el reclutamiento de precursores de OC en los huesos y el proceso de diferenciación de OC. Estos efectos, dependientes de la proteína viral Nef, dan como resultado un OC más osteolítico más numeroso y más numeroso que muestra una SZ más grande y más densa. Con respecto a la consecuencia de la infección por VIH-1 en la función de AO, junto con este estudio, hay otro informe que describe que la actividad de resorción ósea del AO infectado se ve exacerbada ( 20). En este documento, revelamos mecanismos potenciales implicados en la resorción ósea mejorada que conciernen a la estructura y función de la SZ, la estructura celular instrumental para la

resorción ósea. Las SZ son más grandes en el OC infectado por VIH-1 y, en consecuencia, pueden degradar áreas óseas más grandes. Esto está en línea con la formación de OC gigante, que contiene dos veces más núcleos cuando se infectan. Esta exacerbación de la degradación ósea por el OC infectado por VIH-1 también fue el resultado de un proceso de desmineralización mayor combinado con una mayor secreción de TRAP. La SZ está formada por podosomas densamente conectados, estructuras celulares ricas en F-actina involucradas en la adhesión celular, mechanosensing y migración celular ( 70 ). El ensamblaje y el patrón de SZ están bajo el control de Src ( 14 , 38). De manera interesante, informamos que la actividad de la quinasa Src se activó en el OC infectado y que los podosomas se agrandaron, como se visualiza por un aumento de la tinción con F-actina. En los macrófagos humanos, las modificaciones del contenido de actina F en los podosomas individuales se han correlacionado con las fluctuaciones de las fuerzas de protuberancia ejercidas sobre la matriz extracelular por estas estructuras celulares ( 71 ). En OC, estos podosomas modificados pueden promover un sellado más eficiente en la superficie del hueso. De hecho, observamos una adhesión más fuerte para el OC infectado con VIH-1 en comparación con el OC no infectado. Debido a que el SZ es una barrera que limita la difusión de las moléculas ácidas y proteolíticas lanzado en la lagunas de reabsorción ( 11 ⇓ ⇓ - 14), una mayor adhesión probablemente mejoraría la eficiencia de contención y favorecería la reabsorción ósea ( 72 ). A partir de estos resultados, proponemos que la modificación de varios parámetros de la SZ (es decir, aumento del tamaño, adhesión y actividad degradativa) contribuye a la actividad osteolítica aumentada y a las modificaciones de la topografía de los pozos de resorción en la infección ( 12 , 36 , 73). ). La desestabilización farmacológica de la SZ reduciría el impacto del VIH-1 en la degradación ósea. Se están desarrollando varias estrategias terapéuticas en curso, incluida la inhibición de la actividad del componente SZ DOCK5 o de la catepsina K, para reducir los síndromes osteoporóticos al tiempo que se preserva la viabilidad y diferenciación de los AO y, por lo tanto, la homeostasis ósea ( 17, 74 , 75 ). También notamos que los precursores de OC mostraron una capacidad mejorada para migrar cuando están infectados con VIH-1. Curiosamente, la eficiencia de la migración del precursor de OC se ha correlacionado con la densidad de OC en los huesos ( 10 , 16 ). Por lo tanto, además de una mayor actividad de reabsorción ósea del OC infectado, el aumento de la migración de los precursores de OC debería favorecer el reclutamiento de OC en los huesos, como se muestra en la Fig. 9 , contribuyendo a los trastornos óseos en pacientes infectados. Nef es un determinante crucial de la patogénesis viral y la progresión de la enfermedad. Se sabe que interactuar físicamente con varias proteínas del huésped para controlar su actividad en beneficio del virus. Es decir, regula el tráfico de proteínas intracelulares ( 76 ), el citoesqueleto de actina ( 41 ), la fusión célulacélula ( 45 ), la migración celular ( 33 , 42 , 77 , 78 ) y la actividad quinasa de varios miembros de la familia Src ( 40).). En el OC infectado, todos estos efectos podrían contribuir a la mayor actividad de reabsorción ósea que se observa en el presente estudio. Los experimentos in vitro muestran que Nef, en parte ubicado en la SZ, fue necesario para todos los efectos inducidos por el VIH. El papel de Nef también se reveló in vivo en ratones CD4C-Nef-Tg que muestran una densidad ósea reducida y un aumento de la superficie ocupada por la tinción con OC-TRAP, lo que sugiere un aumento en el reclutamiento y la diferenciación de OC. De manera similar, en ratas con VIH-1-Tg, se informó un modelo que involucraba la expresión transgénica global de un VIH-1 no replicativo, una masa ósea reducida,

que se correlacionaba con una alta tinción de OC-TRAP ( 18). Los OC derivados de la médula ósea de ratones CD4C-Nef-Tg se reabsorbieron más y mostraron una SZ más amplia, imitando los resultados obtenidos con OC humanos infectados con VIH-1. Por lo tanto, es probable que OC participe en los defectos de remodelación ósea evidenciados en ratones Nef-Tg. Debido a que estos ratones expresan Nef en células CD4 + , incluidas las células T, macrófagos, OC y células dendríticas, proponemos que los defectos óseos observados se deben, al menos en parte, a OC que expresa Nef además de respuestas inmunes interrumpidas, que son Se sabe que participan en la homeostasis ósea ( 6 , 18 , 48 , 79 ). Aunque no excluimos la contribución potencial de otras proteínas virales ( 80 , 81), nuestros resultados revelan que Nef es un mediador esencial del efecto del VIH-1 en los huesos ( Fig. 9 ). Queda por mostrar cómo el virus se beneficia de la manipulación de OC. Aunque las OC son células gigantes, no producen más partículas virales que los macrófagos y estos viriones exhiben la misma infectividad. En contraste con las células T, la viabilidad celular de los OC infectados no se ve afectada y podemos sospechar que estas células infectadas pueden sobrevivir durante mucho tiempo en los huesos. Además, la administración de fármacos a los huesos está limitada por las características anatómicas únicas de este tejido ( 82 ). Por lo tanto, una ventaja putativa para el virus puede consistir en el uso de OC como reservorios virales para esconderse y sobrevivir. En conclusión, las OC son células diana del hospedador para el VIH-1 que se vuelven más osteolíticas como consecuencia de una SZ más grande y más degradante. Proponemos que los OC infectados participen en trastornos óseos encontrados en pacientes infectados con VIH-1 y pueden constituir un reservorio para el virus. La proteína viral Nef aparece como un regulador clave de la actividad de resorción ósea de OC infectada por el VIH-1. En resumen, este estudio proporciona una mejor comprensión de las causas subyacentes de la pérdida ósea después de la infección por VIH-1.

Materiales y métodos Materiales y métodos, cultivo celular y transfección, infección por VIH-1 de ratones humanizados con BLT, transferencia viral de células T infectadas a OC humana primaria, infección de OC y macrófagos libres de células y análisis histológicos de huesos de ratones y tejidos sinoviales humanos , se describen en Materiales y Métodos SI . Los materiales y métodos adicionales incluyen análisis de citometría de flujo, inmunotransferencia, zimografía en gel, tinción TRAP, análisis de microscopía electrónica de IF y transmisión, migración 3D, ensayos de adhesión y reabsorción, químicos y anticuerpos, y análisis estadísticos también están disponibles en SI Materiales y métodos.. Los monocitos humanos fueron proporcionados por Etablissement Français du Sang, Toulouse, Francia, bajo el contrato 21 / PLER / TOU / IPBS01 / 2013–0042. Los experimentos con ratones CD4C / HIV Nef fueron aprobados por el comité institucional de ética animal (Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Investigación Clínica de Montreal, Montreal, QC, Canadá), y los experimentos con ratones hembra BLT se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones implementadas por El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de Massachusetts.

Expresiones de gratitud Agradecemos a G. Lugo-Villarino y a R. Poincloux por la lectura crítica del manuscrito; C. Salón de US006 / Centro Regional de Exploración Fonctionnelle et de Ressources Expérimentales; M. Dubois, M. Cazabat, M. Requena y J. Izopet del laboratorio BSL3 de las instalaciones de BiVic; F. Moreau y C. Berrone de las instalaciones de animales BSL3 en el Instituto de Farmacología y Biología Estructural; C. Bordier por ayuda con experimentos de citometría; N. Ortega y A. Métais por su ayuda en histología; A. Labrousse para ayuda con RT-PCR; E. Cavaignac por proporcionar muestras de sinovio; E. Meunier para infecciones con bacterias intracelulares; Marie-Chantal Simard y Julio Roberto Caceres-Corte por tomar radiografías de ratones Nef-Tg, la instalación de imágenes TRI y la instalación de exploración funcional ANEXPLO; Stephanie Balor de la plataforma Multiscale Electron Imaging del Centre de Biologie Intégrative por su asistencia; y el Programa de reactivos de referencia e investigación del SIDA, División de SIDA, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas. Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Investigación Científica, la Agencia Nacional de Investigación (ANR 2010-01301, ANR14-CE11-0020-02, ANR16-CE13-0005-01, ANR-11-EQUIPEX-0003); Agence Nationale de Recherche sur le Sida et les hépatites virales (ANRS2014-CI-2, ANRS2014-049); la Fondation pour la Recherche Médicale (DEQ2016 0334894); Plan Cáncer INSERM, el Programa de Ciencia de la Frontera Humana (RGP0035 / 2016); German Science Foundation Research Fellowship US116-2-1 (a SMU); y los Institutos Nacionales de Salud Grants R01 AI097052 y DA036298 (a TRM). LB y SB están respaldados por subvenciones del Institut Pasteur International Network, el Institut Pasteur Shanghai y la Academia China de Ciencias. El trabajo en el laboratorio de P. Jolicoeur fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud.