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Immunología: LEC #2 Estructura del anticuerpo y la generación de diversidad de las células B Harry Alices-Villanueva, Ph.D. Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Aguadilla Departamento de Ciencias & Tecnología 04/09/09

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Anticuerpos • Son proteínas variables específicas a antígeno producida por los linfocitos B del sistema inmune en respuesta a una infección.

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Anticuerpos • Circulan como componente principal del plasma en la sangre y linfa.

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Anticuerpos • Se enlazan a microorganismos patógenos y sus toxinas cuando estos se encuentran en los espacios extracelulares del cuerpo.

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Anticuerpos Cuando el anticuerpo se enlaza al patógeno lo incapacita y lo hace susceptible de ser atacado por otros componentes del sistema inmunitario.

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Anticuerpos • Anticuerpos individuales son específicos: cada anticuerpo se enlaza a solo uno o a un número bien pequeño de diferentes antígenos.

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Anticuerpos • Los anticuerpos exhiben diversidad en sus especifidades respectivas a antígenos.

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Anticuerpos • Repertorio de anticuerpos: el número de diferentes y especificos anticuerpos que pueden ser hechos por un individuo (~1016)

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Anticuerpos • Anticuerpos son la forma secretada de proteínas conocidas con el nombre de inmnoglobulinas (Ig).

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Anticuerpos • Antes de enfrentar antígeno, una célula B madura expresa inmunoglobulinas enlazadas a la membrana y en donde funcionan como receptores de antígeno.

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Anticuerpos • Cuando el receptor enlaza antígeno, la célula B es estimulada a diferenciarse en la célula plasmática.

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Anticuerpos • La célula plasmática secreta anticuerpos de la misma especificidad que las inmunoglobulinas en la membrana.

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Anticuerpos • Secreción de anticuerpos es la única función efectora de los linfocitos B del sistema inmune.

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Anticuerpos: función • La función de una molécula de anticuerpo en la defensa es reconocer y enlazar su correspondiente antígeno y enfrentar al antígeno a otros componentes del sistema inmune.

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Inmunoglobulinas Existen cinco clases que se clasifican de acuerdo a diferencias estructurales en regiones constantes de la molécula y diferentes funciones efectoras: • IgA • IgD • IgE • IgG • IgM 04/09/09

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Inmunoglobulinas • Son glicoproteínas compuestas por cuatro cadenas polipéptidas: – Dos cadenas pesadas o heavy. – Dos cadenas livianas o light. – IgG pesa 150 kD

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Inmunoglobulinas • Varián en secuencias de aminoácidos en la región aminoterminal de cada tipo de cadena.

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Diferencias en las regiones constantes de las cadenas pesadas definen 5 isotipos o clases de inmunoglobulinas con diferentes funciones en la respuesta inmune. Las cadenas pesadas se nombran α, δ, ε, λ µ, respectivamente a IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.

Carbohidratos enlazados a grupos amino (N) 04/09/09

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Los anticuerpos se pueden romper en fragmentos definidos de anticuerpos utilizando proteasas

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Cadenas livianas • Solo dos clases: kappa: κ y lambda: λ • No hay diferencia funcional entre inmunoglobulinas con cadenas livianas κ ó λ.

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Cadenas livianas • Se encuentran asociadas a las cinco Ig pero cada anticuerpo contiene cadenas livianas solo κ ó λ. • La abundancia relativa varía con la especie; en humanos 2/3 de las moléculas de anticuerpos son κ y 1/3 λ.

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Las cadenas polipéptidas de las inmunoglobulinas se doblan en dominios proteícos compactos y estables.

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Estructura de los Anticuerpos • Anticuerpos funcionan en diferentes ambientes extracelulares donde enfrentan diferencias en pH, concentración de sales, enzimas proteolíticas y otros factores desestabilizantes. • Su estructura les ayuda a soportar y enfrentar tales condiciones. 04/09/09

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Estructura de los Anticuerpos • Las cadenas light y heavy consisten en una serie de similar sequence motif. • Un motif consiste de 100 – 110 aminoácidos y se dobla o conforma en un dominio proteíco compacto y estable llamado dominio de inmunoglobulina.

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Un sitio para enlazar antígeno (antigen binding site) está formado por las regiones hipervariables en los dominios de una cadena pesada y una liviana

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Antigen-binding site • Comparar los dominios VH y VL de cadenas en diferentes moléculas de anticuerpo muestra que las diferencias en secuencia de aminoácidos están concentradas en regiones particulares que reciben el nombre de regiones hipervariables o regiones de determinación de complementaridad que están flanqueadas por regiones menos variables llamadas framework regions. 04/09/09

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La función de los anticuerpos es enlazarse a microorganismos y facilitar su destrucción o expulsión del cuerpo.

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Epitope • La parte del antígeno a la cual un anticuerpo se enlaza. • Tambien se le llama el determinante antigénico. • Los epítopes están expuestos en la superficie del antígeno.

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Virus del polio La cubierta del virus está hecha de tres tipos diferentes de proteínas (azul, amarillo, rosa) Los epítopes se ilustran color blanco. En azul, proteína VP1 doblada en su forma original; incluye en sí misma varios epítopes. 04/09/09

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Epítopes • Los más comunes son carbohidratos, proteínas o ambos: – – – –

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Glicoproteínas Polisacáridos Glicolípidos Proteoglicanos

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Los sitios para enlazar antígenos en el anticuerpo varián de acuerdo a la forma y tamaño del epítope

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Enlace de Antígeno • El enlace del antígeno al anticuerpo está basado en fuerzas no-covalentes. – Fuerzas electroestáticas – Enlaces de hídrogeno – Fuerzas de van der Waals – Interacciones hidrofóbicas • Los antigen binding sites de los anticuerpos son ricos en aminoácidos aromáticos compatibles con interacciones hidrofóbicas y fuerzas de van der Waals. 04/09/09

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Tipos de epítope • Una antígeno multivalente contiene más de un epítope o más de una copia del mismo epítope.

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Tipos de epítope: Multivalente

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Tipos de epítope • Un epítope lineal es aquél donde el anticuerpo enlaza partes de una molécula que están adyacentes en una secuencia linear.

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Tipos de epítope • Un epítope conformacional o descontinuo es formado por partes de una proteína que están separadas en secuencia de aminoácidos pero se acercan cuando la proteína se dobla para asumir su conformación. 04/09/09

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Algunos anticuerpos catalizan reacciones químicas que envuelven al antígeno al cual se enlazan: anticuerpos catalíticos.

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Anticuerpos monoclonales • Anticuerpos producidos por un solo clon de células productoras de anticuerpos que por lo tanto todas tienen antigen binding sites idénticos y son idénticas en isotipo. • En el laboratorio se derivan de células B que se fusionan a una célula de un mieloma (tumores de células plasmáticas) produciendo un hibridoma. 04/09/09

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Diferentes epítopes en el antígeno generan divesidad de anticuerpos.

Drogas en el cultivo destruyen las células del mieloma. 04/09/09

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Parte II: Generación de la Diversidad de Inmunoglobulinas en las Células B antes de Enfrentar Antígeno.

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Diversidad de Ig • No hay un gen que de por sí codifique cada inmunoglobulina. • Segmentos de genes arreglados secuencialmente a lo largo del cromosoma se unen para generar la Ig. • Germline form o germline configuration.

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Diversidad de Ig • Para que un gen de Ig se exprese, segmentos individuales de genes deben ser rearreglados para formar un gen funcional. • Eso ocurre solo en células B desarrollándose a partir de sus precursores en la mécula ósea.

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Diversidad de Ig • El segmento de genes que codifica el péptido lider y la región constante consiste de introns y exons.

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Diversidad de Ig • Las regiones V están codificadas por dos segmentos de genes VL o tres segmentos VH que requieren rearreglo para producir un exon que se pueda transcribir.

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Diversidad de Ig • La región V de la cadena light está codificada por dos segmentos de genes llamados variable (V) y joining (J).

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Diversidad de Ig • El loccus de la cadena pesada incluye un conjunto adicional de genes llamado diversity (D) que queda entre los segmentos V y J.

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(2 Mb)

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(6 bp)

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Recombinación aleatoria de los segmentos de genes produce la diversidad en los sitios de enlazar antígeno de las inmunoglobulinas.

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Recombinación somática • Durante el desarrollo de las células B los arreglos de los segmentos V, D, J se cortan (spliced) por recombinación de DNA (VDJ Recombination). • Este proceso está ocurriendo en células somáticas y no en las germinales. • Un segmento de cada tipo se enlaza para formar una secuencia de DNA que codifica para la región variable de una inmuglobulina. 04/09/09

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Recombinación somática • Para cadenas livianas ocurre una sola recombinación entre los segmentos VL y JL.

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Recombinación somática • Para las cadenas pesadas se requieren dos recombinaciones: – La primera enlaza un segmento D a uno JH. – La segunda enlaza el segmento DJ a uno VH. – Los segmentos V, D y J que se enlazan se seleccionan al azar en ambos casos. 04/09/09

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Recombinación somática

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Recombination Signal Sequences • Secuencias donde las enzimas cortan y unen segmentos de DNA. – – – –

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Lado 3’del segmento V Ambos lados del segmento D Lado 5’del segmento J Hay dos tipos de RSS: un heptamero y un nonámero separado por 12 nd y otro separado por 23 nd. Recombinación solo puede ocurrir entre estos dos tipos. Harry Alices-Villanueva, Ph.D.

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RSS

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RSS

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Diversidad adicional • Enzimas de recombinación introducen nucleótidos adicionales durante la formación de los enlaces entre los segmentos: junctional diversity. – P nucleotides: reacción de recombinación genera secuencias palindrómicas en los extremos del DNA cortado. – N nucleotides: non-template nucleotides introducidos por la enzima terminal deoxynucleotide transferase (TdT). – Contribuyen un factor de 3 x 107 de diversidad adicional. 04/09/09

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Cleavage, Polyadenilation and Splicing

Alternative RNA Splicing Procesamiento de RNA = Mecanismo de regulación 04/09/09

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Receptor de la Célula B • Las interacciones Ag-Ab en el exterior de la célula B se comunican al interior de la célula por acción de dos proteínas transmembranosas Igα y Igβ. • Estas proteínas no varían en secuencia. • Forman y completan el receptor funcional de la célula B. 04/09/09

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Cada célula B produce inmunoglobulinas de una sola especificidad hacia antígeno.

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Exclusión alélica • En una célula B en desarrollo, el proceso de recombiannción somática está regulado y controlado de tal forma que solo una cadena pesada y una cadena liviana se expresan finalmente: exclusión alélica. • Esto asegura que cada célula B produzca inmunoglobulinas de una sola y singular especificidad antigénica. 04/09/09

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Parte III Diversificación de anticuerpos luego que las células B enfrentan antígeno.

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Diversificación de anticuerpos luego que las células B enfrentan antígeno.

• Rearreglo de genes en una célula B inmadura conduce a la expresión de cadenas light y heavy funcionales y a la produción de IgM y IgD enlazadas a la membrana en la célula B ya madura. • Luego de enfrentar antígenos, estos isotipos se secretan (mucho IgM y poca IgD). 04/09/09

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Diversificación de anticuerpos luego que las células B enfrentan antígeno.

• Todas las inmunoglobulinas existen en dos formas: solubles (anticuerpos) y enlazadas a la membrana de la célula B. • La célula plasmática secreta la forma soluble de las inmunoglobulinas.

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Alternative RNA Processing

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Hipermutación somática • Secuencias en las regiones V rearregladas se diversifican más aún por hipermutación somática: – Aleatoriamente se introducen sustituciones de un solo nucleótido a través de la región V de las cadenas livianas y pesadas. – Affinity maturation: anticuerpos de progresivamente mayor afinidad al antígeno inmunizante son producidos. 04/09/09

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Isotype (class) Switching • Produce inmunoglobulinas con diferentes regiones Constantes (C) pero idéntica especificidad al antígeno. • Anticuerpos con diferentes regiones constantes tienen diferentes funciones efectoras.

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Mecanismos para eliminar patógenos. • Neutralización – Inactivan directamente el patógeno o la toxina previniendo que interactuén con la célula humana.

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Mecaninsmos para eliminar patógenos. • Opsonización – Se cubre el patógeno con proteínas del sistema inmune, especialemnte anticuerpos. – Opsoninas son anticuerpos y proteínas de complemento. – Patogenos opsonizados son más facílmente digeridos por fagocitos que tienen receptores a Fc y a ciertas proteínas del complemento.

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Complemento • Un conjunto de proteínas plasmáticas y en superficies celulares (30) que actuán por reacciones en cascadas para atacar formas patógenas extracelulares. • Como resultado de la activación del complemento, los patógenos se cubren de complemento que pueden o matar (destruir) al patógeno directamente o causar su engolfamiento y destrucción por fagocitos. 04/09/09

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IgM • Es el primer anticuerpo en ser secretado en respuesta a un patógeno. • Es hecha principalmente por células plasmáticas residentes en los nódulos linfáticos, bazo, y médula ósea y circula en la sangre y la linfa. • IgM existe como un pentamero proveyendo así multiples sitios para enlazar antígeno eficientemente. 04/09/09

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IgM • Cuándo enlaza antígeno, sitios expuestos en las regiones constantes de IgM inician reacciones con complemento que matan microorganismos directamente para facilitar el ser fagocitados. • Hipermutación somática conduce a la secreción de anticuerpos de mayor afinidad por el antígeno y entonces solo las dos antigen binding sites son eventualmente suficientes para producir un enlace fuerte. • Subsecuente síntesis de IgM conduce a la síntesis de IgG. 04/09/09

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IgG • IgG es el anticuerpo más abundante en los fluídos corporales internos, incluyendo sangre y linfa. • IgG, igual que IgM, se hace principalmente en los nódulos linfáticos, el bazo y la médula ósea y circula en la linfa y la sangre.

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IgG • IgG es más pequeña y flexible que IgM lo que le da acceso más facíl a antígenos en los espacios extracelulares de tejido dañado o infectado. • Durante la preñez, IgG se transmite al feto a través de la placenta.

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IgA • Monomérica: hecha por células plasmáticas en los nódulos linfáticos, bazo y médula ósea. • Dimérica: en los tejidos linfáticos bajo la superficie mucosa y es el anticuerpo secretado al lumen de las cavidades intestinales. 04/09/09

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IgA • Anticuerpo principal en la leche, saliva, sudor y lágrimas. • IgA es el anticuerpo más abundante.

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Biosíntesis de IgM en la superficie de las células B

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IgE • Altamente especializado en la activación de los mastocitos que están presentes en tejidos epiteliales. • IgE se enlaza a receptores en los mastocitos provocando fuertes reacciones inflamatorias en presencia de su antígeno.

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IgE • Se cree envuelta en la expulsión de lombrices y parásitos. • Envuelto en reacciones alérgicas (contra antígenos inofensivos).

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¡Ayyyy Dios Mío….!!!!!!

• Primer examen parcial próximo LUNES 21 DE SEPT. DE 2009. • Capítulos I y II • Repaso: LUNES 14 DE SEPT DE 2009

¡Examen! 04/09/09

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Próximo Tema:

• Reconocimiento de antígeno por los linfocitos T. • ¡Leer..! 04/09/09

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