Croma Intro 26 & 28-01-09

1. DEFINICIONES BÁSICAS 1.1 CROMATOGRAFÍA: Metodología usada principalmente para la separación de los componentes de una muestra, valiéndose de la distribución de sus componentes entre dos fases, una en reposo (fase estacionaria), y otra en movimiento (fase móvil). Método de separación fisicoquímico basado en la migración diferencial entre zonas de solutos transportados por una fase móvil, que son retenidos selectivamente por una fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser sólida o líquida, extendida como una capa o distribuida como una película. La fase móvil puede ser líquida, gaseosa o un fluido supercrítico.

DESARROLLO HISTÓRICO: Se considera a Mikhail Tswett (1872-1919), el padre de la cromatografía por ser el inventor de la técnica moderna, y haber establecido parcialmente la terminología. La utilizó para separar clorofilas, xantofilas y otros pigmentos vegetales, por medio de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio.

Experimento de Tswett Las especies separadas aparecian como bandas coloreadas en la columna, por lo que bautizó a su técnica a partir de las palabras griegas chroma=color, y graphos=escritura.

Sistema Cromatográfico: Se denomina así al conjunto de las fases móvil y estacionaria, la muestra a separar y a los aditamentos instrumentales que aseguran las condiciones de temperatura, presión, humedad relativa, disolventes, etc., necesarios para el desarrollo de la separación cromatográfica. Algunos ejemplos: TLC

CC

HPLC

1.2 Fundamentos Básicos de la Separación: Cuando la muestra y la fase móvil son forzados a atravesar la fase estacionaria, pueden entrar en juego diversas fuerzas fisicoquímicas (interacciones hidrofóbicashidrofílicas, puentes de hidrógeno, interacciones dipolares y electrostáticas), que propician diferencias afinidad y atracción entre cada uno de los componentes de la muestra por la fase móvil o la fase estacionaria. Así el componente más afín a la fase estacionaria se retiene más y tarda más en eluir (es decir, en salir de la columna), y el más afín a la fase móvil se retiene menos y eluye en menos tiempo.

1.2 Fundamentos Básicos de la Separación:

Para cada componente de una mezcla se establecerá un equilibrio que involucra la fracción de cada especie distribuida por cada fase en equilibrio, esto es, para A, B y C: Am ⇔ Ae; Bm ⇔ Be; Cm ⇔ Ce

Entonces, puede definirse una Constante de Distribución, (K), que describa la razón de la distribución de los componentes de la mezcla entre las fases: KA = cAe / cAm ; KB = cBe / cBm; KC = cCe / cCm Las características químicas de A, B y C pueden ser lo suficientemente diferentes para ser atraídas con distinta fuerza por la fase estacionaria. Para este ejemplo, las moléculas de C viajarán a mayor velocidad que las de B y las de B a mayor velocidad que las de A.

Para que A eluya de la columna es necesario que una cantidad determinada de fase móvil atraviese la columna. Esta se denomina Volumen de Elución. (Ve) El volumen de elución será creciente en el orden C, B y A. Si se trabaja a caudal constante (p.ej.: en HPLC), el volumen de elución de cada especie será proporcional a un tiempo de retención, o tiempo de elución. (tR)

Desarrollo Cromatográfico Cromatograma: Es un gráfico u otra representación de la medida de la concentración del efluente versus el volumen del efluente o el tiempo.

Las abcisas (eje x), corresponden al tiempo durante el cual se efectúa la medición. Las ordenadas (eje y), corresponden a la señal analógica proveniente del detector (absorción, índice de refracción, fluorescencia, etc.). La altura de la señal indica en cada momento la intensidad de la respuesta, proporcional a la concentración de analito, la cual se evalúa por medición del área bajo la curva o altura del pico, el cual idealmente corresponde a una distribución normal gaussiana. Es frecuente que el pico se deforme y presente asimetrías, las cuales es menester minimizar ajustando las condiciones operativas

La consecuencia de los procesos individuales aleatorios es una dispersión simétrica de las velocidades alrededor del valor medio, el cual representa el comportamiento más frecuente de las partículas, confiriendo la carácterística forma gaussiana a los picos de elución.

El movimiento descendente por la columna aumenta la distancia entre las bandas y a su vez, aumenta el ensanchamiento de las mismas. Esto puede dar pié a una disminución en la eficiencia de separación, aunque pueden encontrarse condiciones en que el ensanchamiento de las bandas ocurra más lentamente que la separación de las mismas.

Durante la migración a través de la f.e., un analito experimenta miles de transferencias entre fases. El tiempo que pasa en cada fase después de una transferencia depende de que gane suficiente energía térmica del medio para producir la transferencia inversa. Un analito eluye solamente cuando reside en la fase móvil. El ensanchamiento de la banda se relaciona directamente con el tiempo de residencia en la columna e inversamente con la velocidad a la que fluye la fase móvil.

2. Clasificación de la Cromatografía: 2.0 Por la geometría de contacto entre las fases: •  Cromatografía Plana: •  La F.E. se mantiene sobre una placa lisa o en los intersticios del papel. •  La F.M. se desplaza a través de la F.E. por capilaridad o gravedad.

•  Cromatografía en Columna •  La F.E. se sostiene por las paredes de la columna. •  La F.M. se desplaza a través de la F.E. por adición continuada.

2.1 Por el tipo de fase móvil y estacionaria: •  Cromatografía de líquidos. •  Cromatografía de gases. •  Cromatografía de fluidos supercríticos.

•  Cromatografía de líquidos. •  Cromatografía en fase normal: fase móvil no polar y fase estacionaria polar (sílica gel). •  Cromatografía en fase reversa: fase móvil de naturaleza polar y fase estacionaria no polar. La cadena hidrocarbonada puede ser de cadena larga (C18), cadena intermedia (C8), cadena corta (C2.