Crecimiento Microbiano-parte1

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Crecimiento Microbiano

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD: F.I.I.S. ESCUELA: ING. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIA I

MÉTODOS DE ESTUDIO DEL CRECIMIENTO MICROBIANO 1ra. parte 1º DEFINICIONES Una población microbiana es definida por dos parámetros que suelen referirse a unidad de volumen de medio, la Densidad Microbiana o masa celular y la Concentración Celular o número de células. El aumento de estos dos parámetros constituye el fenómeno del crecimiento.

La Densidad microbiana y la concentración celular son parámetros esenciales distintos a nivel celular, la masa aumenta de forma continua durante el crecimiento, mientras que la multiplicación es un proceso discontinuo. Cualquier factor cuya falta determina la interrupción del crecimiento recibe el nombre de Factor Limitante. El crecimiento por lo tanto puede quedar limitado por agotamiento de cualquiera de las fuentes tróficas esenciales (energía, carbono, nitrógeno, sales minerales, o un factor de crecimiento en el caso de organismos auxotrofos) o bien por un cambio en las condiciones físicas o fisicoquímicas, por lo tanto en los estudios cuantitativos del crecimiento es fundamental que se identifiquen con exactitud el factor limitante.

2º MEDIDA DE LA DENSIDAD MICROBIANA La Densidad Microbiana expresada en peso seco de célula por unidad de volumen debe determinarse en principio pesando los organismos desecados hasta un peso constante a 100-110, aunque este método es exacto tiene el inconveniente de ser largo y laborioso y de que hay que operar con masas importantes de organismos.

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Por ello en la práctica es preferible determinar la densidad microbiana por métodos indirectos: valorando el nitrógeno proteico celular (microkjeldhal) o midiendo la turbidez.

Las suspensiones microbianas cumplen cuantitativamente la Ley de BeerLambert:

Densidad Óptica (d.o) = Log Io = Kdc I Donde: Io: Intensidad del rayo luminoso incidente. I : Rayo luminoso transmitido. d: Distancia recorrida por la luz a través de la suspensión. c: Densidad microbiana. k: Constante

3º MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR. El número total de células puede determinarse con ayuda del microscopio contando los organismos en un hemocitómetro o en una cámara de tomas, método laborioso por la pequeñez de los microorganismos y sobre todo de las bacterias, es necesario utilizar objetivos de gran aumento y por lo tanto de poca profundidad de campo. Existen dispositivos electrónicos de cuenta automática, estos permiten no solo contar con rapidez las células sino además establecer una distribución estadística de los tamaños en la población.

El método más utilizado es el cómputo mediante el cultivo en placas petri. Utilizando medios selectivos es posible aplicar este método para contar un determinado microorganismo en una población mixta. Estos métodos son el empleo de colorantes vitales o colorantes no tóxicos que penetran solo en la células vivas.

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Otra técnica consiste en esparcir una muestra de la población bacteriana, diluida en una capa de vidrio con un medio sólido extendido.

EXPRESIÓN Y ANÁLISIS MATEMÁTICO DEL CRECIMIENTO. Una población cuya densidad microbiana o concentración celular inicial es X0 va creciendo por duplicaciones sucesivas del modo siguiente:

Después de una duplicación X1 = 2 X0 Después de dos duplicaciones X2 = 2.2 X0 = 2² X0 Después de n duplicaciones Xn = 2ⁿ X0

Sea r la tasa de crecimiento, la población se convierte en: rT XT = 2 X 0

Forma logarítmica de la ecuación anterior. Log2 XT = rT X0 Log2 XT – Log 2X0= r T

Log 2 X = Log 10 X = 3322 Log 10 X Log 10 2

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Representación semilogaritmica del crecimiento.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBACTERIANO. El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tiene las células individuales, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscópico de partículas. Recuento electrónico de partículas.

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Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que sólo se tiene en cuanta el número de microorganismos viables, esto es, capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias. Método del Número Más Probable.

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para

la síntesis de los

componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la división celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimático para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

Determinación de peso húmedo Determinación de peso seco Determinación de nitrógeno Determinación química de un ácido nucleico

Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia del incremento de la biomasa.

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Recuentos Directos. Recuento Microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente Cámaras de Recuentos, aunque también pueden

realizarse

a

partir

de

muestras

filtradas

en

membranas

y

transparentizadas o teñidas con colorantes fluorescentes (naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.

Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o medios mínimos sin fuente de carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.

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Tipo de cuadro

Área² (cm)

Cuadrado Total

1.00 x 10

Cuadrado Grande Cuadrado Pequeño

Factor (1/ Volumen)

Volumen (ml)

-2

-5

4

2.00 x 10

-4

5.00 x 10

-7

4.00 x 10

6

8.00 x 10

-5

1.25 x 10

-8

2.50 x 10

7

5.00 x 10

2.00 x 10

Número total de microorganismos = Bacterias contadas. 1 ml ______________________Dilución_________ Número de cuadrados. Volumen del cuadrado

1/ Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento. Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se utilizaron para contar el número de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la Cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento.

-8

Por ejemplo, cada pequeño tiene un volumen de 5 x 10 ml 4

3

-8

(50 μm x 50 μm x 20 μm = 5 x 10 μm = 5 x 10 ml).

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Recuento Electrónico:

Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras

no filamentosas

y protozoarios,

pero no de

hongos

y

microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo.

Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartiendo, la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son comparables al “ruido” generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve periodo de tiempo va ser tomado como una célula más grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.

MEDIDA DE LA BIOMASA. La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o químico. Algunos de los métodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud. MICROBIOLOGÍA I

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PESO HÚMEDO Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes

de muestra. La principal desventaja es que el

diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular.

Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextrano) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

PESO SECO El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105ºC hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.

La desventaja de éste método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

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DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población.

DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una muestra en relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV. Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la digestión de Kjeldahl.

INCORPORACIÓN DE PRECURSORES RADIACTIVOS Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la población.

DISPERSIÓN DE LA LUZ Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La Nefelometría mide la luz dispersada por una solución de partículas. La Turbidimetría mide la luz como un decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. En relación a la longitud de onda y al tamaño

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de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).

TURBIDIMETRIA. La turbidimetria mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco.

Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embrago, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse la “curva de calibración” con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismo totales o con UFC.

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K: Constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/ Wo).

Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (μg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la Ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por bajo nivel de absorción.

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Número de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta. MICROBIOLOGÍA I

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CÁLCULO DEL TIEMPO DE GENERACIÓN Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique.

G= t n Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en cada generación. Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresión geométrica: 1

1 generación → 2 células = 2 2

2 generación→ 4 células = 2 3

3 generación → 8 células = 2 4

4 generación → 16 células = 2 5

5 generación → 32 células = 2

Si partimos de N células (en microbiología los estudios se realizan con poblaciones), a un tiempo determinado (Ta) tenemos un número de células determinadas (Na).

En la primera generación se duplicará el número de células (2Na) y asi sucesivamente de tal manera que al cabo de un tiempo determinado Tb el número de células determinadas será Nb (Nb= 2n Na) donde n es el número de generaciones transcurridas desde Ta hasta Tb. En esta fórmula (Nb = 2n Na) conocemos todos los parámetros excepto el número n de generaciones transcurridas por lo que aplicando logaritmos será posible calcularlo. Una vez obtenido el número de generaciones n transcurridas en un tiempo t podremos calcular el tiempo de generación G para ese microorganismo.

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Ta→ Na 1

1 generación → 2 Na = 2 Na 2

2 generación → 4 Na = 2 Na 3

3 generación → 8 Na = 2 Na 4

4 generación → 16 Na = 2 Na 5

5 generación → 32 Na = 2 Na

ⁿ n generaciones (Tb) → Nb = 2 Na

ⁿ Nb = 2 Na Lg Nb= n lg 2 + lg Na n = lg Nb – lg Na lg2 n= lg Nb/ Na lg2

n= 3.3 lg Nb Na G= _____ t____ 3.3 lg Nb/ Na

El tiempo de generación de la levadura Saccharomyces cerevisiae es de 90 minutos y el de la bacteria Escherichia coli es de 20 minutos. Esta bacteria tiene un crecimiento muy rápido de tal manera que a partir de de una sola célula se obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480 minutos; 480:20 = 24 generaciones; 224 = 2 x 106 células) 2 millones de células.

Esta misma bacteria al cabo de dos días se habría multiplicado hasta 2.2 x 1043 células. Una bacteria pesa aproximadamente 10-15 – 10-11 gramos, por lo que el peso de todas esta células es de aproximadamente 2.2 x 1030 gramos que equivalen a 8 veces el peso de la tierra.

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CRECIMIENTO EN UN MEDIO NO RENOVADO 1º FASE DEL CRECIMIENTO La grafica representa coordenadas ordinarias y semilogarítmica. La evolución de la densidad microbiana en función del tiempo en un cultivo usual en el que el crecimiento se inicia poco después de la siembra y cesa cuando el medio se agota, estas curvas constan de varias fases caracterizadas por el comportamiento de la tasa de crecimiento:

1. Fase de latencia en la que la tasa de crecimiento es nula (r = 0). 2. Fase de crecimiento acelerado durante la cual la tasa de crecimiento aumenta (r

).

3. Fase exponencial en la que la tasa de crecimiento es constante y máxima (r = cte). 4. Fase de c. retardado durante la cual la tasa de c. disminuye (r 5. Fase estacionaria en la que la tasa de e. es nula (r = 0). 6. Fase de declive en la que la tasa de e. es negativa (r < 0).

Curva de crecimiento en medio no renovado.

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).

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2º FASE DE LATENCIA Y FASE DE CRECIMIENTO ACELERADO. El tiempo de latencia (Ti es el retraso del crecimiento real respecto al crecimiento

“ideal”), es decir, el crecimiento que habría observado de Tt se

determina gráficamente las curvas de crecimiento Semilogaritmicas midiendo el tiempo que media entre la fase exponencial observada y la recta paralela que pasa por el origen. La latencia se puede expresar también cuantitativamente determinado, por el método grafico que se indica en la figura de crecimiento real y el crecimiento ideal (Monod, 1949).

Las fases de latencia y de aceleración pueden faltar, y, cuando existen, se pueden a la edad del inoculo o bien a una adaptación enzimática.

Fig. 82. Determinación gráfica de la latencia. Los valores logarítmicos de las densidades microbianas llevados a ordenadas corresponden al inóculo total (Xt), a la fracción viable del inoculo (Xv), a la población que se habría obtenido ene. Mismo intervalo de tiempo en un crecimiento “ideal”, es decir, sino hubiese habido latencia (X 1). L representa la diferencia del número de divisiones entre el crecimiento ideal y el real T1, es el tiempo de latencia. MICROBIOLOGÍA I

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a) Edad del inóculo. La latencia que se observa cuando se siembra un medio nuevo con organismos procedentes de un medio de composición idéntica es tanto mas prologada cuando mas “viejo” sea el cultivo de donde procede el inóculo, es decir cuado mayor sea el tiempo transcurrido desde que dicho cultivo dejó de crecer. Esta influencia de la edad del inóculo se explica por dos motivos, por un lado, las fases de latencia y de aceleración expresan el tiempo necesario para reparar y reconstruir sistemas enzimáticos que han experimentado una alteración progresiva durante el tiempo que los microorganismos han permanecido sin multiplicarse.

Se ha demostrado que durante

la fase estacionaria del

crecimiento disminuye el número de ribosomas.

Por otra parte, un inóculo (xt) procedente de un cultivo viejo contiene a veces una cantidad muy grande de células no viables de tal forma que aún cuando las células

visibles

(Xr)

empiecen

inmediatamente

ha

desarrollarse

exponencialmente (fig.82), su proliferación pasaría inadvertida y no se reflejaría en la curva experimental hasta después de varias divisiones.

b) Adaptación enzimática.

Las causas de la latencia que acaba de describirse se eliminan utilizando un inóculo procedente de un cultivo

en fase exponencial. En este caso los

organismos transferidos a un medio nuevo de la misma composición reanudan en seguida su crecimiento exponencial. Pero si el inoculo procede de un medio de distancia composición, se puede observar una fase de latencia (fig.) que en este se debe a una adaptación enzimática, es decir, a la síntesis de una o mas enzimas necesarias para que las bacterias metabolizen el nuevo sustrato.

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Fig. 83 Adaptación enzimática y Fase de latencia. (Según J. Monod. Am. Rev.

Microbiol.

3, 371, 1949). Crecimiento de Escheriachia coli en medios sintéticos sembrados con un precultivo en crecimiento exponencial sobre arabinosa. El subcultivo sobre glucosa empieza inmediatamente, mientras que sobre xilosa presenta un tiempo de latencia (T1) de unas dos horas y media.

3. FASE EXPONENCIAL Durante esta fase, que en coordenadas semilogarítmicas esta representada por una recta, todas las células se dividen con una tasa de crecimiento constante y máxima

(Rmáx), y la taza de de mortalidad es nula, y por tanto la

concentración celular total es igual a la concentración de células viables. Conviene señalar que, en determinadas condiciones particulares, las bacterias pueden no desarrollarse de modo exponencial, sino de forma lineal. Crecimientos lineales prolongados se observan, sobre todo cuando se cultiva un organismo en

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presencia

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de

análogos

estructurales

de

aminoácidos,

como

la

p-

Fluorofeilalanina o la B-Tielalanina (Fig. 84). También se han observado crecimiento lineales en mutantes que presentan un bloqueo parcial de las síntesis de un aminoácido usual, como un mutante estreptomicin dependientes de Bacillus subtilis en ausencia de estreptocina. Estos crecimientos lineales se atribuyen (Monod 1949) a que el desarrollo esta limitado por una enzima cuya biosíntesis esta inhibida específicamente, y por tanto, su actividad permanece constante.

Fig. 84. Crecimientos lineales de Escheriachia coli, en presencia de análogos estructurales de aminoácidos (G.N . Cohen y R. Munier, Biophys. Biochen. Acta, 31, 347, 1959.) Cultivos en crecimiento exponencial sobre maltosa (0.2 por 100). En el tiempo cero se añade en (A) DL-para-fluorofenilalanina (5.10 -4 M) y en (B) DL, b-2 fenilalanina (10 -3 M). Las curvas de crecimiento exponencial de los cultivos testigo están trazadas con líneas punteadas.

En A. aerogenes, la velocidad de crecimiento disminuye por encima de los 37º C y se anula a los 42ºC. Dentro de esta gama de temperaturas , que varia de unas bacterias a otras , la parte pendiente de la recta que representa el logaritmo de r en función de 1/T indica la existencia de un proceso que tiene una elevada de activación

y que al parecer consiste en la alteración térmica de una

macromolécula (proteína o ácido nucleico).

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La disminución de la tasa de crecimiento por encima de la temperatura óptima va acompañada de un descenso de un rendimiento ponderal, mientras que este rendimiento permanece constante en toda la zona de temperaturas en las que se cumple la ley de Arrhenius.

4. FASE DE CRECIMIENTO RETARDADO Esta fase se explica por lo dicho al tratar de la influencia de la concentración del factor limitante sobre la velocidad del crecimiento .Corresponde al periodo en que el factor limitante esta a punto de agotarse, y su concentración es inferior a la necesaria para que r sea máxima.

5. FASE ESTACIONARIA Rendimiento ponderal y molecular del crecimiento. Cuando el factor limitante se ha agotado, el crecimiento se retiene (r = 0) y la población permanece estacionaria durante varias horas, hasta que se inicia la fase de declive. La diferencia entre población inicial del medio recién sembrado y la población final (X-X0) es el crecimiento total (G).

Varios hechos indican que las enzimas que interviene en la degradación de proteínas y la ARN (Ribonucleosa) preexisten durante el Crecimiento Exponencial y que probablemente están localizadas en los ribosomas.

El hecho que durante la fase estacionaria halla una constante degradación y resíntesis de proteínas,

sin que apenas variara su masa total, es de gran

importancia para el estudio de la diferenciación celular, y más concretamente para la biosíntesis inducida de enzimas adaptativas en organismos no proliferantes.

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Fig. 89 Renovación de proteínas en Escheriachia coli, en crecimiento exponencial (A) y en suspensión no proliferante (B). (Según J. M Mandelstam, Bact. Revs, 24, 289, 1960). La degradación de las proteínas se mide por la liberación de leucina – C 14 a partir de células marcadas con este aminoácido radiactivo. En trazo punteado: logaritmo de la densidad óptica (curvas de crecimiento). Obsérvese que, en el caso de células en crecimiento, casi toda la degradación de las proteínas precede a la fase exponencial.

6. FASE DE DECLIVE Después de un cierto tiempo, que varía según los microorganismos y las condiciones de cultivo, comienza la fase de declive, durante la población decreta (r<0). Esta fase se caracteriza por dos fenómenos: 1) La mortalidad, que era nula durante el crecimiento exponencial, se manifiesta, con que disminuye el número de organismos viables; 2) La densidad microbiana decrece por autólisis de las células provocadas por enzimas proteolíticas endógenas. De estos dos fenómenos, el primero comienza antes y es mucho más rápido.

En estos últimos años, la supervivencia de bacterias no proliferantes ha sido objeto de estudios (Strange, 1961; Posgate y Honter, 1962), que se han MICROBIOLOGÍA I

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realizado principalmente con Aerobacter aerogenes y otras bacterias Gramnegativas. La curva de supervivencia se había considerado siempre como una curva exponencial que tendía sintomáticamente a cero. Sin embargo, los citados autores han observado que en diversas condiciones, y en especial cuando el factor limitante es el sustrato de carbonado, la curva de supervivencia es lineal al principio, hasta que se ha muerto 70-80 % de los organismos, y solo después se hace exponencial.

La pérdida de viabilidad se acompaña de la liberación de sustancias procedentes de la degradación de los ácidos nucleicos (Pentosas, fosfato, bases nitrogenadas) y la de las proteínas (amoniaco, cetoácidos), que quedan en el medio extracelular al alcance de los supervivientes, con lo que se produce el fenómeno de crecimiento cítrico o de canibalismo Ryan (1955). La duplicación de un individuo superviviente corresponde a la utilización de sustancias procedentes de 50 individuos muertos (Postgate y Honter, 1962).

La muerte en las bacterias se acelera en presencia de un sustrato energético (glicerol, glucosa), lo que indica que el funcionamiento de las enzimas metabólicas aumenta la habilidad de las células. En cambio la muerte se retrasa en presencia de iones de Mg++ o cuando la concentración celular es muy elevada.

La existencia de crecimiento energéticamente desacoplados demuestra que las bacterias carecen de sistemas de regularización que permitan ajustar la velocidad de la producción de la energía es función de su utilización.

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CRECIMIENTO CONTINUO 1. FUNDAMENTOS:

La teoría del crecimiento microbiano continuo en medio renovado fue establecida por Monod (1959) y Sizilar (1950).

Fig. 92. Efecto de la adición de fosfato sobre la actividad catabólica de un cultivo bacteriano (Zymomonas mobilis) limitado por el fosfato. (J.C Senez y J.P Belaich, les mecanismes de régulation des activiés cellulaires chez les microorganismes, pág. 357, CNRS, 1965.) Experiencia realizada en un microcalorímetro diferencial de Tian-Calvet. Ordenadas: velocidad de producción de calor (dQ/dt) a partir del sustrato energético (glucosa). Abscisa: tiempo. La curva muestra que el desarrollo exponencial del cultivo se detiene al agotarse el fosfato. La adición de un exceso de fosfato (0.5 mg/ml) provoca la reanudación inmediata de la actividad catabólica, a una tasa superior, y esta diferencia permite calcular el control ejercido por la carencia de fosfato (21 por 100). El crecimiento continua entonces hasta el agotamiento de la glucosa.

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Monod ha demostrado que este valor es directa y linealmente proporcional (fig.88) a la concentración inicial (C) del factor limitante

G= KC

Esta relación permite conocer de modo que experimentalmente la naturaleza del factor limitante. La constante K (K=G/C), expresada en gramos (peso seco) de bacterias producidas por gramos de sustrato metabolizado, en el rendimiento ponderal del crecimiento. Esta magnitud representa la asimilabilidad del sustrato por el organismo considerado.

El rendimiento molecular se representa por la letra Y seguida de la indicación del sustrato (Y a para la glucosa, Y gal para la galactosa, etc.). Es evidente que Y es igual al producto de K por el peso molecular del sustrato.

2. RENOVACIÓN DE PROTEÍNAS Y DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

La interrupción del crecimiento lleva consigo un profundo reajuste de la estructura celular y especialmente de una rápida renovación (turnover) de las proteínas y del ARN (Mandelstam, 1960).

Esta renovación se ha demostrado y medido de forma experimental en bacterias ( E. coli y A. aerogenes) previamente cultivadas en presencia de la leucina – C 14 y de ortofosfato – P

32

, a fin de marcar radiactivamente las proteínas y los

ácidos nucleicos, y después resembrar en medios que contienen cantidades relativamente elevadas de leucina y fosfato fríos. La cinética de la degradación de las proteínas y de los ácidos nucleicos viene determinada por la velocidad con que aparece la radiactividad en la leucina y el fosfato libre extracelulares.

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RESUMEN DE LOS PARAMETROS Y CONSTANTES DEL CRECIMIENTO

Densidad microbiana: Masa (peso seco) de células por unidad de volumen. Esta magnitud se suele determinar por nefelometría (densidad óptica).

Concentración Celular: Número de células por unidad de volumen. Esta magnitud se mide casi siempre por cómputo de bacterias visible.

Factor Limitante: El componente del medio del cultivo o la condición FísicoQuímica que limita el crecimiento.

Tasa Horaria de Crecimiento (r): Número de divisiones por hora.

Tasa Máxima de Crecimiento Exponencial (r máx.): Tasa de crecimiento independiente de la concentración del factor limitante. Esta tasa de crecimiento es la que se observa durante la fase exponencial de los cultivos en medio no renovado.

Tiempo Medio de división o de Generación (tg), inversa de la tasa de crecimiento (tg=1/r).

Crecimiento Total (G): Peso seco de las células producidas en un cultivo. Esta masa que se suele expresar en g/ml, población final alcanzada al agotarse el medio.

Rendimiento Ponderal (K): Crecimiento total por unidad de masa (g) de sustrato metabolizado.

Rendimiento Molecular (Y): Crecimiento total por molécula/gramo de sustrato metabolizado.

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