Tlc Parte6

puedeexcitarsepor radiaciónUV se detectan Las sustanciascuya propiafluorescencia UV preferentemente Se hacenvisiblesbajoradiación sobrecapassin indicadorfluorescente. y brillantessobrefondooscuro. como zonasluminosascoloreadas química a modificarni destruirla estructura acostumbra Ningunode los dos procedimientos de los compuestosdetectadosy son por ello los más adecuadosparafinespreparativos. 3.6.2 Detecciónpor derivatización. Lasreacciones individuales no reaccionan de derivatización se utilizancuandolasfracciones a la radiación UVocuandolasensibilidad de ladetecciónes insuficiente Porprincipio, 124,5O1. que el reactivose utiliceantesde la aplicaciónde la sustancia(derivatización es irrelevante precromatográfica) postcromatográfica). o despuésdel desarrollo(derivatización precromatográfica La derivatización sirveno sólo paravisualizarsinotambiénparaaumentar por los compuestosinvestigados la selectividad delsistemade separación o transformar los comouestoslábilesen estables. postcromatográfica Laderivatización sirvesobretodo pararevelarlassustanciasseparadaso paraaumentarla sensibilidad de la detección. los reactivosde detecciónse pulverizan Usualmente sobrela placao folio.Algunosde estos p. ej. en forma de solucioneslistaspara usar (p. ej. reactivosse vendenya preparados, rodaminaB,ninhidrina, La mayoría debensinembargoprepararse ácidofosfomolíbdico). en el y pulverizarse medianteatomizadores laboratorio adecuados(Fig.a0). Entreellosse encueniranlos atomizadores de laboratorio. acooladosa una conducciónde que se componende un y las llamadaspistolaspulverizadoras airecomprimidoo nitrógeno, (atención:por su depósito,un contenedorde gas portadory una cabezapulverizadora fluoroclorados contenidoen CFCs- hidrocarburos - nocivosparael medioambiente,las pistolaspulverizadoras y los botesde aerosoldejaránde utilizarseen un futuropróximo). con buentirajeo siemprebajouna campanade extracción La pulverización deberealizarse tóxicao medianteun dispositivoadecuadoque se llevela nieblade reactivo,generalmente agresiva,y los vaporesde disolvente.El cromatogramase coloca en posiciónveftical ligeramente inclinado.Cuandose ha formadouna neblinauniformese dirigeel chorrodel hastaque se atomizadorsobrela placay se pulverizade manerauniforme,generalmente puede producir la disolución o el arrastre Pulverizar en exceso empiezaa hacertransparente. placa (Fig. 41). de algúnode los compuestosde la se disponetambién de dispositivosde Además de los dispositivosde pulverización en la inmersión.La inmersióny extracciónverticalesasí como el tiempode permanencia a voluntady se realizande cubetade inmersión(algunossegundos)puedenseleccionarse maneraautomática12,511. Algún reactivopuede estar mezcladocon la capa con lo que la derivatizaciónpor puedeañadirsea travésde la fase se realizadespuésdel desarrollo.También calentamiento con el eluyente(p. gas(p.ej.losgasesnitrososparaloscompuestos o mezclarse aromáticos) ej. la ninhidrinaparalos aminoácidos) [52,53]. hande calentarse en unaestufao sobreunaplacacalefactora A menudoloscromatogramas despuésde añadirlosreactivosde detección,paraactivarla reacción(p.ej.de 10 a 15 min.a 105-110 'C). ya que lnmediatamente despuésdel reveladoconvienemarcary rotular(alápiz)lasmanchas, éstaspuedenpalidecero cambiarde color. 49

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A Fig. 41: A: Representación esquemática del procesode pulverización B: Esquemade la pulverización.

lndicacionesy sugerencias - Es imprescindible y usargafasprotectoras guantesde laboratorio al efectuarla pulverización. - La derivatizaciónmodifica o destruyela estructuraquímicade los compuestos. - La derivatizaciónes más caray laboriosa que la detecciónpor radiaciónUV,aunque en determinados casosmuchomássensible. - Los gases portadoresde los aerosoles preparados contaminanel medioambien- Al sumergirse corre el peligrode disolverlos compuestospor acción del disolvente (remedio: cambiarla polaridad) o de que el aguadel reactivodisuelvala capa (remedio: prepararel reactivocon un disolventeorgánico). - Las sustanciaspuedendifundirdurantela inmersión. 50

que por - Los reactivosde detecciónse repartende forma más homogéneapor inmersiÓn personal y medio al al menos contaminan inmersión pulverización. Los reactivosde pulverización. que los de ambiente - Al calentaren una estufadebe ponerseuna superfíciemetálicadebajode la placapara homogéneo. conseguirun calentamiento 3.7 Evaluación Trasfinalizarun cromatogramade capafina debenevaluarselos resultados.Existeuna gran (Fig.42).Losmásimportantes variedadde métodosadecuadosa cadatipo de problemática 55]. a continuación se describen [54, 3.7.1 Evaluacióncualitativa. de capafina se realizanparaidentificarsustanciasde una mezcla,pero Los cromatogramas parael controlde tambiénparacomprobarpurezaso separarmezclas.Sirvenespecialmente síntesiso del transcursode una reacción.

Semicuantitativa lnd¡recta Directa(in situ) -

- Comparaciónde la Recorridos intensidaddel color Colores/lntensidad UV - Comparaciónde la Comportamiento intensidadde Combinacióno fluorescencia acoplamientocon I R,E M ,RM N ,C G - Comparacióndel tamañode mancha - ldemcon unaser¡e de diluciones

-

Fotometría Gravimetría Volumetría Polarimetría Polarographía IR ,E M,R MN Mediade isÓtoPos Fosforescencia Fluorescencia EAA Determinación enzimática

Dens¡tometría Espectrofotometría Medidasde centelleo Radiometría

Fig. 42: Métodos de evaluación. cl

ElRt(verCap.2.2)indicala posicióndelcromatograma en quese encuentra unasustancia. Es conveniente tratarlocomoun valormeramente ya que sontantoslosfactoresque indicativo intervienen que es muy difícily laboriosoobtenerRrsexactamente durantela cromatografía reproducibles. Confinesde identificación es necesario relacionar los R,sde loscompuestos analizados con los de las sustanciaspatrón.Si coincidenes probable(perono seguro)que se tratede las mismassustancias. La cerlezaen la identificación sólose consiguerealizando, ademásde la cromatografÍa de capafina,estudiosespectroscópicos (p. ej. espectroscopía lR, RMN,de masas,o el acoplamientos de las mismascon la CCH. 3.7.2 Evaluaciónsemicuantitativa. Laevaluación por semicuantitativa se utilizacuandohayquedeterminar si se estáclaramente encimao por debajode unosvaloreslímite,o cuandobastanindicaciones aproximadas. juntoa la muestravariasconcentraciones Encualquier casose cromatografían de lasustancia de interés.Laevaluación se realizaporcomparación visualo pormedicióndeldiámetroo de la superficiade las manchas.La exactitudmáximase sitúaalrededordel + 10%. 3.7.3 Evaluacióncuantitativa. Paralaevaluación y directos.Enel primercaso cuantitativa se disponede métodosindirectos lassustancias hande extraerse paraproseguir de la placamedianteun procesode disolución los estudios.En el segundola evaluacióntiene lugar directamente sobre la placa (: ¡¡ situ). 3.7.3.1 Evaluacióncuantitativaindirecta. Unaposibilidad poco impoftanteactualmente, de evaluación indirecta, consisteen rasparla regiónde la capa en que se encuentrala sustanciade interés,disolverla sustanciay, a continuación, analizarla medianteun procedimiento analíticoadecuado.Hay que teneren cuentaquelaextracción diluyela muestray quegeneralmente hayqueconcentrarla de nuevo. Tambiénen este casose recomienda patrones cromatografiar sobrela mismaplaca. La eluciónde las zonasde placasde CCF en que hay sustanciapuedehacersetambién (p.ej.conel Eluchrom automáticamente CAMAG), sinnecesidad de rasparlacapa.Primerose Fig. 43: Densitómetro de barrido(CAMAGTlC-Scannerll) y caminoóptico en medidas densitométricas. L: fuentede luz,S : rendija, M : monocromador, A: objetivo de enfoque , PM: fotomultiplicador. C : cromatoorama.

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se posalacabeza A continuación de lasmanchas. raspala capaen formade anilloalrededor de elucióny se eluye.De estaformase puedeneluirhastaseismanchasa la vez [56]. 3.7.3.2 Evaluacióncuantitativadirecta. cuantitativaes esencialaplicarlos mismos En todos los métodosdirectosde evaluación deberíanserdel volúmenes de muestray patrónsobrela mismaplaca.Lasconcentraciones entre0.3 y 0.7. mismoordeny los Rrsdeberíanestarcomprendidos en un espectrofotómetro Los cromatogramas se registranpista por pista por densitometría y se evalúanporcomparación paracromatogramas de lasalturasde picoo de lassuperficies de picoentrepatronesy muestras.Lasmedicionesse realizanbajoluzvisibleo en la regiónUV a la longitudde onda en que la - segúnlas propiedades de las sustancias- generalmente (Fig.43). sustanciaa determinarmuestraun máximode absorcióno de fluorescencia por "medidade la disminución de la fluorescencia". cuantitativa Debeevitarsela evaluación cuandose utilizaun Las sustanciasque producenuna disminuciónde la fluorescencia absorbenen cualquiercasoradiaciónUV asíquees mejor indicadorfluorescente en el UV254 deterrninarlas a la longitudde onda de su máximode absorciÓn. (laradiación UVesabsorbidaporelvidrioo de luzse mideporreflexión Engenerallaabsorción pueden o fluorescentes placa). coloreadas gel y la Las sustancias no sílice atraviesa el de no conllevaningunaventaja. aunquenormalmente medirsetambiénpor transmisión,

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