Cursul 5-2018.m Rpptx.pptx

MUTATIILE SI REPARAREA LEZIUNILOR ADN

1.Polimorfismul unui singur nucleotid (SNPs) 2.Polimorfismele insertie-deletie in/del (indels)

3.Polimorfismele microsatelit •

•

Microsatelitii reprezinta un grup deosebit de util de indels. Determinarea alelelor pt multipli loci microsateliti e metoda de electie pt amprentarea AND folosita la testarea identitatii. Ex.: FBI (Biroul Federal de Investigatii) utilizeaza colectia de alele de la 13 astfel de loci pt panelul sau de amprentare AND. E ft putin probabil ca 2 persoane (exceptie gemenii monozigoti) sa aiba exact aceleasi alele la toti cei 13 loci, incat panelul va permite determinarea faptului ca doua probe au provenit sau nu de la acelasi individ. Informatiile sunt stocate in sistemul de indexare a AND combinat al FBI ( CODIS) care in dec 2014 includea peste 11.548.700 profiluri de infractori, 1.300.000 profiluri de arestati si 601.600 profiluri medico-legale.

4.Polimorfisme de insertie ale elementelor mobile 5.Variatii ale numarului de copii (CNVs) 6.Polimorfismele inversiilor

Mutaţii cromozomiale

Poliploidii

Aneuploidii

Mutaţii regionale ( subcromozomiale) altereaza structura individuala a cromozomilor

Mutatii genice

Cele mai frecvente mutaţii genice sunt cele punctiforme; acestea afectează o pereche de nucleotide. Substitutii: - tranziţii - transversii

S-a observat că numărul tranziţiilor este dublu faţă de cel al transversilor.

Consecintele mutatiilor genice

• Substitutia neutră (silenţioasă, sinonimă)

• Substitutia cu sens greşit (nesinonime, „missens”) : - conservativa (arginina si lizina) - neconservativa

• Substitutia nonsens

• Hb anormală – Hb CS (Hb Constant Spring) – a cărei catenă alfa are 172 aminoacizi în loc de 141

Deletii si insertii

7q31 - gena care codifică o proteină transmembranară CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), care actioneaza ca un canal de clor la

nivelul polului apical al celulelor epiteliale.

Se caracterizează prin expansiunea repetărilor unor secvenţe trinucleotidice intragenice Penetranţa mutaţiilor dinamice este determinată de numărul repetiţiilor

Mutatii dinamice

Gena Huntington (HTT), numita si gena HD (Huntington disease) codifica proteina huntingtina si daca este anormala ea contine o expansiune poliglutaminica. Există variaţii ale numărului de repetări trinucleotidice: - polimorfisme ADN benigne; - premutaţia – secvenţa de ADN devine instabilă, dar nu determină un fenotip patologic; - mutaţia completă - prin expansiunea repetărilor trinucleotidice determinând fenotip patologic.

Numar de repetitii

Clasificare

Statusul bolii

<27

Normal

Neafectat

27–35

Intermediar

Neafectat

36–39

Penetranta Redusa

+/- Afectat

>39

Penetranta totala/comple ta

Afectat

Nomenclatura pentru descrierea mutaţiei Substituţiile de amino acizi • mutaţia cu sens greşit Glu6Val sau E6V. • mutaţie non sens Gln39X sau Q39X Substituţiile nucleotidice • G1444>A (uneori se mai scrie 1444G>A) Pentru modificări în introni (intervening sequence) • IVS33+2T>A Deleţiile şi inserţiile • 1524-1527del sau 15241527delAGTA • F508del • 1277-1278insTATC

MECANISME DE PRODUCERE A MUTATIILOR 1. Erori ale procesului de replicare NH

NH2

NH2

C

NH

N

N

NH

C

O

forma amino

forma imino

Citozina aminică (C-NH 2)

iminică (C=NH)

C

C HN

O

forma lactam

cetonică (C=O)

N

OH

forma lactim

enolică (C-OH)

Tautomeria - proprietatea unor substante organice izomere de a trece cu ușurință una în alta, prin rearanjarea unor atomi sau grupe de atomi

Enol timina se hibrideaza mai bine cu guanina, decât cu adenina şi enol guanina se leagă cu timina mai bine decât cu citozina.

2. Dezaminare bazelor

3. Depurinare spontană La temperaturi crescute sau scăderea pH-ului celular, legătura N-glicozidică dintre o bază purinică şi dezoxiriboză poate fi scindată prin hidroliză - depurinare spontană, rezultând un situs apurinic

Factori fizici In grupa factorilor fizici sunt incluse • Radiatii neionizante (raze ultraviolete UV ) • Radiatii ionizante (radiatii electromagnetice)

Agenţii chimici Agenţii chimici grupează o gamă largă de substanţe chimice cum ar fi: • - analogii bazelor azotate, au structură similară bazelor normale, putând fi încorporate accidental în AND, ex. 5-bromouracil

- agenţii alkilanţi etc.

Mecanisme de reparare

Fotoreactivarea

•

repararea directă

Reparare directă monoenzimatică sau repararea fără excizia bazei Agenţii alchilanţi transferă gruparea metil în situsurile reactive ale bazelor azotate, de exemplu în cel al guaninei rezultând o guanină metilată (care se poate împerechea cu timina). Modificările produse de agenţii alchilanţi sunt reparate direct, fără a îndepărta bazele azotate, de o enzimă specifică numită metilguanin metiltransferaza (MGMT); aceasta transferă gruparea metil de la nivelul metilguaninei pe un reziduu propriu de cisteină formând metilcisteina (care inactivează enzima). Astfel la fiecare reparare este distrusă o întreagă enzimă, iar mecanismul de reparare nu poate face faţă atunci când leziunile sunt produse de agenţi alchilanţi exogeni.

MGMT

Repararea erorilor de împerechere



autocorecţia erorilor în timpul replicării (proofreading).

Mecanismul de reparare a imperecherilor gresite MMR (mismatch repair)

MMR are rol in eliminarea bazelor imperecheate gresit si a buclelor de insertie-deletie aparute prin fenomenul de „derapaj” a ADN-polimerazei in timpul replicarii ADN. Cele mai importante enzime din sistemul MMR sunt codificate la om de genele: MLH1, MSH2, MSH6, PMS. Proteina MSH2 formeaza un heterodimer cu MSH6 (in cazul imperecherilor gresite baza-baza) sau cu MSH3 (in situatia aparitiei unor bucle de insertie-deletie) care recunoaste erorile si se leaga de orice secventa nucleotidica gresita. Atasarea complexului determina recrutarea altor proteine care vor taia secventa fiica incorecta si a vor inlocui cu una corecta. Mutatiile lor sunt implicate in cancerul non-polipozic colorectal ereditar (HNPCC)

Mecanismul de reparare prin excizia bazei (base excision repair – BER) Mecanismul de reparare prin excizia bazei (base excision repair – BER) intervine în cazul leziunilor produse de agenţi endogeni. O bază modificată chimic (cel mai frecvent prin dezaminare spontană) este îndepărtată sub acţiunea unei ADN-glicozilaze, care clivează legătura N-glicozil dintre baza azotată şi dezoxiriboză. Se produce astfel un situs abazic (apurinic/apirimidinic) care este recunoscut de către endonucleaza APE1 (apurinic/apyrimidinic endonuclease 1), enzima esenţială pentru acest tip de reparare la om. Enzima clivează catena ADN la capătul 5’ al situsului abazic, după care intervine ADNpolimeraza β care îndepărtează reziduul 5’dezoxiribozo-fosfat, introduce nucleotidul corespunzător, iar continuitatea catenei este refăcută de către o ligază.

Reparare prin excizia nucleotidelor (nucleotide excision repair – NER) Reparare prin excizia nucleotidelor (nucleotide excision repair – NER). Această cale este utilizată pentru corectarea leziunilor care produc distorsiunea dublului helix, ca de pildă dimerii de pirimidină produşi de radiaţiile ultraviolete sau modificările chimice produse de aflatoxină sau benzpiren. Sistemul de reparare este complex şi cuprinde mai multe gene (ale căror mutaţii au fost identificate în două afecţiuni rare: Xeroderma pigmentosum şi sindromul Cockayne).Modul de localizare a leziunii nu este pe deplin cunoscut. După recunoaştere, este blocată activitatea helicazelor şi se formează un complex mare proteic care va produce incizia dublă a catenei ce conţine leziunea; după îndepărtarea fragmentului cu leziune, este resintetizat ADN-ul (cu ajutorul ADNpolimerazei δ sau ε) şi sunt legate capetele de către ligază.

•

• • • • •

•

Mecanismele MMR, BER, NER reprezintă variante ale unui mecanism general de reparare prin excizie-resinteză, care diferă prin tipul leziunii, modul de recunoaştere şi prin moleculele reparatoare, şi care se realizează în mai multe etape: - recunoaşterea leziunii de către enzime specifice; - desfacerea dublului helix de către o helicază; - excizia fragmentului lezat sub acţiunea unei endonucleaze; - îndepărtarea şi degradarea fragmentului de către exonucleaze - resinteza componentelor lacunei, de către ADN-polimeraze; - formarea legăturii fosfodiester între fragmentul nou sintetizat şi capetele libere ale catenei de ADN de către o AND ligaza