Translate Fix.doc

3. HASIL 3.1. Prosedur kerja ramuan berbasis layar virtual terhadap pocket hidrofobik dari EBOV NP Proses dimulai dengan layar virtual ramuan senyawa di TCM Database herbal (TCMHD) terhadap protein yang ditentukan (Gambar 1 kiri). Herbal dipilih kaya akan senyawa aktif. Herbal yang terpilih diuji afinitas layar MS menggunakan ekstrak kasar mereka (Gambar 1 kanan). Dengan menggabungkan metabolomik , mampu membedakan herbal aktif dari pandangan holistik dan kemudian mengidentifikasi semua konstituen yang diketahui dalam herbal aktif untuk menemukan ligan diduga untuk target. Terapi khasiat herbal TCM dikaitkan dengan baik kelimpahan dan pengayaan senyawa aktif terpilih empat herbal ( Piper kadsura, piper nigrum,japonicas Ophiopogon dan Salvia miltiorrhiza) mengandung setidaknya enam ligan diduga untuk percobaan berikutnya. 3.2. Afinitas MS dikombinasikan dengan metabolomik ditargetkan untuk layar ekstrak herbal dengan dimurnikan EBOV NP analisis afinitas MS dikombinasikan dengan metabolomik untuk menyaring herbal dan mengevaluasi kapasitas pengikatan ligan dan konstituen di setiap ramuan. Tujuannya untuk, domain inti rekombinan dari EBVO NP (Residu 36-351) dimurnikan dan diinkubasi secara terpisah dengan ekstrak herbal TCM. Ligan terikat NP kompleks kemudian diisolasi dengan ultrafiltrasi, dan senyawa dipisahkan dari target NP atau protein bebas sampel kontrol dianalisis dengan LC-MS / MS menggunakan spektrometri massa resolusi tinggi (Gambar 1 kanan). Kombinasi dari afinitas MS dan metabolomik memungkinkan mendapat hasil analisis konstituen keseluruhan herbal yang akurat. 3.3. Perbandingan hits awal dari layar virtual dan afinitas layar MS Di antara 29 peringkat teratas hits menunjukkan sampel mengikat saling diverifikasi oleh dua pendekatan screening (Gambar 4). struktur kimia hits ini ditunjukkan pada Gambar S1. Di antara 15 hits unik untuk layar virtual, 13 senyawa tidak diverifikasi oleh layar MS afinitas karena nilai BI rendah di bawah ambang. Dengan demikian mereka cenderung hit positif palsu dari layar virtual. di sisi lain, 12 senyawa dari tiga herbal yang menghindari layar virtual yang ditemukan oleh afinitas layar MS (Gambar 4). Pemilihan hit dengan kriteria yang sangat ketat untuk memaksimalkan hit rate layar virtual. 3.4. Isolasi senyawa dan ligan mengikat validasi Di antara 14 ligan, kami memperoleh 7 standar murni dari pemurnian dari tumbuhan yang sesuai . Analis Semua tujuh senyawa uji co-diidentifikasi oleh dua pendekatan screening yang bermakna dikaitkan dengan target NP dan dianggap ligan divalidasi (Tabel 1). Untuk valigasi ligan, kami memperkirakan afinitas pengikatan masing-masing senyawa murni menggunakan metode yang dikembangkan sebelumnya afinitas MS berbasis kesetimbangan menggunakan metode yang dikembangkan sebelumnya afinitas MS berbasis konstanta disosiasi (K d) dihitung untuk ligan yang berbeda terutama dalam medium berbagai mikro-molar, yang biasanya dilaporkan untuk produk turunan ligan (Tabel 1). 3.5. Penilaian bioaktivitas dan mekanisme molekuler dari ligan kimia baru EBOV NP protein merupakan bagian integral dari nukleokapsid virus yang berkaitan erat dengan template virus RNA, sehingga oligomer dari NP protein memainkan peran penting dalam menjaga integritas Template dan menyediakan template yang akses ke RNA polimerase virus. Untuk menilai bioaktivitas ligan NP baru, akses ke RNA polimerase virus menggunakan protein NP (residu 36-450). Struktur kristal EBOV NP (PDB4Z9P) mengindikasikan lipatan Helix-20 NP menuju dan berinteraksi dengan pocket hidrofobik dalam C-lobus untuk membentuk struktur kompak( Gambar 6C kiri). Ligan kimia baru hanya dapat mengikat struktur kompak ( Gambar 6C kiri). Sebagai peptida VP35 dilipat dalam bentuk V dengan ujung dua heliks orthogonal terbuka luas, memungkinkan akses mudah dari HJ-4 ke pocket hidrofobik seperti yang ditunjukkan oleh docking molekuler (Gambar 6C

kanan). Karena afinitas tinggi dari peptida VP35, interaksinya dengan NP akan mungkin mendorong protein untuk membuka pocket hidrofobik menjadi lebih besar, sehingga meningkatkan persentase ikatan ligan kimia ke bagian yang sama.