Pruebas Bioquimicas Convencionales.docx

INTRODUCCIÓN Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia orgánica a partir de los elementos inorgánicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medio en que se encuentren, y de ahí que en el interior de estos ocurran una serie de reacciones de síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las cuales, reciben el nombre de metabolismo. A partir de las características metabólicas se realizan pruebas obtenidas para la identificación de microorganismo y productos obtenidos de la relación microorganismo-medio; otro de los aspectos importantes de la realización de estas pruebas, es que a partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación de los alimentos por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímica han proporcionado una herramienta útil para la detección directa de los microorganismos contaminantes. La identificación bacteriana se puede realizar por medio de una serie de análisis que necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especies bacterianas que contaminan los alimentos o aguas. Por lo cual, con el término de bacilos gramnegativos no fermentadores (BNF), se designa un heterogéneo grupo de microorganismos que constituye, aproximadamente, el 15,0 % de todos los aislamientos en los laboratorios de microbiología clínica, se comportan usualmente como patógenos oportunistas y, recientemente, han cobrado importancia por su elevada incidencia en infecciones hospitalarias. La necesidad de dilucidar si se trata de una infección o una simple colonización, así como su elevada resistencia a los antimicrobianos, convierte al aislamiento de estos agentes bacterianos en muestras clínicas en un problema grave para los pacientes ya que compromete su recuperación de forma importante. Los BNF son un grupo de microorganismos aerobios, no esporulados, que o bien no utilizan hidratos de carbono como fuente de energía, o los degradan a través de vías metabólicas diferentes a la fermentación. La identificación de BNF ocasiona numerosas dificultades en los laboratorios, ya que la mayoría de las pruebas bioquímicas corrientemente usadas para el diagnóstico bacteriológico resultan, con frecuencia, poco útiles para estos gérmenes. La literatura reporta que las tres especies de BNF más relevantes clínicamente son: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas maltophilia. Estas tres especies son frecuentemente multirresistentes a los antibacterianos (Sánchez Roitz, et al, enero 2002). Al igual, que los bacilos gran negativos no fermentadores, existen los cocos gran positivos, los cuales, son microorganismos que se aíslan con mas frecuencia en muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes en

enfermedades infecciosas, estos microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y algunos hacen parte de la microbiota normal de la piel y mucosas del hombre y así mismo de animales. Es de vital importancia identificar estos tipos de microorganismos tanto bacilos gran negativos y cocos gran positivos, puesto de que de ellos depende que se lleve a cabo un buen diagnostico y procedimiento cuando se este frente a este tipo de patógenos. OBJETIVOS -

OBJETIVO GENERAL

Desarrollar un análisis práctico sobre las pruebas bioquímicas convencionales, para la identificación de bacilos Gram-negativos no fermentadores y los cocos Grampositivos, a través de las rutas metabólicas, fuentes de carbono y nitrógeno que necesita el microorganismo para sobrevivir en los medios, para así obtener un amplio conocimiento en las practicas. -

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Identificar las pruebas bioquímicas utilizadas para los cocos Gram-positivos y bacilos Gram-negativos no fermentadores.  Practicar siembras en medios de cultivos sólidos, líquidos y semisólidos.  Interpretar los resultados que nos dan las pruebas bioquímicas para los cocos Gram-positivos y bacilos Gram-negativos no fermentadores.

MARCO TEÓRICO Las bacterias son microorganismos unicelulares de tipo procariótico, es decir, son organismos que solo se pueden observar al microscopio, constituidos por una sola célula autónoma que además no tiene membrana nuclear. Las bacterias tienen diferentes formas, tamaños, y envoltura celular bacteriana. Sus morfologías son: la de forma esférica o las llamadas cocos o en forma de barra o llamadas bacilos, y su envoltura celular bacteriana son: las Gram-positivas y las Gram-negativas, que se distinguen por su reacción a la tinción de Gram. Por lo cual, para distinguirlas usaremos pruebas bioquímicas convencionales para identificar bacilos Gram-negativos no fermentativos y cocos Gram-positivos. Para los bacilos Gram-negativos no fermentadores utilizaremos unas pruebas bioquímicas convencionales que son: 1. Prueba de Oxidación – Fermentación: Las bacterias pueden utilizar los carbohidratos por la vía fermentativa o por la vía oxidativa. Las bacterias

anaerobias los fermentan; las facultativas pueden fermentarlos o degradarlos oxidativamente; las aerobias estrictas sólo pueden oxidarlos. Para detectar si las bacterias utilizan los carbohidratos por la vía oxidativa o fermentativa se utiliza el agar OF, que contiene agar, peptona y azul de bromotimol como indicador de pH. Inicialmente el medio es de color verde (pH 7,1) y vira a amarillo cuando el medio se acidifica (pH de 6 a 7,6) producto de la fermentación u oxidación del carbohidrato. Por lo cual si el tubo de oxidación "O" se torna amarillo, pero el de fermentación "F" queda verde la bacteria es una oxidadora, no fermenta ese carbohidrato Si el tubo "O" permanece verde y el tubo "F" se torna amarillo: la bacteria fermenta pero no oxida, es una fermentadora, una anaerobia estricta, no oxida. - Si ambos tubos quedan amarillos: bacteria anaerobia facultativa, oxida y fermenta el carbohidrato. - Si ambos tubos quedan verdes: bacteria inerte, no utiliza el carbohidrato por ninguna vía metabólica. 2. Urea: En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. El agar es el agente solidificante. Las bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa, liberan amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio de cultivo haciendo virar el indicador rojo de fenol del color amarillo al rojo. Es recomendado especialmente para la detección de la actividad ureásica en bacterias que hidrolizan lentamente la urea ya que la fermentación de la glucosa presente activa la enzima ureasa microbiana. En los resultados: si el medio torno color rosado significa que la prueba dio positiva y si es de color amarillo su reacción será negativa para actividad ureasica. 3. Medio SIM (Sulfuro-Indol-Movilidad): En el medio de cultivo, la presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurasa. El gas incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico. El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la

zona inoculada. Y para la observación de indol, le agregamos al medio SIM reactivo de Kovac’s, si forma un anillo color cereza significa que es indol positivo y si no forma es indol negativo. 4. Reducción de nitratos: Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de GriessIlosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 segundos indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc puro, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 segundos, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final. Además, el fundamento consiste en identificar si el microorganismo en este medio produce la enzima reductasa y transforme los nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre. La reducción de nitrato (NO3-) a nitrito (NO2- ) y a nitrógeno gaseoso (N2). para cocos Gram-Positivos se utilizan estas pruebas que son: 1. Agar nutritivo: Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual, la pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualización de las reacciones de hemólisis. 2. Prueba de la catalasa: Pone de manifiesto la presencia del enzima catalasa en una bacteria. Esta enzima es capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de burbujas. 3. Prueba de la coagulasa: La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus, se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus de los Staphylococcus coagulasa negativos. existen 2 formas de coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede detectar

mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de coagulasa de tubo. 4. Agar BHI: Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. El agar es el agente solidificante. El agar cerebro corazón mantiene los mismos principios que el caldo para el cultivo de estreptococos y otras bacterias exigentes. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril o con sangre equina desfibrinada estéril, permitiendo así el desarrollo de hongos de difícil crecimiento. Con el agregado de 10% de sangre de caballo desfibrinada, fue utilizado para el crecimiento de Histoplasma capsulatum y de hongos patógenos. Por tratarse de un medio que contiene glucosa, no es un agar sangre apropiado para la observación de reacciones de hemólisis. Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 40 µg/ml de estreptomicina, se utiliza este medio para el aislamiento selectivo de hongos patógenos. 5. Agar DNasa: En el medio de cultivo, la tripteína es la fuente de nitrógeno, aminoácidos, y aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El ácido desoxirribonucleico (DNA), se encuentra en grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo hidroliza. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante. Este, medio de cultivo, permite diferenciar bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el agregado de ácido clorhídrico 1N. El ácido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el ácido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo. Observar el crecimiento microbiano y cubrir la placa con de ácido clorhídrico 1N. Observar dentro de los primeros 5 minutos. positivo: halo claro, transparente alrededor del crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa opaco. 6. Presencia de Hemolisis con Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis (α, ß o gamma). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el triplicase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo

no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles. La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes. 7. Agar Manitol Salado: El agar sal manitol en una fórmula diseñada por Chapman para la diferenciación de estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) de los estafilococos negativos a la coagulasa: 1. Este agar se utiliza para el aislamiento de estafilococos a partir de muestras clínicas, 2. de cosméticos 3. y de pruebas de límite microbiano. 4. El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina, que suministran los nutrientes esenciales. Una concentración de cloruro sódico de 7,5% tiene como resultado una inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos diferentes de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio del indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de estafilococos. Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de color rojo y no producen cambio de color en el indicador de rojo fenol.

RESULTADOS Y/O DISCUSIÓN Imagen 1. TINCIÓN DE GRAM DE Pseudomonas aeruginosa

Objetivo de 100X, se observa una reacción negativa a la tinción de gram. (bacilos gran negativos) Imagen 2. TINCIÓN DE GRAM DE Staphylococcus aureus

Objetivo de 100X, reacción positiva a la tinción de gram con una morfología semejante a racimos de uva. (cocos gram positivos)

Imagen 3. TINCIÓN DE GRAM DE Micrococcus

Objetivo de 100X, reacción positiva a la tinción de gram. (cocos gram positivos). Imagen 4. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICACIÓN

Foto tomada por: Carlos Cotes

Entre las pruebas bioquímicas a utilizar en esta práctica están: 1. Medio OF A la derecha el medio fue incubado en presencia de oxígeno, contrario a esto el de la izquierda fue sellado con aceite estéril con lo cual se inhibió el oxígeno creando así un ambiente anaerobio. El microorganismo sembrado fue P. aeruginosa, los resultados obtenidos nos muestran que esta bacteria oxida el hidrato de carbono presente en el medio, pero no lo fermenta esto se evidencia en el crecimiento que experimento en el tubo sin aceite y su ausencia en el tubo con aceite (ambiente anaerobio).

2. Medio urea En el medio Urea se determinó la actividad ureasica por medio de la presencia de la enzima ureasa. En este caso el microorganismo presente en el medio es P. aeruginosa. Se observa un color rosado pálido en el bisel del medio lo que podría hacernos pensar que la prueba es positiva. Según la literatura pseudomonas aeruginosa es urea variable. Según Koneman, la aparición de un tinte rosado tardío y débil en la posición inclinada del tubo hace probablemente indica una degradación inespecífica de los aminoácidos y debe ser leída como un resultado negativo de la prueba.

3. Caldos nutritivos

Caldos nutritivos con indicador de PH, la diferencia entre ellos es la presencia de un hidrato de carbono diferente (sacarosa, glucosa, maltosa y manitol). Inicialmente los medios eran de color rojo luego de la incubación se tornaron amarillos como se muestra en la foto. estos resultados nos muestras que el microorganismo inoculado en ellos (Staphylococcus aureus) fermenta estos 4 hidratos de carbono. Este microorganismo tiene un metabolismo de tipo fermentativo y anaerobio facultativo.

4. Agar DNAsa Staphylococcus aureus es la cepa que fue sembrada en el agar DNAsa. Luego de incubación fue necesario agregar a las colonias HCl 0,1N como revelador, con lo cual se observaron zonas claras alrededor de las colonias lo que indica que el microorganismo tiene la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa) que es capaz de hidrolizar el Acido desoxirribonucleico polimerizado que contiene el medio.

5. Agar Manitol

Medio selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a la alta capacidad de fermentación del manitol. La caja 1 tiene crecimiento de Staphylococcus aureus y la caja 2 de Micrococcus. los Staphylococcus coagulasa positivo fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas en este medio, la coagulasa negativa vira a un color rosado. Los microorganismos que crecen en estas altas concentraciones de sal y usan manitol en su metabolismo producen ácidos con lo que se modifica el pH del medio produciendo así las coloraciones de las colonias.

6. Agar sangre Resistencia a Novobiocina En agar sangre se sembró Staphylococcus aureus con el fin de observar su reacción a un antibiótico, (la novobiocina), esto colocando en la placa de Petri luego de la siembra sencidiscos con este antibiótico. Como muestra la fotografía, alrededor de los sencidiscos se muestra un halo de inhibición que nos permiten saber que este microorganismo no es resistente a dicho antibiótico.

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Hemolisis El Staphylococcus aureus es la cepa que fue sembrada en el agar sangre. Luego, de terminar la siembra por estría, se procedió hacer la previa incubación a 37 °C; después de pasado un tiempo de 24 horas se observó detalladamente el cultivo, en el cual, se pudo observar que hubo Hemolisis beta (β – halo semitransparente a las horillas del microorganismo) a esto se le conoce como hemolisis total. El fundamento de la hemolisis se da por la presencia de la enzima hemolisina la cual es la responsable de la lisis de los glóbulos rojos por el microorganismo.

7. Caldo BHI

Inoculamos el microorganismo Staphylococcus aureus en caldo BHI para poder revelarla dentro de 24 horas, al pasar el tiempo, procedemos a preparar el plasma, se realiza, sacando 1 ml de sangre humana y lo centrifugamos, y en tubo de ensayo, colocamos los 0,5 ml del microorganismo presente en el caldo BHI y 0,5 ml de plasma y esperamos 4 horas al aire ambiente y se pudo observar que se obtuvo una textura viscosa, es decir, se forma un coagulo, se desarrolló todo en el líquido y se solidifico totalmente.

8. Prueba Nitrato

En la prueba de nitrito y nitrato fue necesaria la utilización de utilización 2 tubos uno con la presencia de la campana de Durham y el otro sin la campana luego con ayuda de una asa bacteriológica previamente estéril se inoculo en cada tubo una pequeña proporción de la bacteria pseudomonas eruginosa y llevo a incubar a una temperatura de 37 grados por 24 horas los resultados obtenidos después de haber pasado el tiempo estipulado fueron los siguientes; en ambos tubos se evidencio turbidez por lo que indica crecimiento pero en el tubo que contenía la campana de Durham se detectó la presencia de gas lo que indica la reducción de nitratos a nitrógeno molecular y al otro tubo sele agrego el reactivo de griees y se evidencio la formación de un anillo oscuro, basándonos en los resultados obtenidos podemos decir que la bacteria es Positiva para la reducción de nitrato a nitrito y que puede ser variable para reducción de nitrato a nitrógeno gaseoso.

SIM El medio SIM se utiliza para diferenciar microorganismos sobre la base de la producción de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la motilidad en un entorno. los medios semisólidos se han utilizado ampliamente en la determinación de la motilidad bacteriana, ya que en estos se puede evidenciar de mejor manera.

Resultados En este laboratorio sembramos Pseudomonas aeruginosa en el medio SIM, para determinar solo la producción de indol y motilidad.

Indol

Motilidad

Tenemos que el indol es un compuesto que se Para motilidad Pseudomonas aeruginosa genera mediante la desaminación reductiva del es positiva ya que se evidencio turbidez en triptófano y esta reacción es llevada a cabo por todo el tubo.

algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas triptofanasas.

Pseudomonas aeruginosa

Indol: Negativo (-) Foto tomada por: Miller Flórez

Motilidad: Positivo (+)

Pseudomonas aeruginosa, al agregarle unas gotas del reactivo de kovacs al medio dio negativo para Indol. Esto debido que al agregarle el reactivo no se produjo un anillo de color cereza en el medio.

CONCLUSIÓN En conclusión, utilizamos pruebas bioquímica para identificar los bacilos Gramnegativos no fermentadores, como por ejemplo el microorganismo llamado Pseudomonas aeruginosa, este microbio no hidroliza la urea, a través de la prueba urea, como puede desnitrificar y reducir nitratos a nitratos a partir de un caldo nutritivo de nitrato de potasio como fuente de nitrógeno, este microorganismo es móvil, no produce sulfuro de Hidrogeno e indol negativo, gracias al medio llamado SIM, y como oxidan los azucares que están presentes en el agar, a través del medio O.F. En el caso contrario, de las pruebas para cocos Grampositivos, usamos Micrococcus y Staphylococcus aureus, que para Staphylococcus aureus, usamos la prueba de la oxidasa que nos dio resultado negativo, usamos 2 agares Sangre para determinar si el microorganismo presenta hemolisis y nos resultó que presenta hemolisis tipo β porque se observaron zonas claras

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