Bai Bao Ntt 23-4-17.docx

1

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ NGUỒN GIÁ THỂ SAU THU HOẠCH NHỘNG TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) Cao Thị Thu*, Võ Thị Bích Khuyên, Lê Văn Phụng.

a

Lớp HHK38, Khoa Hóa học, Trường Đại học Đà Lạt, Lâm Đồng, Việt Nam Chỉnh sửa ngày

Nhận ngày tháng năm tháng năm | Chấp nhận đăng ngày Xuất bản trực tuyến ngày tháng năm

tháng

năm

Tóm tắt Từ nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học trong giá thể sau thu hoạch so sánh với nấm nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) và khảo sát các điều kiện chiết xuất đã xây dựng được quy trình chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo. Quy trình đã được áp dụng ổn định ở quy mô 100g nguyên liệu/mẻ. Hiệu suất chiết trung bình đạt 17,18% so với khối lượng nguyên liệu. Hàm lượng cordycepin và adenosin trong sản phẩm chiết từ giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao tương ứng là 2,8135 và 2,0697mg/g. Từ khóa: Cordyceps militaris, Nhộng trùng thảo.

1.

ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm nhộng trùng thảo có tên khoa học là Cordyceps militaris, phân bố trong tự

nhiên chủ yếu ở các vùng Đông Á, Đông Nam Á, Châu Úc,…Thành phần đã biết trong nấm nhộng trùng thảo chủ yếu là cordycepin, adenosin, polysaccharid, ergosterol và mannitol, lượng lớn protein và 17 loại acid amin, cùng các nguyên tố vi lượng, các vitamin (Chen L.T. và ctg, 2005). Các hoạt chất này có tác dụng kháng viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể…( Đỗ T. L., 2004). Nấm nhộng trùng thảo cũng đã được nuôi cấy thành công trong môi trường nhân tạo bằng cách trồng nấm trên giá thể bắp mẻ trộn với bột nhộng tằm (Lê V.V. và ctg., 2015). Giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo có thể vẫn còn chứa những hoạt chất có giá trị của nấm Cordyceps. Vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris)” với mục tiêu xây dựng được quy trình chiết xuất hoạt chất từ nguồn phụ phẩm này.

*

Tác giả liên hệ: Email: [email protected] | Điện thoại:

2

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1.

Đối tượng nghiên cứu Giá thể sau khi thu hoạch nấm nhộng trùng thảo, được lấy từ Viện nghiên cứu ứng

dụng nông nghiệp công nghệ cao, Đại học Đà Lạt. Mẫu được sấy khô ở 60̊C, đóng gói trong túi nilon kín để bảo quản. 1.2.

Phương pháp nghiên cứu Phân tích sơ bộ thành phần của nguyên liệu giá thể sau thu hoạch với nhộng trùng

thảo bằng sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng silica gel GF254 (Merck). Thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 10% và đèn tử ngoại bước sóng 254 và 365 nm. Xây dựng quy trình chiết hoạt chất dựa trên khảo sát các điều kiện chiết xuất về loại dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, kích thước nguyên liệu chiết. Khi khảo sát một yếu tố thì các yếu tố khác giữ nguyên không đổi. Tiêu chí đánh giá và so sánh là hiệu suất chiết xuất. Phân tích thành phần hoạt chất cordycepin và adenosin trong sản phẩm chiết xuất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 1.3.

Thực nghiệm chiết xuất Nguyên liệu giá thể sau thu hoạch nấm nhộng trùng thảo được xay thành bột. Lấy

chính xác một lượng bột nguyên liệu cho vào bình cầu, thêm nước cất, lắp sinh hàn hồi lưu và đun sôi hỗn hợp trên bếp điện trong một khoảng thời gian nhất định. Gạn, lọc lấy dịch chiết trong thu được dịch chiết lần 1. Phần bã còn lại trong bình cầu tiếp tục được chiết với nước cất ở nhiệt độ sôi thêm 3 lần nữa. Dịch chiết của mỗi lần chiết được cô cách thủy cho đến dịch đậm đặc, sấy ở 80ºC trong 2 giờ. Cân xác định khối lượng cao chiết thu được. Hiệu suất chiết được tính bằng phần trăm khối lượng cao chiết thu được so với khối lượng nguyên liệu ban đầu.

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.

Phân tích và so sánh thành phần trong nguyên liệu giá thể sau thu hoạch với

3

nấm nhộng trùng thảo

A

B

C

Hình 1. Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH của mẫu nấm (1) và giá thể (2) Ghi chú:

A: soi UV254nm B: soi UV365nm C: thuốc thử hiện màu H2SO4 10% (105-110̊C) Hệ dung môi khai triển: CHCl3-MeOH (9:1)

Kết quả phân tích TLC của dịch chiết MeOH của hai mẫu thử với hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho thấy mẫu giá thể sau thu hoạch (mẫu 2) và mẫu nấm (mẫu 1) có thành phần khá giống nhau, thể hiện ở chỗ hai mẫu có cùng số lượng vết và các vết cùng Rf thì cũng đều có màu sắc hoặc phát quang như nhau. Tuy nhiên, độ đậm của các vết chất có khác nhau, chứng tỏ tỷ lệ hàm lượng các thành phần không hoàn toàn giống nhau. 3.2.

Xây dựng quy trình chiết xuất từ giá thể 3.2.1. Khảo sát hiệu suất chiết phân đoạn HIỆU SUẤT (%) 40 30 20 10 0 n-hexan

ethanol 80% Giá thể sau thu hoạch

H2O Nấm nhộng trùng thảo

Hình 2. Biểu đồ hiệu suất chiết phân đoạn

4

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

Lấy 10g mỗi loại mẫu bột nguyên liệu nấm nhộng trùng thảo và bột nguyên liệu giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo, chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, cồn 80% và nước. Kết quả thu được (hình 1) cho thấy hiệu suất chiết các phân đoạn cồn 80% và nước từ giá thể sau thu hoạch đều thấp hơn từ nấm nhộng trùng thảo tương ứng là hơn 4 lần với cồn 80% và khoảng gần 3 lần với nước. Hiệu suất chiết phân đoạn n-hexan của 2 mẫu nguyên liệu đều thấp, chỉ đạt 1,4% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu. 3.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ cồn nước đến hiệu suất chiết Tiến hành chiết 10g bột giá thể nhộng trùng thảo với nước và cồn ở các nồng độ 30%, 50% và 70%. Kết quả so sánh hiệu suất chiết được trình bày trong hình 3. HIỆU SUẤT (%) 12 10 8

9.8

6

7.4

6.9

4

4.5

2 0 Nước cất

Cồn 30%

Cồn 50%

Cồn 70%

Hình 3. Biểu đồ hiệu suất chiết theo nồng độ cồn và nước Hiệu suất chiết cao nhất đạt được khi dùng nước cất. Điều này có lẽ là do trong nguyên liệu nhộng trùng thảo thường chứa polysaccharid là thành phần dễ dàng hòa tan trong nước nóng hơn trong trong cồn ở các nồng độ khác nhau. 3.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết

HIỆU SUẤT (%) 25 20 15

19.4

10 5

6.9

3.1

0 <1mm

1-2mm

3-4mm

Hình 4. Biểu đồ hiệu suất chiết theo kích thước nguyên liệu

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

5

Giá thể nhộng trùng thảo được xay ở 3 kích thước khác nhau: bột mịn < 1mm, bột thô 1-2mm và nguyên hạt 3-4mm. Tiến hành chiết 10g bột nguyên liệu mỗi loại kích thước với nước. Kết quả so sánh hiệu suất chiết được trình bày trong hình 4. Kết quả cho thấy kích thước hạt càng nhỏ thì hiệu suất chiết được càng cao. Với mẫu được xay mịn thì cho khối lượng sản phẩm chiết là cao nhất (đạt hiệu suất 19,4%) và vượt trội so với hai kích thước được khảo sát còn lại. 3.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết. Tiến hành chiết 10g mẫu bột giá thể với các thời gian từ 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150 và 180 phút. Kết quả so sánh hiệu suất chiết được trình bày trong hình 5. HIỆU SUẤT (%) sản phẩm 12 10 7.6

8 6

10.7

10.3

5.5

10.9

10.8

10.7

8.8

8.2

5.5

4 2 0 30

45

60

75

90

105

120

135

150

180

Hình 5. Biểu đồ hiệu suất chiết theo thời gian Kết quả trên cho thấy hiệu suất chiết ở 120 phút, 135 phút, 150 phút và 180 phút chênh lệch không đáng kể. Vì vậy, thời gian chiết phù hợp là 120 phút cho mỗi lần chiết. 3.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng cuả tỷ lệ nước và nguyên liệu đến hiệu suất chiết HIỆU SUẤT (%) 20

17.2

16

15

13.9

10 4.5

5 0 90:60:40

70:60:50

60:60:50

50:50:50

Hình 6. Biểu đồ hiệu suất chiết với tỷ lệ nước/nguyên liệu khác nhau

6

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

Tiến hành chiết 10g bột giá thể theo 4 phương án về tỷ lệ nước/nguyên liệu khác nhau: Phương án 1: 9/1, 6/1, 4/1; Phương án 2: 7/1, 6/1, 5/1; Phương án 3: 6/1, 6/1, 5/1; Phương án 4: 5/1, 5/1, 5/1. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết với tỷ lệ 9/1, 6/1, 4/1 là cao nhất (17,2%). Nếu tính theo lượng cao chiết thu được từ một đơn vị thể tích nước (9,05mg/ml nước) thì phương án này cũng cho hiệu quả chiết là cao nhất. Vì vậy, đây là phương án phù hợp được chọn. 3.2.6. Xây dựng quy trình và khảo sát độ ổn định của quy trình

Giá thể nhộng trùng thảo xay mịn (< 1mm) - nước cất - chiết lần 1, đun 120 phút - lọc

Bã dược liệu

Dịch chiết 1

- nước cất - chiết lần 2, đun 120 phút - lọc

Bã dược liệu

Dịch chiết 2

- nước cất - chiết lần 3, đun 120 phút, lọc

Bã dược liệu

Dịch chiết 3

Cô đến dịch đặc Sấy 80ºC Sản phẩm

Hình 7. Sơ đồ quy trình chiết xuất giá thể nhộng trùng thảo

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

7

Qua quá trình khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất, điều kiện chiết xuất hoạt chất từ giá thể Nhộng trùng thảo ở quy mô phòng thí nghiệm được xây dựng như sau: dung môi chiết là nước cất, kích thước nguyên liệu <1mm, chiết 3 lần theo tỷ lệ nước/nguyên liệu 9/1, 6/1, 4/1, chiết mỗi lần 120 phút. Áp dụng các điều kiện trên để chiết 3 mẻ nguyên liệu, mỗi mẻ 100g. Kết quả hiệu suất chiết được trình bày ở bảng 1 cho thấy quy trình chiết xuất đã xây dựng có tính ổn định. Hiệu suất chiết trung bình đạt 17,18% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu. Bảng 1. Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình Mẻ 1 (g)

Mẻ 2 (g)

Mẻ 3 (g)

Lần 1

8,57

8,42

8,62

Lần 2

5,19

5,21

4,99

Lần 3

3,52

3,43

3,58

Tổng (g)

17,28

17,06

17,19

17,18  0,11

Hiệu suất (%)

17,28

17,06

17,19

17,18  0,11

3.3.

Trung bình

Đánh giá hàm lượng adenosin và cordycepin trong sản phẩm cao chiết bằng

sắc ký lỏng hiệu năng cao Điều kiện sắc ký: - Hệ thống sắc ký: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP Hewlett Packard series1050, detector DAD – ELSD (Viện Công nghệ Hóa học –TPHCM) - Cột: intertsil ODS-3, 4,6x250mm, 5µm, GL Science Ir. (Japan) - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Bước sóng phát hiện: 260nm - Pha động: Methanol (A) và dung dịch acid formic 0,1% (B) Chương trình dung môi: Thời gian

A (%)

B (%)

0

7

93

11

7

93

(phút)

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

8

14

100

0

20

100

0

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,00g bột mẫu thử, thêm chính xác khoảng 10ml methanol 80%, siêu âm 15 phút ở 400C, ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 5 phút, gạn dịch nổi phía trên vào bình định mức 10ml. Để nguội, định mức đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45μm lấy dung dịch tiêm sắc ký. Dung dịch mẫu chuẩn: Cân chất chuẩn và hòa tan trong methanol 80% để thu được dãy dung dịch chuẩn của cordycepin và adenosin có nồng độ chính xác: 5, 10, 25, 50µg/ml. Kết quả định lượng cordycepin và adenosin trong hai mẫu cao chiết nước từ nấm Nhộng trùng thảo và từ giá thể sau thu hoạch nấm được trình bày ở bảng 1. Sắc ký đồ HPLC của 2 mẫu cao chiết được trình bày trong hình 8. Bảng 3.8. Hàm lượng cordycepin và adenosin trong cao chiết nước từ nấm nhộng trùng thảo và từ giá thể sau thu hoạch nấm Tên mẫu

Cordycepin (mg/g)

Adenosin (mg/g)

Cao chiết nấm nhộng trùng thảo

4,1450

2,3136

Cao chiết từ giá thể sau thu hoạch

2,8135

2,0697

A

B

Hình 8. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao chiết giá thể (A) và nấm Nhộng trùng thảo (B)

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

9

Kết quả thu được cho thấy vân tay sắc ký của mẫu chiết từ giá thể sau thu hoạch hoàn toàn giống với mẫu nấm nhộng trùng thảo. Hàm lượng các nucleosid đặc trưng trong nấm Cordyceps là cordycepin và adenosin trong mẫu cao chiết từ giá thể sau thu hoạch tương ứng là 2,8135 và 2,0697mg/g, thấp hơn so với mẫu cao chiết từ nấm Nhộng trùng thảo nhưng vẫn là những số liệu rất có ý nghĩa. 4.

KẾT LUẬN Đã nghiên cứu khảo sát các điều kiện chiết xuất và xây dựng được quy trình chiết

xuất hoạt chất từ giá thể sau thu hoạch nấm nhộng trùng thảo với các điều kiện chiết như sau:

Nguyên liệu xay mịn đến kích thước <1mm, chiết bằng nước ở 100oC, tỷ lệ

nước/nguyên liệu cho 3 lần chiết là 9/1, 6/1, 4/1, thời gian chiết mỗi lần là 120 phút. Quy trình đã được áp dụng ổn định ở quy mô 100g nguyên liệu/mẻ. Hiệu suất chiết trung bình đạt 17,8% so với khối lượng nguyên liệu. Đã đánh giá hàm lượng cordycepin và adenosin trong sản phẩm chiết từ giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo tương ứng là 2,8135 và 2,0697mg/g.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thùy, Ngô Xuân Nghiễn (2015). Bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam. Tạp chí khoa học và phát triển, 13 (3), 445-454. Chen L.T., Cao H.F. & Huang W.F, (2005). Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, Modern Food Science. 21(3), 192-195. -----------------------------------------------

10

TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT [CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ]

EXTRACTION OF BIOACTIVE CONSTITUENTS IN POSTHARVEST SUBSTRATE FROM PRODUCTION OF CORDYCEPS MILITARIS Cao Thi Thu*, Vo Thi Bich Khuyen, Le Van Phung

*

HHK38, Faculty of Chemistry, Dalat University Corresponding author: [email protected] Article history Received: Received in revised form: Accepted: Available online:

Abstract Based on the study of the chemical composition of the postharvest substrate compared with the Cordyceps militaris fruiting bodies and the extraction conditions, the process of extracting the bioactive substances from the postharvest substrate has been established. The process was applied stably at the scale of 100g of raw material / batch. The average extracting yield was 17.18% of the raw material weight. The contents of cordycepin and adenosine in the extracted product of postharvest substrate were determined by high performance liquid chromatography method to be 2.8135 and 2.0697mg/g respectively. Keywords: Cordyceps militaris, extraction.