Tecnicas Basicas De Biologia Molecular(2)

Técnicas Básicas de Biologia Molecular Diamar Costa-Pinto FIOCRUZ

Visão da Apresentação

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PCR Bibliotecas genômica e de expressão Fragmentação - digestão Separação - eletroforese Clonagem molecular Sequênciamento

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Southern, Northern e Western blotting

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By Diamar

Diagnóstico do século 21 - Podemos fazer análises genômicas, pois a maioria dos cromossomo já estão mapeados. - O projeto genoma tem sido uma grande ferramenta para unir genomas e laboratório clínico.

Mapas Genéticos, Citológicos e Físicos EST – Sequências expressas marcadas. cDNA curtos que ligam mapas físicos a genéticos RFLP- Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição By Diamar

Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro. Solange Farah

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Enzimas de Restrição „ „ „ „ „ „

1953 – a eficiência de replicação de um bacteriófago dependia da célula hospedeira Verificou-se, então, a presença de nucleases Bactéria restringe o crescimento do fago e protege o seu DNA metilando-o (modificando) Fenômeno chamado restrição/modificação Advento das endonucleases de restrição Sítio é normalmente uma palíndrome

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Enzimas de Restrição (continuação)

Palíndrome: ARARA ARARA OMO OMO ANA ANA By Diamar

Enzimas de Restrição (continuação)

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Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de bases Cortes com extremidades abruptas ou coesivas Primeira letra maiúscula é gênero e as duas outras minúsculas são espécies 1073 – foram usadas para clonagem molecular Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outra espécie Fragmentos separados por eletroforese

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Enzimas de Restrição (continuação)

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Vídeo de Enzima de Restrição

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Eletroforese „ „ „ „ „ „

Já conhecida desde 1930 Difundida em 1950-1960 Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida Separa proteínas por cargas e peso molecular Separa ácido nucléicos por peso molecular

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Eletroforese

-

Fonte de eletroforese

Vertical

+

Visualização do gel de agarose

Horizontal

+

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Eletroforese

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Vídeo de Eletroforese

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Clonagem Molecular „

Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas

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Primeiro: inserto + vetor = rDNA

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Segundo: rDNA + célula hospedeira = transformação

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Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um gene específico, com uma característica desejada, e transfere este gene para outro organismo vivo Célula humana

Bactéria DNA Plasmídeo Transformação

Digestão

Enzima de restrição Tesoura genética Clonagem

DNA da bactéria

rDNA

DNA da célula humana

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O DNA recombinante

8

Não se limita a organismos de uma mesma espécie

8

A compatibilidade sexual torna-se irrelevante

8

Permite modificações em uma única geração, o que antes levaria dezenas ou centenas de gerações

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Vídeo de Clonagem Molecular

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Vetor „ „ „ „ „

São moléculas de transporte Moléculas de DNA Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, YACs, etc. Diferenças de tamanho de inserto Podem ter comportar linear e/ou circular

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Vetor (continuação)

Vetores de expressão procarióticos „ „ „

Promotores fortes Sítios de ligação a ribossomos Sítios de clonagem

Vetores de expressão eucarióticos „ „ „

Origem de replicação eucariótica Região de controle de transcrição e tradução, poliadenilação de mRNA, capping Sinais especiais para processamento e secreção By Diamar

Vetor (continuação)

Características gerais „ „ „ „ „

Região promotora Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker Gene de resistência a antibióticos Origem de replicação Gene repórter

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Vetor (continuação)

PLASMÍDEOS: „ „ „ „ „ „ „ „

Penetra naturalmente nas bactérias Fita dupla Circular Extracromossômico Resistência a antibióticos Vetores shuttle Insertos até 4000 pb pUC 18, pUC 19 By Diamar

Vetor (continuação)

FAGOS „ „ „ „ „

Vírus de bactérias Fago λ é o mais utilizado Fita dupla linear Recirculariza durante a infecção na bactéria Aceita até 20 mil pb

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Vetor (continuação)

COSMÍDEOS „ „ „ „

Pequeno tamanho 4 a 6 Kb Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do fago para infectar bactéria Possuem seqüências cos Aceitam insertos de até 50 mil pb

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COSMÍDEOS

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Vetor (continuação)

YACs (Yeast Artificial Chromosome) „ „ „ „

Células hospedeiras as leveduras Comportam-se como cromossomos Aceitam 400 mil pb Possuem seqüências de DNA específicas de levedura: telômero, centrômero e origem de replicação

ARS: Seqüência de replicação autônoma CEN: Seqüências centroméricas

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Engenharia Genética – Produção em série

- Hormônio de crescimento - Insulina humana - Vacina da Hepatite B - Hormônio sexuais By Diamar

Sequenciamento „ „ „ „

Frederick Sanger (1977), Inglaterra Segundo Prêmio Nobel Síntese de DNA in vitro por término didesoxi Mapa físico dos genes e dos cromossomos By Diamar

Sequenciamento (continuação)

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Hood: Semi-automatizado (1986) Venter: Genoma de bactéria usando ddNTPs fluorescentes automatizados, robóticas e PCR (1995) Perkins-Elmer Corp: Comercializado o Sequenciamento totalmente automatizado (1999) By Diamar

Considerações P

P A

P

P

A

C

P

BN

C5 C4

G

C4

U

Ribose C3 C2

OH

NTP Ácido ribonucleico 5’

O - Necessário para ligação fosfodiéster

Polimerização

C1

G T

Pentose C3 C2

OH

OH

BN

C5

T

C1

C

P

OH

ddNTP dNTP (Didesoxinucleotídeo) Ácido desoxirribonucleico 3’

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Estuda a integridade da sequência de um DNA molde. Analisa diferentes tamanhos de fragmentos formados a partir de um primer e da inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.

Sequenciamento A

C

G

T

DNA molde Primer DNA polimerase

T

ddNTP

G dNTP

C

A

dNTP

dNTP

C

A

ddNTP

Fragmento 1

Fragmento 2

dNTP

G

C

A

ddNTP

dNTP

dNTP

Fragmento 3

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Sequenciamento automatizado

Vídeo do Sequenciamento (Cycseqpc)

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Southern Blotting „ „ „ „ „ „

E. M. Southern (1975) Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose Transferidos para membranas por ação capilar DNA é desnaturado antes ou durante a transferência Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana Detecta polimorfismo de DNA ou mutação By Diamar

Southern blot Descrição: - Digestão do DNA em teste com enzimas de restrição; - Resolução dos fragmentos com eletroforese em gel de agarose; - Transferência do DNA para membrana de nylon; - Hibridação com uma sonda de DNA ou RNA marcada com radioatividade ou quimioluminescentes Aplicação: Alterações em um único nucleotídeos; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico; fragmentos de cromossomo. Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado.

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Southern blot

Sonda de cDNA para o gene humano ligado ao X de receptor de andrógeno hibridando no genoma digerido do paciente.

46, XY.Síndrome da insensibilidade androgênica. Vagina em fundo de saco, sem útero ou tubas uterinas. 1:20.000. Testículos no abdome ou canal inguinal (confundidos com hérnias, na infância). Defeito molecular: varia de deleção completa do gene a mutações de ponto nos domínios de ligação de andrógenos ou ligação ao DNA da proteína receptora de andrógeno.

Exemplo da especificidade das sondas.

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Vídeo de Southern blot (DNA _DetectivePC)

Northern blotting „ „ „ „ „

Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) Sensibilidade a RNAses Transferência para membrana por ação capilar Sondas de RNA ou DNA para hibridar

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Northern blotting (Continuação)

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Úteis em estudo de expressão gênica Estudo de diferentes tecidos Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo

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Northern blotting

Marcadores rRNA

RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F). A – sonda de α-tubulina – hibrida todos B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos By Diamar

Western blotting „ „ „ „

Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação Transferência para membrana por força elétrica

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Western blotting (continuação)

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Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo Informa o tamanho e a quantidade das proteínas

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Western blotting

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Western blotting Análise de proteínas por anticorpos específicos após eletroforese e transferência para membrana.

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Vídeo Immunoblotting (3EIMMBLOT)

RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição „ „ „

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Uso de enzimas de restrição Produção de fragmentos de DNA de tamanho adequados para serem utilizados As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de DNA Aplicação: compara alelos normais e afetados para cada mutação estudada.

Mapa de Restrição

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PCR - RFLP

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RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição

Um caso de erro inato do metabolismo: G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase) By Diamar

RFLP de Planta DNAs genômico de Arabidopis é digerido com EcoRI. Southern blotting com sonda azul e verde. F1 é heterogênio possui fragmentos de ambos os genitores. F1 autopoliniza: 1:2:1 Ecotipo diferentes: CColombia, NNiederzenzes e H – Heterozigoto.

Oligonucleotídeo aleloespecífico (ASO)

Descrição: - Hibridação preferencial de sonda marcada para testar DNA com composição de bases complenmentar única. Aplicação: - Alelos de composição conhecida.

Mutação é conhecida. Revela uma única alteração de base. Distingue hetero ou homozigotos para a sequência. A análise é restrita a mutação familiar conhecida ou para distúrbios genéticos com nº finito de mutações diferentes. Ex: beta-talassemia. By Diamar

FISH Hibridação in situ com fluorescência „ „ „ „

Detecta DNA localizados dentro de cromossomos Usa lâminas de microscopia Cromossomos estão em metáfase, anáfase e interfase Usa sondas de DNA específicas

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FISH (Hibridação in situ com fluorescência)

Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no cromossomo 15 paterno.

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FISH (Hibridação in situ com fluorescência) Relação evolutiva entre cromossomos. DNA de gibão Hylobates lar sondado com DNA Humano. Setas indicam cromossomo 8 do gibão.

Cromossomo humano 4 hibrida com cromossomo (laranja) do macaco verde africano. Evolução cromossômica em mamíferos

SSCP Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples ) Método baseado na mobilidade eletroforética.

Protocolo Básico

) Gel não desnaturante.

) PCR do gene alvo.

) Sensível para

) DNA desnaturado.

tamanho e forma da fita simples.

) Detecta a mudança de uma base.

(eletroforese)

) Mobilidade diferente da normal indica mutação.

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SSCP Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples Heterozigoto ) Fragmentos até 200 pb – 90% de sensibilidade. ) Fragmentos maiores que 400 pb - 80% de sensibilidade. (digestão )

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA „

Southern blotting em lâmina Chips de genes

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Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas

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Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA „

Microdisposição de oligo ou de sondas - Microssíntese de oligos in situ (no chip) - Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré fabricadas - Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA

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Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes

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Leitura por scanners By Diamar

Microarray Microarranjos de DNA – Chips de DNA  É uma técnica que emprega arranjos (arrays), que contêm um grande número de genes roboticamente distribuídos de forma ordenada em uma placa de vidro. Pode comparar a expressão de um grande número de gene, simultaneamente.  Existem lâminas de 400.000 pontos. São feitas com ponteiras de titâneo.

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Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA „

Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos

Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais

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Sequenciamento do DNA e genotipagem

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Contras

Utilização

Técnica cara

- Mapear mutações

Sensibilidade é reduzida

- Oncogenes

Lâminas não são reutilizadas

- Expressão das vias metabólicas

Repetir várias vezes

- Regiões regulatórias de genes de levedura

Grande quantidade de mRNA (2 a 5 µg)

- Expressão de genes anônimos - Analisar 10.000 amostras em 12 horas

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA

Descrição: - Hibridação do DNA em teste com disposições ordenadas de nucleotídeos em chip de silicone.

Aplicação: - Detecção de DNA em teste com composição conhecida.

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Referências Bibliográficas: „ „ „

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MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31. MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467. SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

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Obrigada!

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