Croma En Papel 18-02-09

Cámara cromatográfica Fase Estacionaria

Muestra

Fase Móvil

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Muestras en disoluciones de 0.1 a 1% se aplican con micropipetas o microjeringas de 10 a 100 ml de capacidad o con tubos capilares que terminen en un orificio de 0.5 a 0.1 mm de diámetro.

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Manchas deben tener de 1 a 3 mm de diámetro y estar separadas por 1 a 2 cm Separaciones analíticas: aplicaciones de 5-100 mg.

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Desarrollo Unidimensional ascendente: permite el análisis simultáneo de varias muestras. Permite mantener buena saturación de vapor.

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Desarrollo descendente: preferible para sustancias de desplazamiento lento.

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Desarrollo en cromatocaja: el papel es enrollado, separado por láminas de teflón. Permite mayor desplazamiento.

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Desarrollo horizontal: Mejora la reproducibilidad de Rf.

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Desarrollo radial o circular: Permite un mayor flujo de disolvente en la zona en que tienden a formarse colas, se obtiene mejor definición de zonas y Rf mas reproducible (modificación croma cónica).

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Desarrollo múltiple: se permite el goteo del solvente al extremo del recorrido

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Desarrollo bidimensional

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Utilizar el agente revelador adecuado para los compuestos separados

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Recomendable el rociado del papel con el reactivo. Hacerlo en campana de extracción y a una distancia de 20 a 30 cm de la cromatoplaca.

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Los cromatogramas deben examinarse con luz UV, tanto corta (254nm) como larga (360 nm) antes y después de la aplicación de los agentes cromógenos.

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Agentes cromógenos permiten localizar en el cromatograma en papel de 1 a 10 mg de compuesto y en cromatogramas en capa fina, de 0.1 a 1 mg.

Condiciones que favorecen la reproducibilidad de Rf:  

Cámara de desarrollo a temperatura cte.

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Fase móvil homogénea y sin gas (reposo 2 dias).

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Seleccionar y almacenar apropiadamente el papel.

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Utilizar compuestos de referencia.

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Equilibrar el papel 24 hrs. con los vapores de solventes en la cámara.

Condiciones que favorecen la reproducibilidad de Rf:  

Cámara de desarrollo herméticamente cerrada durante el desarrollo cromatográfico.

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Permitir que el frente recorra de 20 a 30 cm desde el origen.

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Respetar los procedimientos de secado del papel y visualización de manchas

1) In situ  

Fluorescencia

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Radiocromatogramas

2) Espectrofotométricas  

Raspado y disolución

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Elución de las manchas

Condiciones que evitan la “multiplicación” o “deformación” de manchas: Aplicando disoluciones diluidas de las muestras en el punto de origen. Flujo constante de disolvente. Utilizar papel liso. Utilizar bufferes para evitar el “tailing”.

Agentes Cromógenos:  

Alcoholes:  

Nitrato cérico amónico al 6% en HNO3: Se rocía en frío, produciendo manchas rojizas sobre fondo amarillo. Los polialcoholes dan manchas amarillas.

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8-oxiquinolinato de vanadio: Produce manchas rojizas sobre un fondo negro azulado.

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Vainillina/H2SO4: Luego de rociar el cromatograma, se seca a 120 C. Alcoholes y cetonas producen manchas verde-azuladas, aunque no es muy selectivo.

Agentes Cromógenos:  

Alcaloides:  

Yoduro de platino: Luego de rociar, se calienta el cromatograma. Las manchas son azules, rojas o violetas.

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Reactivo de Dragendorff Modificado: Se observan manchas rojas o anaranjadas sobre fondo amarillo, persisten por 24 hrs. En ocasiones debe calentarse brevemente a 100 C. Las aminas terciarias tambien reaccionan.

Agentes Cromógenos:  

Aminas:    

   

Alizarina: Las aminas alifáticas y aminoalcoholes dan manchas violeta sobre un fondo amarillento. FeCl3/K3[Fe(CN)6]: Las manchas se observan con luz natural y UV. Las aminas aromáticas y triptamina dan manchas azules. Vainillina/KOH: Aminas y aminoácidos dan manchas de fluorescencia característica. Fluoroborato de p-nitrofenildiazonio: Las aminas aromáticas y los fenoles con posiciones orto y para libres dan manchas rojas y azules, respectivamente.

Agentes Cromógenos:  

Aminoácidos:  

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Morina (2´3,4´5,7-pentaoxiflavona): Los aminoácidos aparecen como manchas fluorescentes oscuras o verdeamarillentas. Tambien reacciona con otros tipos de sustancia. Ninhidrina: Calentar luego de rociar por 10-15 min a 100 C. Manchas azules o violáceas.

Agentes Cromógenos:  

Azúcares y derivados:  

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Acido p-aminobenzóico: Luego de rociar, calentar a 105 C por unos minutos. Las pentosas dan manchas rojo oscuras. Las manchas de hexosas son marrón oscuras. Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio: Calentar de 5 a 10 min a 105 C. Glicósidos, esteroides con grupo ceto y azúcares reductores dan manchas rojas. p-anisidina/ácido ftálico: Calentar de 5 a 10 min a 105 C. Las hexosas dan manchas verdes, las pentosas manchas rojo-violáceas, las metilpentosas manchas verdeamarillento, las 2-desoxipentosas manchas gris-marrón y los ácidos urónicos manchas marrones.

Agentes Cromógenos:  

Azúcares y derivados:  

Antrona: Calentar de 4 a 6 min a 105-115 C. Los carbohidratos forman manchas amarillas, verdes o azules.

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Naftoresorcinol: Calentar de 5 a 10 min a 100-110 C. Los azúcares dan color azul, las cetopentosas color verde-marrón, y las cetohexosas color rojo-marrón.

Agentes Cromógenos:  

Aldehidos y cetonas:  

2,4-dinitrofenilhidracina: Manchas amarillas, naranjas o rojas. Cuanto más insaturado o aromático es el compuesto carbonílico, más rojo es el color.

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Acido Fosfomolíbdico: Las cetonas alifáticas con más de ocho carbonos dan manchas color azul. También dan color los ácidos biliares, los ácidos insaturados y algunos alcaloides.

Agentes Cromógenos:  

Acidos grasos:  

Aceto cúprico/K3[Fe(CN)6]: Se obtienen manchas rojomarrón.

Agentes Cromógenos:  

Esteres:  

Nitroprusiato de Sodio/KOH (Prueba de Legal): Las lactonas α,β insaturadas dan color entre rojo y violeta.

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Hidroxamato férrico: Los ésteres dan manchas violetas.

Agentes Cromógenos:  

Esteroides:  

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Cloruro de antimonio: Se observan bajo luz UV manchas azules, rojas y violetas. Reacción de Libermann-Burchard: Produce manchas azules, verdes, rosa-violáceas o grises.

Agentes Cromógenos:  

Flavonoides:  

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Amoníaco: Los vapores de amoníaco dan manchas amarillas o anaranjadas. Cloruro férrico: Produce manchas azules, rojas, verdes y marrón.

Agentes Cromógenos:  

Glucósidos:  

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Reactivo de Benedict: Se producen manchas rojas y marrones. Acido tricloroacético/Cloroformo: Séquese por 30 min a 120 C. Se obtienen manchas azules, violetas y verdes. Cloruro de Cobalto: Rocíese y calientese a 100-120 C durante 5 min. Se obtienen manchas rojas, azules y verde-violáceas.