Tlc Parte5

Indicacionesy sugerencias se producenfrentesdeleluyenteirregulares duranteel desarrollo - Si se alteralatemperatura y, por consiguiente, resultadosno reproducibles. luz - Duranteel desarrollolas cubetasdebenprotegersede fuentesde calorunilaterales, solary corrientesde aire. ambienteno influyenapreciablede la temperatura - En general,las pequeñasvariaciones menteen los Rfs. 3.5.3 lrpos de Cubetay técnicasde desarrollo[47 - 49] En principiohay dos tipos de cubetas,las de cámarade gas grande(llamadascubetas normales)y las de cámarade gas pequeña(cubetassandwich)'

4l

Cubetasnormales La cubetanormalde vidriode medidas21 x21 x g cm es la utilizadamásfrecuentemente en análisisporcromatografía de capafina.Permlteel desarrollo simultáneo de hasta2 placasoe CCFde 20 x 2Ocm (Fig.31). Enel casode la cubetanormalsaturadase revisteel interiorde la cubeta(limpiay seca)con papel de filtro cortadode tal maneraque quede una ventanaestrechapara observarel desarrollo. La cubetase llenacon unos100a 150ml del eluyentehastaunaalturade 0.5a 1 cm y se inclinacuidadosamente paramojarel papelde filtroy equilibrarla con losvaporesdel eluyente.Debe evitarseengrasarla tapa del depósitopues la grasa de cierre podría trasvasarseal eluyenteo a la capa. Al cabode 5 a 10 minutosla cubetaestásaturadaconvaporesdeleluyente. La placade CCF se debeintroducirde maneraque el eluyenteno salpiquepor encimade la lÍneade partida, arrastrando sustancia.Hayque evitartambiénque la placatoque lateralmente el papelde filtro.Enestecasoel eluyentellegaa la capatambiéndesdeeselado,con lo queel frentedel eluyentese inclinahaciaarribay el cromatograma dejade ser interpretable. Despuésde la elución la placa se retira y se seca (hay que tener precaucióncon los vaporesde disolventes). Si se desarrolla en recipientes no saturados, sin revestimiento de papelde filtro,se evapora disolvente sobretodo en lasproximidades delfrente,reponiéndose estapérdidaa travésde ra capa.Con ello aumentala cantidadde disolventeque pasa por la capa para un mismo recorridodel frentey por lo tanto tambiénlos Rfs. Cubeta de doble depósito La cubetade dobledepósitocontieneen su basedos tinasseparadaspor una mampara. Paraun desarrollo normallineal(Fig.32A)el consumode disolvente (unos20 ml paraunaplaca de 20 x 20 cm,unos4 ml paraun tamañode placade 10 x 10 cm)es sustancialmente menor respectoal de unacubetanormal,lo quereducelosproblemas posterior. de su eliminación La cubetade dobledepósitopuedeutilizarse tambiénparapreacondicionamiento completo.En estecasoel eluyentese encuentraen el depósitoopuestoal que estásituadala placa(Fig. 328).Trasunos 10 minutosse inclinala cubeta,con lo que empiezael desarrollo. En una variante,la cubetapuedepreequilibrarse con un disolvente cualquiera sin que la placaesté sumergidaen él (Fig.32C).La eluciónno empiezahastaque no se llenacon eluyenteel depósitoen el que se encuentrala placa. Cubeta sandwich (CubetaS) Secubreunaplacao foliode CCFcon unaplacade vidriodejandoun espaciopequeñoentre ambasy unazonalibrede unos2 cm de anchoen la parteinferior(lacubierlade vidriono debe quedarsumergidaen el eluyente). Este"sandwich"puedeintroducirse en cualquiercubeta (Fig.33). La disposicióndescritaarribarepresentauna cubeta no saturadaideal.Puede hacersefuncionarcomo cubetasaturadaidealusandouna placa de CCF empapadade eluyentecomo cubiefta. La cubetasandwichse utilizacuandono se deseaque la capa de sorciónse impregnede vapordel eluyenteo paraevitarque se evaporeeluyentede la capa. Cubeta horizontal(cubetalineal) Es unacubetasandwichparadesarrollo horizontal de placasde CCF(Fig.3a).El desarrollo puedeiniciarse por un ladoo porambos.La placade CCFse introduceen la cubetalinealcon +¿

Papel de filtro

Cubetanormal

Ventanapara observación

con papel de la cubetanormalsaturada:A. : cubetanormal,B. : revestim¡ento Fig.31: Utilización : Oet¡ttro,C. : llenadodel eluyente,D. : introducciónde las placasde CCF.E. vista lateral'

Fig.32: Cubetade dobledepósitoen situación A. E l uci ónnormal , B. Preacondicionamiento, C. Saturaciónde la cámarade gas.

lacapahaciaabajoy a unadistanciade 0.5mm de la contraplaca. Se llenanlosdepósitoscon eluyentey ambascintasde vidriose inclinanhaciadentro.Las columnascapilaresque se formanhacenllegarel eluyentea la capa.La eluciónse detieneautomáticamente cuando ambosfrentesdel eluyentese encuentran en el centro. Unaventajaespecialde estacubetaes su posiciónhorizontal (eleluyenteno necesitaavanzar en contrade la fuerzade la oravedad). Cubetas Vario Las cubetasvario sirvensobre todo para optimizarlas condicionesde separación.El por el procedimiento desarrollose realizahorizontalmente sandwichcomo en la cubera horizontal. A diferencia de la cubetahorizontal, la cubetaVario-KS contienehastaB depósitos paraeluyenteso acondicionadores (enCCF,hasta6 depósitosen HPTLC). Fig. 33: Cubetasandwich.A : esquema,B : introducción del "sandwich" en el depósiro cromatooráfico. Placa de CCF

Espaciador Cubierta de vidrio

Puntos de partida

Cubiertade vidrio

A

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Espaciador

Fig. 34: Cubeta de desarrollohorizontalde HPTLC(CAMAG) 1 : Placade HPTLC, 2 = Contraplaca, 3 : Depósitosde eluyente, 4 : C i ntade vi dri o, 5 = Tapa.

solucionessalinassaturadascon soluto precipitado,(ver Ayudándosede determinadas Merckp. 80)es posibleajustarde maneraprecisala humedadrelativa Tablasparalaboratorio, puedeninvestigarse varios Alternativamente del airey por lo tantoel preacondicionamiento. (Fig.35). alavez bajolas mismascondiciones eluyentes Cubeta en U CAMAG La cubetaen U sirveparala elucióncircularde placasde CCF desdedentrohaciafuera. placasdetamaño5 x 5 cm o bien 10 x 10 cm. Se aplican100o 200 nl Puedenutilizarse alrededordel centrode la placa(Nanomatl). formandounacircunferencia resoectivamente Las placasse introducencon la capa haciaabajoy el aportede eluyentese realizapor el centroa travésde una jeringa(Fig.36, cubetaen U). Cubeta en U anticircularCAMAG a la se suministra Ladireccióndelflujoes en estecasodesdefuerahaciadentro.Eldisolvente desdela cualfluyehaciael centro.Puedenaplicarsehasta48 capasobreunacircunferencia (Fig.37). muestrasa lo largode la carainteriorde esta circunferencia de fueraa dentroaumentaa medidaquese en su recorrido Lavelocidaddelfrentedeleluyente con lo de 3 a 4 minutosparaeluir48 muestras, se necesitan círculo. Sólo centro del acercaal queesteprocedimiento es unode losmásrápidosentretodaslastécnicasde elución.Esideal paramuestrascon Rrsaltos. CubetasSB/CD,REGIS en sentidoascendentecolocadasen 5 ángulos Las placasde CCF puedendesarrollarse más o menos de la cubeta.En la parte exteriorse evaporael distintos,sobresaliendo continuosobreuna tenemosun desarrollo y es repuestodesdeabajo.Endefinitiva disolvente Rysbajos. con de sustancias distanciacofta.De ello resultauna buenaseparación CubetasAMD, CAMAG variasvecesen la mismadirecciónde manera de capafinase desarrollan Loscromatogramas El eluyentese renuevaen cada y por lo tanto muy reproducible. totalmenteautomatizada

'Jttr?.,, S

Fi g.36: Cubetaen U, circular.

,..:*

Fijadores a presión Placa de CCF Chasis de la cubeta Depósitosacondicionadores

b

'i,r

Fig.35: CubetaVario-KS (CAMAG). recorridoy avanzaalgomásque la vezanterior. Estedesarrollo múltiplepor etapasllevaa la focalización (compresión) de las manchasen la direccióndel flujo. Lautilización de "gradientes de eluyente" (verCap.3.5.2)conllevalaventajaespecialde poder separaren un solo cromatograma sustanciasde polaridadmuy distinta. En la figura39 se representa el diagramade flujode una cubetaAMD. Existetodaunagamade cubetasde otrostiposdisponibles comercialmente, sobrelascuales no se va a profundizar aquí(p.ej.la cubetaChrompres, la cubetaScilabMobil-R,, lacubetade HPPLC). 3.6 Detección. Despuésdel desarrollose retiranlas placasde la cubeta,se secan y se detectanlas sustanciasseparadas.Esto es muy sencilloen el caso de compuestoscoloreadoso de Fig.37: Cubetaen U, anticircular. M - Eluyente;P : Placade HPTLC;L: Rapa.

3 i ¡ Í- l

1' i I

uI 46

4

Placas de CCF hasta 10 x 20 cm

Compuerta de teflon

Tapaderade vidrio

Cisternade vidrio con molduras para 5 Posiciones de la placa

Fig.38: CubetaSB/CD(REGIS).

sustanciasque pueden hacersefluorescero que absorbenradiaciónUV. Cuando las sustanciasno son coloreadasni absorbenradiaciónUV ni fluorescenbajo luz UV deben fluorescentes o coloreadas derivatizarse con reactivosde detecciónparaformarsustancias el UV absorbentes en [2,3].

@ Fig.39: Diagramade flujo d e una cubetaAMD. 1 : Cubetade elución, 2 = Contenedoresde eluvente, 3 : Válvulade 7 oasos, 4 : Mezcladorde gradiente, 5 = Frasco lavador, 6 : Depósitode gas, 7 : Bomba de vacío, 8 : Deoósito colector.

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3.6.1 DetecciónmedianteradiaciónUV. La detecciónmedianteradiaciónUVes un procedimiento rápidoy sencilloparadetectarlos compuestosseparados. Se vendenlámparasUVque emitenradiaciónde longitudde onda 254 nm y/o 366 nm. La detecciónse realizaen habitaciones oscurecidas o en cubetascon lámparaUV integrada. que absorbenp. ej. a 254 nm puedenser detectadasmuy fácilmentesobre Lassustancias placasque contienenel indicadorfluorescente F 254,cuya fluorescencia verdese excita mediante la longitud de ondade254nm.Lassustancias disminuyen la emisióndelindicador fluorescente y se reconocen excitableporUV254 comozonasoscuras(violeta oscuro)sobreun (disminución fondofluorescente de la fluorescencia, extinciónde la fluorescencia).

Fig.40: Dispositivos de pulverización. A atomizadorde laboratorio CAMAG,B unisprayCAMAG,C cabinade pulverización, D esquemade la cabinade oulverización.

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