6 Bab 3.docx

BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu Dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di

Laboratorium Farmasi Fakultas

Farmasi

Universitas Halu Oleo Kendari, determinasi dilakukan di Laboratorium LIPI Cibinong dan penelitian antihiperlipidemia dilakukan di Rumah Sakit Palang Merah Indonesia (PMI) Kendari pada bulan Januari hingga Juni 2018. B. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental modelpretest -posttest control group designdengan mengukur pengaruh ekstrak etanol rimpangwualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)terhadap kadar kolesterol total, kadar trigliserida, kadar LDL dan kadar HDL yang diamati melalui pengambilan darah pada vena lateralis ekor hewan coba tikus jantan (Rattus novergicus) galur Wistar. C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquades, etanol 96%, hewan coba tikus jantan (Rattus novergicus) galur Wistar 200-300 gram, rimpang tanaman

wualae(Etlingera

elatior

(Jack)

R.M

Smith),etanol

96%,

eter,

aquades,H2SO4, HCl pekat, Pereaksi Dragendroff, FeCl31%, kloroform, pereaksi Lierberman Buchard, asetat anhidrat, pakan tikus, aluminium foil, kertas saring, makanan lemak tinggi (MLT), propiltiourasil (PTU),atorvastatin, EDTA(Etilen Diamin Tetraasetat Acid), Na CMC, reagen kit kolesterol (Human), reagen kit trigliserida (Human), reagen kit HDL (Human).

30

D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah

sentrifugator, kandang

hewan uji, mikrotube, fotometer, mikropipet, timbangan, blender, kantung plastik, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, spatula, rotary evaporator, corong, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet tetes, pipet ukur, batang pengaduk, hot plate, spoit 1 cc, 3 cc dan spoit 5 cc (One Made®), cawan porselin, Photometer 5010V5+, kuvet, sonde oral 5 mL, alat-alat gelas (pyrex®),timbangan analitik (Precisa XB 220A®), botolminum tikus, gunting, jerigen maserasi, penguap vakum/vacum rotaryevaporator(IKAWerke RV 05 Germany®), waterbath (Daihan Labtech®), pinset, botol vial, lumpangdanalu. E. Variabel 1. Variabel Bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol dari rimpang tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith). 2. Variabel Terikat Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar kolesterol total,kadar LDL, kadar trigliserida dankadar HDL pada tikus hiperlipidemia setelah diberikan ekstrak etanol rimpang tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)selama 14 hari. 3. Variabel terkendali Variabel

terkendali

dalam

penelitian

ini

adalahlingkungan

dalam

kandang,suhu, makanan, minuman, dan jenis kelamin tikus.

31

F. Defenisi Operasional 1. Ekstrak etanol rimpang tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)merupakan ekstrak kentalyang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith) dengan menggunakan pelarut etanol 96%. 2. Skrining fitokimia merupakan metode yang digunakan untuk mengidentifikasi golongan senyawayang terkandung dalam ekstrak etanol rimpang tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith). Golongan senyawa yang akan diidentifikasi yaitu golongan senyawaflavonoid, alkaloid, terpenoid, saponin dan tanin. 3. Uji antihiperlipidemia merupakan uji yang dilakukan untuk melihat kadar kolesterol total, kadar LDL, kadar trigliserida dan kadar HDL setelah pemberian ekstrak etanol rimpang tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)pada hewan uji dengan waktu dan dosis yang ditentukan. 4. Tikus jantan (Rattus novergicus) merupakan hewan uji yang digunakan dalam penelitian uji efek antihiperlipidemia dari jenis galur Wistar. G. Prosedur Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi dilakukan untuk membandingkan suatu tumbuhan dengan satu tumbuhan lain untuk memastikan bahwa tanaman merupakan sampel yang dimaksud, yaitu tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)bukan tanaman lain.Determinasi dilakukan di Laboratorium LIPI Cibinong.

32

2. Penyiapan Sampel Sampel rimpang wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith) diperoleh dari Desa Seuwwa, Kecamatan Pakue, Kabupaten Kolaka Utara, Provinsi Sulawesi Tenggara.Sampel rimpang wualaesebanyak 20 kgdicuci dengan air mengalir, lalu dikupas bagian kulit dari rimpang dan dirajang menjadi bentuk yang lebih kecil kemudian dikeringkan menggunakan kain berwarna hitam dibawah sinar matahari. Setelah kering sampel dihaluskan menggunakan blender hingga menjadi serbuk halus. 3. Ekstraksi Metode ekstraksi

yang digunakan

yaitu

metode maserasi.

Serbuk

rimpangwualae(Etlingera elatior (Jack) R.M Smith) sebanyak 960 gram dimaserasi selama

3 x24 jam menggunakan pelarut etanol 96%, diaduk setiap 1 x 24 jam.

Larutan kemudian dievaporasi sampai memperoleh ekstrak kental. 4. Skrining Fitokimia Ekstrak kental etanol rimpang wualaediuji kandungan senyawanya dengan uji fitokimia yaitu uji tabung. Prosedur Identifikasi senyawa dilakukan berdasarkan metode Djamal (2012) sebagai berikut : a. Identifikasi senyawa alkaloid Sebanyak

1

g

ekstrakdimasukkandalamtabungreaksilaludilarutkandenganetanol. KemudiandiujidenganperekasiDragendorf. Hasilujipositifdiperolehbilaterbentukendapancoklatataumerahhinggajinggadenganpe reaksiDragendorf.

33

b. Identifikasi senyawa flavonoid Sebanyak

1

g

kemudiandilarutkandenganetanol.

ekstrakdimasukkankedalamtabungreaksi, Kemudianditambahkan

pekatdanbeberapa

0,5

ml

HCL

butirlogammagnesium.

Terbentukwarnamerahataumerahjinggamenunjukkanadanya flavonoid. c. Identifikasi senyawa saponin Sebanyak

1

gekstrakdimasukkandalamtabungreaksi,

kemudianditambahkanlarutanHCllaludikocokvertikalselama

10

detik.

Kemudiandibiarkanselama 10 detik. Pembentukanbusasetinggi 1-10 cm yang stabilselamatidakkurangdari 10 menit, menunjukkanadanyasaponin. d. Identifikasi senyawa tanin Sebanyak

1

g

ekstrakdimasukkankedalamtabungreaksilaludilarutkandenganetanol.Kemudianditam bahkanlarutan FeCl3 1%. Golongantaninpositifbila terbentukwarnahijauunguataukehitaman. e. Identifikasi senyawa terpenoid Ujiterpenoiddilakukandenganreaksi Lieberman-Buchard. Sebanyak 1 g ekstrakdilarutkandenganetanol, kemudianditambahkan 0,5 ml asamasetatanhidrat, selanjutnyaditambahkan

2

ml

asamsulfatpekatmelaluidindingtabung.

Terbentuknyawarnamerahmenunjukkanadanyaterpenoid. 5. Karakteristik Simplisia 1) Parameter Spesifik Simplisia a. Penetapan kadar sari larut air

34

Ditimbang kurang lebih 5 g serbuk (4/18) yang telah dikeringkan di udara. Dimasukkan ke dalam labu, tambahkan 100 mL air jenuh kloroform, diaduk berkalikali selama 6 jam pertama, biarkan selama 18 jam. Saring, uapkan 20 mL filtrat hingga kering dalam cawan danporselin yang telah dipanaskan pada suhu 105°C dan ditara, panaskan sisa pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam % sari larut air (Depkes RI, 2010). b. Penetapan kadar sari larut etanol Ditimbang saksama lebih kurang 5 g serbuk (4/18) yang telah dikeringkan di udara. Masukkan ke dalam labu, tambahkan 100 mL etanol 95% P, diaduk berkalikali selama 6 jam pertama, biarkan selama 18 jam. Saring cepat untuk menghindarkan penguapan etanol, uapkan 20 mL filtrat hingga kering dalam cawan porselin yang telah dipanaskan 105°C dan ditara, panaskan sisa pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam % sari larut etanol (Depkes RI, 2010). 2) Parameter Non Spesifik Simplisia a. Penetapan kadar air Masukkan lebih kurang 10 g zat, yang disiapkan seperti yang tertera pada pengambilan contoh dan metode analisis simplisia, dan timbang saksama dalam wadah yang telah ditara. Keringkan pada suhu 1050 selama 5 jam dan timbang. Lanjutkan pengeringan dan timbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara dua penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25% (Depkes RI, 1995) b. Penetapan kadar abu Ditimbang saksama 2-3 g bahan uji yang telah dihaluskan dan masukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijar dan ditara, pijarkan perlahan-lahan hingga arang

35

habis, dinginkan dan timbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, aduk, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan kertas saring beserta sisa penyaringan dalam krus yang sarna. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan dan pijarkan hingga bobot tetap. Kadar abu total dihitung terhadap berat bahan uji, dinyatakan dalam % b/b (Depkes RI, 2010). 6. Uji Farmakologi 1. Aklimatisasi hewan uji Penelitian menggunakan tikus jantan (Rattus norvegicus) galur Wistar. Hewan uji di aklimatisasi dengan lingkungan, suhu, dan kelembapan selama 7 hari. Aklimatisasi bertujuan untuk membiasakan hewan uji tikus hidup dalam lingkungan dan perlakuan yang baru, serta untuk membatasi pengaruh lingkungan dalam percobaan (Harmita dan Maksum, 2008). Populasi hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattusnovergicus) galur wistar jantan, umur 2-3 bulan dengan bobot hewan 150-250 gram tanpa memiliki cacat fisik (Azhari dkk.,2017). 2. Pengelompokan hewan uji Penentuan jumlah hewan uji ditentukan berdasarkan rumus Federer yaitu (t-1) (n-1) ≥ 15, dengan n adalah jumlah hewan yang diperlukan dan dan t adalah jumlah kelompok perlakuan (Ridwan, 2013). (t-1)(n-1) ≥15 (6-1)(n-1) ≥15 (5)(n-1) 5n-5 ≥15 5 ≥15+5 5n ≥ 20 36

n ≥4 Keterangan : t = kelompok perlakuan n = jumlah hewan uji coba

Hewan uji dikelompokkan menjadi 6 kelompok dimana setiap kelompok terdiri dari 6 hewan uji.

Kelompok tersebut terdiri dari 3 kelompok perlakuan

(esktrak etanol rimpang wualaedosis 100 mg/kg BB, dosis 200 mg/kg BB, dan dosis 300 mg/kg BB), kelompok kontrol positif (Atorvastatin 0,18 mg/g BB), kelompok kontrol negatif (PTU dan MLT) dan kelompok kontrol normal (pakan standar). Kelompok kontrol positif digunakan sebagai kelompok pembanding untuk melihat perbandingan pengaruh ekstrak dengan obat yang telah diketahui efektif sebagai obat antihiperlipidemia, sedangkan kelompok kontrol negatif dan kelompok kontrol normal digunakan untuk melihat perbandingan peningkatan kadar kolesterol pada tikus antara kelompok yang diberikan perlakuan dan yang tidak diberikan perlakuan. 3. Perhitungan Dosis Tanaman Wualae(Etlingera elatior (Jack) R.M Smith) Dosis rimpang tanaman wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)yang digunakan pada penelitian adalah 100 mg/kg BB, 200 mg/kgBB, dan 300 mg/kgBB yang mengacu pada penelitian sebelumnyayang dilakukan oleh Sari (2018). 4. Pembuatan Suspensi Na-CMC 0,5% Ditimbang Na-CMC sebanyak 0,5 g kedalam gelas kimia ditambahkan 100 mL aquades diaduk sambil dipanaskan di atas hot plate. Didinginkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, lalu diaduk sampai homogen. 5. Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Wualae(Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)

37

Ekstrak etanol rimpang tanaman wualae(Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)sesuai dengan dosis yang telah ditentukan disuspensikan dengan Na-CMC 0,5%. Suspensi yang telah siap kemudian diberikan peroral ke hewan uji. 6. Penentuan Dosis Propiltiourasil dan Pembuatan Makanan Lemak Tinggi Propiltiourasil digunakan sebagai induksi endogen dan makanan lemak tinggi (MLT) digunakan sebagai induksi eksogen (Fadhlillah dkk., 2017).Suspensi PTU diberikan pada tikus peroral. Hewan uji coba diberikan suspensi PTU 0,1% (Umami dkk., 2016). Pembuatan 5 kg makanan lemak tinggi terdiri dari lemak sapi 1 kg, makanan standar 4 kg, kuning telur bebek 4 butir. Makanan lemak tinggi dibuat dengan cara lemak sapi dipanaskan hingga cair, ditambahkan makanan standar, diaduk sampai merata, kemudian ditambahkan kuning telur bebek, dipanaskan sambil diaduk beberapa menit (10 menit), kemudian didinginkan (Dharma dkk., 2012). 7. Penentuan dosis Atorvastatin Dosis atorvastatin dewasa adalah 10 mg/hari. Faktor konversi dosis manusia ke tikus adalah 0,018, maka dosis untuk tikus adalah 0,18 mg. 8. Perlakuanterhadaphewancoba Hewan uji terlebih dahulu diadaptasikan dengan lingkungan selama 7 hari atau 1 minggu dengan memberikan pakan normal, pada hari ke-8 dilakukan pengambilan darah pertama hewan uji sebagai data kadar kolesterol awal atau normal hewan uji. Hewan uji kemudiandiinduksi secara endogen menggunakan PTU (Propiltiourasil) dan secara eksogen menggunakan MLT (Makanan Lemak Tinggi) secara oral selama 14 hari untuk meningkatkan kadar kolesterol total,trigliserida, LDL dan untuk

38

menurunkan kadar HDL.Setelah 14 hari pemberian PTU dan MLT dilakukan pengambilan darah hewan uji dilakukan untuk mengetahui kadar kolesterol setelah diinduksikan PTU dan MLT. Hewan coba dibagi dalam 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari kelompok kontrol normal, kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif dan kelompok uji yang terdiri dari kelompok uji I, kelompok uji II dan kelompok uji III.Kelompok I yaitu kelompok tikus normal yang hanya diberikan minum dan pakan standar. Kelompok II yaitu kelompok kontrol negatifyang diberikan penginduksi kolesterol PTU dan MLT. Kelompok III yaitu kelompokkontrol positifyang diberikan MLT dan PTU kemudian diberikanatorvastatin 0,18 mg/g BB. Kelompok IV yaitu kelompok uji yang diberikan MLT dan PTU kemudian diberikanekstrak etanol rimpangwualae dosis 100 mg/kg BB. Kelompok V yaitu kelompok uji yang diberikan MLT dan PTU kemudian diberikanekstrak etanol rimpangwualaedosis 200 mg/kg BB. Kelompok VI yaitu kelompok ujiyang diberikan MLT dan PTU kemudian diberikan ekstrak etanol rimpangwualae dosis 300 mg/kg BB.Pengamatan kelompok kontrol normal, kelompok kontrol positif, kelompok kontrol negatif dan kelompok uji dilakukan selama 14 hari, setelah 14 hari perlakuan dilakukan pengambilan sampel darah dari hewan uji sebagai data kadar kolesterol hewan uji setelah pemberian ekstrak etanol rimpang wualae(Etlingera elatior (Jack) R.M Smith). 9. Pengambilan plasma darah Hewan coba tikus jantan (Rattus novergicus) galur Wistardiambil darah bagian vena lateralis ekor dengan cara hewan uji coba terlebih dahulu dipersiapkan lalu pada bagian ekor diberi kompresan air hangat selama 5 menit, untuk melebarkan vena.

39

Kemudian ditusuk dengan menggunakan spoit 1 cc secara perlahan pada bagian ekor lalu diambil darahnya dan dimasukkan kedalam microtube. Sampel darah dalam microtube terlebih dahulu dilakukan pengocokkan kemudian didiamkan selama 5 menit lalu disentrifuse untuk mendapatkan sampel plasma darah (Zulkifli dkk., 2014). Plasma darah hewan uji selanjutnya dilakukan pengukuran kadar kolesterol total, trigliserida, dan HDL yang dilakukan menggunakan alat photometer 5010V5+ dan dilakukan perhitungan kadar LDL hewan uji. 10. Pengukuran sampel 1) Prosedur pengukuran kadar kolesterol total Tabel 7. Pengukuran Kadar Kolesterol Total Bahan Blanko (µL) Sampel (µL) Akuades 10 Sampel plasma 10 Larutanreagen kit kolesterol total 1000 1000 Pengukuran kadar kolesterol darah hewan uji tikus dilakukan menggunakan metode cholesterol oxidase–phenol (CHOD-PAP). Sebelum dilakukan teknik pemeriksaan kolesterol total terlebih dahulu dipersiapkan sampel plasma darah hewan uji. Darah yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung yang berisi antikoagulan (EDTA) lalu didiamkan selama 5-10 menit, kemudian sampel darah disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Diambil sebanyak 10 µL plasma dipipet dengan mikropipet dan direaksikan dengan reagen kolesterol sebanyak 1000 µL lalu dikocok, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna merah muda.Blanko dibuat dari 1000 µL reagen kit ditambahkan dengan akuades 10 µL, serapan sampel diukur dengan photometer

40

5010V5+ pada panjang gelombang 546 nm. Prinsipnya adalah kolesterol ditentukan setelah hidrolisa enzimatik dan oksidasi. Indikator Quinoneimine terbentuk dari hydrogen peroxidase dan 4 –aminoantipyrin dengan adanya phenol dan peroxidase (Lynch’s, 1993 ; Riani dan Ani, 2008). 2) Prosedur pengukuran kadar trigliserida Tabel 8.Pengukuran Kadar trigliserida Blanko (µL) Sampel (µL) Bahan Akuades 10 10 Sampel plasma Larutanreagen kit trigliserida 1000 1000 Kadar trigliserida dianalisis dengan menggunakan metode Glycerol-3Phosphate Oxidase- Phenol Amino Phenazone (GPO-PAP). Sebelum dilakukan teknik pemeriksaan trigliserida terlebih dahulu dipersiapkan sampel plasma darah hewan uji. Darah yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung yang berisi antikoagulan (EDTA), kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Sebanyak 10 µL plasma direaksikan dengan reagen kit trigliserida sebanyak 1000 µL lalu dikocok dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit sampai terbentuk warna merah muda. Blanko dibuat dari 1000 µL reagen kit pereaksi tanpa penambahan apapun. Serapan sampel diukur dengan photometer 5010V5+ pada panjang gelombang 546 nm (Lynch’s, 1993 ; Riani dan Ani, 2008). 3) Prosedur pengukuran kadar HDL Tabel 9.Persiapan Sampel (supernatan) Pipetkedalamtabungsentrifuge Sampel (µL) Reagen kit HDL 500 Plasma 50 Ket :Campur dan sentrifus selama 5-10 menit dengan kecepatan 3000 rpm.Kemudian supernatan dipipet ke prosedur kerja. Tabel 10. Prosedur Kerja HDL

41

Pipet kedalam tabung reaksi Blanko (µL) Sampel (µL) Reagen kit HDL 1000 500 Supernatan 5 Aquades 100 Ket :Campur dan inkubasi 10 menit pada suhu ruang. Kemudian diukur menggunakan alat fotometer di panjang gelombang 546 nm. Sampel darah yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung yang berisi antikoagulan (EDTA), kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Plasma yang diperoleh kemudian direaksikan dengan reagen HDL. Sebanyak 500 µL reagen HDL dicampurkan dengan 50 µL plasma. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit sampai di dapatkan supernatan. Setelahpembuatansupernatan, kemudian diambil sebanyak 5 µL supernatan lalu dicampurkan dengan 500 µL reagen HDL . Campuran tersebut dikocok dan diinkubasikan selama 10 menit pada suhuruang kemudian diukur kadar HDL dengan menggunakan alat photometer 5010V5+ pada panjang gelombang 546 nm (Lynch’s, 1993 ; Riani dan Ani, 2008). 4) Penetapan kadar kolesterol LDL Pengukuran kadar kolesterol LDL dihitung dengan rumus (Priyanto, 2009).: Kolesterol LDL (mg/dL) = TC – (HDL + TG / 5), Jika TG > 500 mg, cara ini tidak akurat. Kolesterol LDL (mg/dL) = TC – (HDL + VLDL) Ket : TC adalah Total Cholesterol H. Pengolahan Data Data yang diperoleh dibuat dalam bentuk tabel dan diagram, kemudian dideskripsikan hasilnya. 1. Analisis Data

42

Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan metode Oneway Analysis of Variance (ANOVA) dengan persyaratan data masing-masing kelompok terdistribusi normal. Metode analisis data ini menggunakan perangkat lunak Statistical Package For Social Science (SPSS), dengan taraf kepercayaan 0.05 atau 95% untuk menganalisis kadar kolesterol total, kadar trigliserida, kadar HDL dan kadar LDL dengan variasi dosis ekstrak rimpangwualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)untuk masing-masing perlakuan. Selain itu metode ANOVAdigunakan untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh ekstrak etanol rimpang wualae (Etlingera elatior (Jack) R.M Smith)terhadap penurunan kadar kolesterol total, trigliserida, LDL danpeningkatan kadar HDL serta untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan secara bermakna aktivitas ekstrak dan obat pembanding atorvastatin dalam menurunkan kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan peningkatan kadar HDL. Interpretasi data ANOVA yang diamati yaitu nilai signifikansi (sig). Jika data sig yang diperoleh : 1. Sig > 0,05maka data dikatakan tidak signifikan atau ekstrak etanol rimpang wualaetidak memberikan perubahan yang bermakna terhadap penurunan kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan peningkatan kadar HDL. 2. Sig<0,05maka data dikatakan signifikan atau ekstrak etanol rimpang wualae memberikan perbedaan yang bermakna terhadap penurunan kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan peningkatan kadar HDL. Analisis data dilanjutkan dengan analisis post hoc Least Significance Difference (LSD). Uji post hoc dilakukan dalam penelitian ini untuk mengetahui konsentrasi efektif ekstrak etanol rimpang wualae yang mampu menurunkan kadar

43

kolesterol total, trigliserida, LDL dan peningkatan kadar HDL. Uji ini dilakukan apabila dari hasil uji statistik ANOVAmenunjukkan terdapat pengaruh yang nyata (data sig < taraf kesalahan 0,05).

44