Tlc Parte4

Frentedel eluvente

Fig. 19: Esquemageneralde aplicaciÓn. Vl,Vr...: Solucionespatrón,P,, Pr-.-: Solucionesmuestra,x = Puntode partida,D: Recorrido del frente del eluyente(aprox.10 a 15 cm en CCF,aprox.S-7 cm en HPTLC),dr : distancia y entreellosy los entrelos puntosde aplicación, placa (aprox1 a 2 la inferior de lateral e bordes cm en CCE aprox.0.5 cm en HPTLC).

jeringa.Esto mismo sucede en la técnica de pulverizaciónmedianteel Linomat lV (CAMAG). a se usana menudotubosde puntode fusióncon puntasestiradas Paraanálisiscualitativos en modo de ejemplo a prácticase representa La realización de aplicación. modode caoilares la Fig.22. el volumena aplicar.Paraanálisis Con estos capilaresno es posiblemedirexactamente de volumen definido.En CCF se usan exactos,es preferibleutilizar microcapilares generalmente capilarescon volumenesentre0,5 y 5 ¡.rly en HPTLCentre0,1 y 0,5 ¡ll. En En la Fig.23 se muestraun con aplicadores. general,se empleancapilaresen combinacion aplicadorsencillo,que puedetambiénusarseparaaplicaren formade banda[35]' medianteundescensode capilares Enel CAMAGNanomat| (Fig.24)seconsiguelaaplicación presión la capase controlaautomáticamensobre de éstos La electrónicamente. controlado circular(verCap. para cromatografia pueden muestras aplicar se también te.Conesteaparato 3.5). (CAMAG). de aplicación Fig.20: Plantilla en de aplicación de esquema Fig.21: Ejemplo (técnicadel data-pair)[33]' CÓFcuantitativa Vr"Vs: Soluciones Patrón a analizar Ut"'U. : Soluciones Método del data-Pair: ",,,1.....,,..",,q-¡:

Vl

.

_.xrt:,*:;:*,.

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Ur

v2

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U1

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u2

aO.¿ aOi a

33

+-

Fig.22: Aplicaciónmediantetubo de punto de fusión.A tubo de punto de fusión,B estiramiento sobre llamadébil de un mecheroBunsen,C aspiraciónde la solucióna ensayar,D aplicación. z

F v

n

tta

Fig.23: Aplicadorsencillo(Merck).

34

f. tL

grr

gnEE|l,

Fig.24: CAMAGNanomatI con dosificacióncapilary posicionadorpara la cubetaen U.

El CAMAGes una jeringamicrométrica. del microaplicador El principiode funcionamiento y 2.3 entre 0.5 manera continua puede de fijarse arbitrariamente volumende dosificación ¡tl entre50 se puedenelegirvolumenes Conel nanoaplicador medianteuntornillomicrométrico. de palancay y 230 nl. La soluciónde la muestrase introduceen lajeringacon un movimiento se depositasobrela capade maneraanálogabajandola palanca.Graciasal piede protección placabase(p. ej. del Nanomat en la correspondiente del soporledel micro/nanoaplicador en el momentode la aplicaciónde l/llllll),la puntade la agujase ajustaautomaticamente se retirael aplicador A continuación de la placasindañarla. formaquejustotoquelasuperficie (Fig.25). y, despuésde sucesivoslavadosde la agujade la jeringa,se usa nuevamente comoenformade banda. ElCAMAGLinomatlVesadecuadoparaaplicartantopuntualmente entre1 y 99 pl sobrela capa volúmenesde muestracomprendidos Se puedenpulverizar (Fig.26). utilizandouna presiónde nitrógenodeterminada (Fig. lll puedenaplicarsemuestrasautomáticamente Con la CAMAGDC-Probenautomat ¿t t.

Una Paravolumenessuperioresa 100 ¡rl es apropiadoel métododel "Contact-spotting". películade un polímero se amoldasobreloshuecosde unaplantillade fluorohidrocarbonado aplicaciónmedianteaspiraciónpor vacío.Las solucionesmuestrase pipeteansobre los hastacasi sequedad.Estassoluciones se evaporansuavemente huecosy a continuación concentradas se ponenen contactocon la capa.Al aplicarpresiónsobrela caraposteriorde la muestra(Fig.28) la pelÍculade polímeromedianteun gas se transfierecompletamente

t361. a6

Fig. 25: CAMAGNanomatlll con jeringa.

Fig.26: Pulverización con el CAMAGLinomat lV: a) aparato,b) toberade pulverización en funcionamiento. Indicacionesy sugerenc¡as: - En análisiscuantitativosdeben utilizarse en lo posibleequiposde aplicación automatizados. - Al usarcapilares debeprestarse atencióna que se lleneny vacíenen su totalidad.

Fig.27: CAMAGDC-Probenautomat lll 36

- Precaución:las solucionesde densidad elevadapuedengotear desde el capilar antesde la aplicación. En algunasocasiones el llenadoo vaciadode los caoilares consoluciones de viscosidad elevadaouede ser un procesolentoo inclusoincompleto.Los disolventes fácilmente volátiles se evaporanparcialmenteen el capilar antes de la aplicación.En todos estos casos se debe utilizaruna jeringapara aplicarla muestra[37].

Pel ícul ade pol ímero

n

Equi pode apl i caci on

{ at

Aspiración de la películade polímero

Traspasode Ia muestra

lf

Evaporación(concentración)de la mueslra

(d) Pl acade C C F

ñ

Transferenciade la muestra a la capa de C C F

Fig.28: Transferencia de sustanciapor contact-spotting.

deberíaescogersede tal maneraque un único vac¡adodel capilar La concentración sustanciaa la capa,ya que aplicarvariasvecessobreel mismopunto aportasesuficiente puedeprovocarla deformación de la manchaal cromatografiar. si se llenany vacíansobreun papelde filtro Loscapilares de un solousopuedenreutil¡zarse vanasveces. antesdel desarrollo[38]. Las manchasde oartidadebensecarsecompletamente 3.5 Desarrollo queel eluyenteo mezclapenetreen capafinase entiendepordesarrollo Encromatogratíade tambiénporaplicac¡Ón la capade CCF- en generaldebidoal podercapilar,ocasionalmente

de presión- y en su avancetransportelassustanciasaplicadasen la direccióndel flujo.A causade las interacciones entremuestra,fase móvily faseestacionaria, las sustanciasse separanen sus componentesindividuales. Enla prácticase utilizandistintosmétodosde desarrollo, a continuación. ouese describen En principioexistentres posibilidades de desarrolloen CCF: desarrollolineal(ascendente u horizontal), desarrollo circulardesdeel centrohaciael exteriorv desarrollo circularhaciael centro(anticircular). 3.5.1 El eluyente. Para estudioscualitativos,la purezade los disolventesutilizadoscomunmenteen los laboratorios químicoses suficiente. Porel contrario,lasseparaciones paraanálisiscuantitativosdebenrealizarse paracromatografÍa, con disolventes especiales altamentepurificados. Hayqueteneren cuentaque algunosdisolventes (p.ej. EtOHen CHCIr) llevanestabilizantes que puedenfavorecero perjudicarla separación. Lamejormanerade expresar la composición deleluyente (p.ej.20 -r esen parlesvolumétricas 80, v/v). Los componentesdel eluyentedeben medirseuno por uno y sólo despuésser paraevitarloserroresdebidosa contracción mezclados o dilatación del volumen.La mezcla debeefectuarse en un recipiente apafteantesde llenarcon ellala cubetade cromatografía. Las cubetascargadasde eluyenteno deben reutilizarse demasiadasveces (de 2 a 5) porque: - cadavezque se abrela cubetalos disolventes se evaporande maneradesigualsegúnsu volatilidad. - puedentenerlugarreacciones químicasentrecomponentes del eluyente. - uno o variosde los componentes del eluyente- p. ej. los polaresen el casode la gel de sílice - pueden ser adsorbidospreferentemente por la capa durante el desarrollo (empobrecimiento de una o variasporcionesdel eluyente). - el empobrecimiento se hacesentirespecialmente al usarmezclasde dos componentes, sobretodo cuandoun componente se encuentra en pequeñaproporción. Enestoscasosel eluyentedeberíausarsesólo una vez. 3.5.2 Métodos de desarrollo. Creciente(lineal) Es la técnicade eluciónmás utilizada.La placase introduceen un recipienteadecuadode maneraque el disolventemojela capa por debajode la líneade partida.Ésteasciendepor capilaridad hastala alturadeseada(aprox.10 - 15 cm en CCF,o bien3 - 7 cm en HPTLC)y transpoftala mezclade sustanciasa separar.Las manchasse hacenmayorescuantomás cercanas al frentedeldisolvente. Durantela eluciónpuedendeformarse adquiriendo formade elipse,especialmente en las proximidades del frentedel disolvente.Cuandoel frenteder efuyentealcanzala alturaprevistase retirala placade la cubeta,se marcaexactamentesu posición(alápizo rascandocon una espátula)y se seca la placa. (lineal) Horizontal La placase encuentra y se le aplicael eluyentede maneracontinuaa en posiciónhorizontal travésde unamechao una hendidura capilar,con lo que se puedeeluirdesdeuno o ambos lados[39]. 38

Bidimensional (lineal) lamezclaa separarse aplicasobreel puntode Cuandose desarrolla bidimensionalmente partidasituadoen unaesquinade la placa.A continuación se introducela placaen unacubeta normaly se desarrollade forma lineal(verarriba).Una vez seca la placa se gira 90",se introduceen una segundacubetacon otro eluyentey se eluyede nuevo.La trayectoria cromatográfica del primerrecorridopasa a ser la líneade padidadel segundodesarrollo

t401. La posibilidadde eluir simultáneamenteun patrón en cada recorrido se da también en la elución bidimensional(Fig.29). Sin embargo,el patrón no puede eluirsebidimensionalmente sobre el mismo cromatograma,ya que se mezclaríacon la muestra.

Fig.29: Eluciónbidimensional. 1...6: Sustanciasseparadasde la soluciónproblema(campocentral)y de la soluciónpatrón bandas laterales).

0)

-0) uJ

il-

Eluyentell 39

Una característica particularde la CCF bidimensional es la posibilidadde emplearen el segundorecorridoun principioo mecanismode separación distintoal del primerdesarrollo

t411.

Radial (circular de dentro a fuera) La capase disponehorizontalmente. Las sustancias se aplicanen formade circunferencla alrededor de un puntocentraly se añadeel eluyentesobreel centrode estacircunferencia. Los componentesavanzancon el eluyentehacia fuera formandosegmentoscirculares y separándose. concéntricos Estatécnicaes especialmente útil,comparadocon la elución lineal,parasepararsustanciasde Rfs pequeños(Fig.30) ta2l. Anticircular(circularde fuera a dentro) La fase móvil se añadeaquí a lo largo de una circunferencia y avanzahacia adentro.Los puntosde paftidase disponenexteriormente en formade anillo(Fig.30).En estecaso las sustancias con Rfselevadosse separanespecialmente bien,comparadocon la eluciónlineal

t431.

Desarrollode flujo (continuo,overrun,linealy circular) Se utiliza,porejemplo,unacubetaconvencional con unaaberturaen la tapa.Eldisolvente se evaporacontinuamente de la cubeta. Una varianteevaporacontinuamente el eluvente calentando. Un desarrollo continuoresuelve siempremejorlassustancias que avanzanmás lentamente, comparadocon un desarrollo normal,ya quetienena su disposición un recorridomayor.Hay que tomarsecon calmalos largostiemposde análisis[39]. Eluciónmúltiple (multipledevelopment,linealy circular) Poreste métodola placade CCF se desarrollavariasvecestras el correspondiente secado intermedio.El frente del eluyenterecorreasí variasveces las zonas cromatografiadas. Se produceuna reconcentración y es posibleque las manchasadquieran formade elipseo de bandasestrechas. Estoproduceen generaluna mejorresolución de las sustancias con Rfs menoresque 0.5.Eldesarrollo múltiplepuederealizarse con un mismoeluyenteo con varios eluyentesde distinta polaridad.Los desarrollosindividualespuedentener lugar sobre recorridosde diferentelongitud144,451. AMD (AutomaticMultiple Development,lineal) El AMD es una variantetotalmenteautomatizada del desarrollomúltiplecon eluyentesde polaridaddecreciente (enel casodelgelde sílice). Cadadesarrollo sucesivotienelugarsobre un recorridoalgomás largoque el anterior. Al empezarcon el eluyentemás polar,todaslas sustanciasaplicadasavanzancon el frenteconcentrándose en bandasestrechas.A medida que progresael gradientese vanquedandorezagadas primerolassustancias máspolaresy luegolasapolares.Todas lasetapaspuedenprefijarse a voluntad.Despuésde cadarecorrido se eliminael disolventemediantevacío.El procedimiento ofreceexcelentesresolucióny sensibilidad. Engeneralse utilizael "desarrollo porgradiente" [46].Laobtenciónde gradientes auténticoscon polaridadvariadade maneracontinuasóloes posibleen cubetasespeciales (p.ej.cubetasen U)en lasque la alimentación del eluyentese realizaa travésde unabomba.

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