Biotech_cellmolbiol
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- Words: 1,393
- Pages: 80
Biotecnología: Técnicas en BIOLOGÍA celular & molecular
Técnicas en Biotecnología ◗ ◗ ◗ ◗ ◗ ◗ ◗ ◗
PCR Electrofóresis Transformación Clonación Southern Blot Northern Blot Western Blot Resumen
Polymerase Chain Reaction (PCR)
¿Qué es PCR? ◗
◗
◗
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un método in vitro para amplificar seucencias específicas de DNA. Comenzando con trazas o cantidades minutas de una secuencia de DNA en particular, PCR genera enzimáticamente millones y billones de copias exactas de tal molécula permitiendo así analizar genéticamente ínfimas cantidades de DNA. PCR fué inventada por Kary Mullis, en la corporación Cetus, en 1983.
¿Como se hace un PCR? ◗ ◗ ◗ ◗
Se extrae la molécula de DNA a amplificar. Se coloca la muestra en la máquina de PCR. La máquina eleva la temperatura a cerca de 90oC para que las hebras de DNA se separen. La temperatura baja a cerca de 55oC para permitir que moléculas pre-diseñadas de primer se adhieran al DNA en los sitios especificos.
¿Como se hace un PCR? ◗
◗ ◗ ◗
La temperatura sube a 70oC para permitir que la enzima DNA POLIMERASA extienda los primers sintetizando dos copias del DNA; se completa así un ciclo. Un ciclo duplica la cantidad de DNA previa (función exponencial.) En ciclos sucesivos se siguen amplificando las moléculas de DNA sintetizadas. En una hora se pueden hacer millones de copias del DNA siendo amplificado.
Denaturar DNA
Se aparean los primers Se enlaza la DNA POL
Se extienden los primers
La amplificación procede de modo exponencial
DNA GEL
¿Qué es electrofóresis? Electroforesis es la separación se sustancias lograda al aplicar una corriente eléctrica. ◗ Depende de las diferentes velocidades a las cuales las sustancias se mueven en el campo eléctrico. ◗ En genética se utiliza mayormente para separar fragmentos de DNA, RNA y proteínas. ◗
¿Qué se requiere para hacer una electrofóresis? Un campo eléctrico (un power supply). ◗ Muestras de las sustancias que se quieren separar (ejemplo: DNA, RNA o proteínas.) ◗ Un medio a través del cual se va a mover las sustancias (ejemplo: una gel.) ◗ Un medio para determinar la localización de las diferentes sustancias en el medio (ejemplo: un tinte: ethidium bromide.) ◗
Factores que determinan movilidad ◗
◗
◗
La velocidad a la cual migra la molécula es proporcional a su carga y a la magnitud del campo eléctrico. Las sustancias se separan porque sus moléculas respectivas difieren en su carga y en la resistencia a moverse a través del medio. Para moléculas de una forma similar, la resistencia a moverse es proporcional al area superficial.
Principios de Electroforesis en Gel ◗
DNA es una molécula negativamente cargada debido principalmente a los grupos fosfatos. Si la molécula es colocada en un campo eléctrico migrará desde el polo positivo (catódo) hasta el polo positivo (ánodo).
◗
Una gel, usualmente hecha de agarosa, sirve como la matriz o medio para el movimiento de la molécula de DNA. La gel es un material semisólido con poros de cierto tamaño.
◗
El DNA se corta en fragmentos de diferentes tamaños. Los fragmentos más pequeños se moverán más facílmente a través del medio o gel que los pedazos más grandes. Esto crea un patrón donde los fragmentos quedan acomodados de acuerdo a sus tamaños respectivos ordenados de mayor a menor desde el polo negativo al polo positivo.
¿Como se generan los fragmentos de DNA? ◗
◗
El DNA se corta utilizando enzimas de restricción. • Ejemplos de dos diferentes enzimas de restricción: • Eco RI, Hind III Enzimas de restricción cortan el DNA en secuencias especificas llamadas restriction sites. • Ejemplos para diferente sitios de restricción: • Eco RI corta en G AATT C • C TTAA G • Hind III corta en A AGCT T • T TCGA A
http://www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/flashfiles/GE.swf
Aparatos de Electróforesis
Aparato de Electroforesis
Aparato de Electroforesis con Gel
Foto de Electrofóresis
Electroforesis Vertical
¿Como se hace una foto de su DNA? Cada individuo tiene unas diferencias en las secuencias de pareado de bases en su DNA. ◗ Las enzimas de restricción crean fragmentos de restricción de diferentes tamaños en diferentes individuos. ◗ Estos fragmentos de DNA crearán un patrón de banda al exponerse a un campo eléctrico; este patrón será especifico para cada individuo. ◗
DNA GEL
Electrofóresis de distintas muestras de DNA
Electrofóresis de distintas muestras de DNA
Prueba de Paternidad
Transformación La introducción de una o más moléculas exogenas de DNA en usualmente una célula bacteriana. ◗ Expresión de DNA foraneo en una bacteria. ◗ Se utiliza pra introducir un plásmido portando un fragmento de DNA exogeno en una bacteria o célula de levadura. ◗
Transformación ◗
Organismos utilizados usualmente en experimentos de transformación: • Escherichia coli • Saccharomyces cerevisiae • Vectores virales (fagos)
Transformación ◗
Antes de incorporar el DNA foráneo a una célula, hay que clonar la molécula de DNA en cuestión: • Clonación: purificación y aislamiento de fragmentos individuales de DNA de una molécula más grande o de una mezcla de fragmentos de DNA mediante su incorporación en un vector para formar DNA recombinante que puede ser multiplicado en un huésped bacterial.
Transformación ◗
Vectores sirven para transportar el fragmento de DNA de interes. • Plasmidos: moleculas de DNA circulares autoreplicables. • Bacteriofagos: virus que se replican en bacterias independientemente del genoma. • YAC’s: Yeast Artificial Chromosomes • Viruses eucarióticos como SV40.
Clonación ◗
La muestra purificada de DNA a ser clonada primero se fragmenta con enzimas de restricción: endonucleasas que cortan el DNA en secuencias especificas llamadas palíndromes. • Ejemplo de palíndrome: Madam, I am Adam.
Clonación ◗
◗ ◗
Ambos, el DNA a ser clonado y el vector se cortan con la misma enzima de restricción dejando extremos cohesivos que se pueden unir por medio de una ligasa. La mezcla resultante de recombinantes se utiliza para transformar células bacterianas. Bacterias que reciban el vector se identifican por medio de una reacción producida por algún gen incorparado ya en el vector.
Clonación ◗
Genes utilizados para seleccionar colonias que incorporen el vector: • Genes resistentes a antibióticos como ampecilina, tretraciclina y cloroamfenicol. • Incorporar el fragmento de interes en medio de alguno de estos genes, lo inactiva. • Colonias que crezcan en medio conteniendo el antibiotico especifico, incorporaron el vector con el gen de interes.
• Gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa que produce un color azul. • Colonias azules no incorporaron el gen de interes.
Transformación
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/mol
Luego que tenemos la bacteria transformada, ésta se cultiva y existen varias técnicas para aislar ese DNA y purificarlo.
Southern Blot ◗ ◗
◗
Una técnica desarrollada por Edward Southern en 1975. DNA denaturado es transferido de una gel de agarosa en donde los fragmentos han sido separados por electroforesis a una membrana de nilón o nitrocelulosa colocada sobre la gel. El protocolo original envuelve el colocar toallas de papel sobre la membrana para acelerar el paso de buffer a través de la gel y directo a la membrana por acción capilar.
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Northern Blot Un método de transferir RNA denaturado a una membrana de nitrocelulosa o de nilón para utilizarse subsecuentemente en experimentos de hibridación. ◗ RNA se somete a electroforesis antes de ser transferido a la membrana por acción capilar o por acción de un campo eléctrico ◗
Northern Blot Un probe de DNA o RNA marcado radioactivamente se hbiridiza al RNA enlazado a la membrana para detectar secuencias especificas. ◗ Técnica similar al Southern blot. ◗
Northern Blot
Northern Blot
Northern Blot
Western Blot Un método para detectar una (o más) proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas tal como un extracto celular. ◗ El procedimiento envuelve fraccionar la mezcla de proteínas denaturandolas en una gel de poliacrilamida. ◗
Western Blot ◗ ◗
◗
Se transfiere e inmobiliza la mezcla en una membrana de nilón o neutrocelulosa. Se incuba la membrana con anticuerpos producidos especificamente contra la proteína de interes. El compleo antígeno—anticuerpo que se forma en la membrana puede ser detectado aplicando un segundo anticuerpo creado contra el primer anticuerpo al cual una enzima ha sido covalentemente enlazada.
Western Blot La enzima genera un producto insoluble que se usa para detectar la presencia d ela proteína de interes en la membrana. ◗ Ejemplo: quimoluminiscencia. ◗
Western Blot
Western Blot
Western Blot
Técnicas en Biotecnología ◗ ◗ ◗ ◗ ◗ ◗ ◗ ◗
PCR Electrofóresis Transformación Clonación Southern Blot Northern Blot Western Blot Resumen
Polymerase Chain Reaction (PCR)
¿Qué es PCR? ◗
◗
◗
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un método in vitro para amplificar seucencias específicas de DNA. Comenzando con trazas o cantidades minutas de una secuencia de DNA en particular, PCR genera enzimáticamente millones y billones de copias exactas de tal molécula permitiendo así analizar genéticamente ínfimas cantidades de DNA. PCR fué inventada por Kary Mullis, en la corporación Cetus, en 1983.
¿Como se hace un PCR? ◗ ◗ ◗ ◗
Se extrae la molécula de DNA a amplificar. Se coloca la muestra en la máquina de PCR. La máquina eleva la temperatura a cerca de 90oC para que las hebras de DNA se separen. La temperatura baja a cerca de 55oC para permitir que moléculas pre-diseñadas de primer se adhieran al DNA en los sitios especificos.
¿Como se hace un PCR? ◗
◗ ◗ ◗
La temperatura sube a 70oC para permitir que la enzima DNA POLIMERASA extienda los primers sintetizando dos copias del DNA; se completa así un ciclo. Un ciclo duplica la cantidad de DNA previa (función exponencial.) En ciclos sucesivos se siguen amplificando las moléculas de DNA sintetizadas. En una hora se pueden hacer millones de copias del DNA siendo amplificado.
Denaturar DNA
Se aparean los primers Se enlaza la DNA POL
Se extienden los primers
La amplificación procede de modo exponencial
DNA GEL
¿Qué es electrofóresis? Electroforesis es la separación se sustancias lograda al aplicar una corriente eléctrica. ◗ Depende de las diferentes velocidades a las cuales las sustancias se mueven en el campo eléctrico. ◗ En genética se utiliza mayormente para separar fragmentos de DNA, RNA y proteínas. ◗
¿Qué se requiere para hacer una electrofóresis? Un campo eléctrico (un power supply). ◗ Muestras de las sustancias que se quieren separar (ejemplo: DNA, RNA o proteínas.) ◗ Un medio a través del cual se va a mover las sustancias (ejemplo: una gel.) ◗ Un medio para determinar la localización de las diferentes sustancias en el medio (ejemplo: un tinte: ethidium bromide.) ◗
Factores que determinan movilidad ◗
◗
◗
La velocidad a la cual migra la molécula es proporcional a su carga y a la magnitud del campo eléctrico. Las sustancias se separan porque sus moléculas respectivas difieren en su carga y en la resistencia a moverse a través del medio. Para moléculas de una forma similar, la resistencia a moverse es proporcional al area superficial.
Principios de Electroforesis en Gel ◗
DNA es una molécula negativamente cargada debido principalmente a los grupos fosfatos. Si la molécula es colocada en un campo eléctrico migrará desde el polo positivo (catódo) hasta el polo positivo (ánodo).
◗
Una gel, usualmente hecha de agarosa, sirve como la matriz o medio para el movimiento de la molécula de DNA. La gel es un material semisólido con poros de cierto tamaño.
◗
El DNA se corta en fragmentos de diferentes tamaños. Los fragmentos más pequeños se moverán más facílmente a través del medio o gel que los pedazos más grandes. Esto crea un patrón donde los fragmentos quedan acomodados de acuerdo a sus tamaños respectivos ordenados de mayor a menor desde el polo negativo al polo positivo.
¿Como se generan los fragmentos de DNA? ◗
◗
El DNA se corta utilizando enzimas de restricción. • Ejemplos de dos diferentes enzimas de restricción: • Eco RI, Hind III Enzimas de restricción cortan el DNA en secuencias especificas llamadas restriction sites. • Ejemplos para diferente sitios de restricción: • Eco RI corta en G AATT C • C TTAA G • Hind III corta en A AGCT T • T TCGA A
http://www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/flashfiles/GE.swf
Aparatos de Electróforesis
Aparato de Electroforesis
Aparato de Electroforesis con Gel
Foto de Electrofóresis
Electroforesis Vertical
¿Como se hace una foto de su DNA? Cada individuo tiene unas diferencias en las secuencias de pareado de bases en su DNA. ◗ Las enzimas de restricción crean fragmentos de restricción de diferentes tamaños en diferentes individuos. ◗ Estos fragmentos de DNA crearán un patrón de banda al exponerse a un campo eléctrico; este patrón será especifico para cada individuo. ◗
DNA GEL
Electrofóresis de distintas muestras de DNA
Electrofóresis de distintas muestras de DNA
Prueba de Paternidad
Transformación La introducción de una o más moléculas exogenas de DNA en usualmente una célula bacteriana. ◗ Expresión de DNA foraneo en una bacteria. ◗ Se utiliza pra introducir un plásmido portando un fragmento de DNA exogeno en una bacteria o célula de levadura. ◗
Transformación ◗
Organismos utilizados usualmente en experimentos de transformación: • Escherichia coli • Saccharomyces cerevisiae • Vectores virales (fagos)
Transformación ◗
Antes de incorporar el DNA foráneo a una célula, hay que clonar la molécula de DNA en cuestión: • Clonación: purificación y aislamiento de fragmentos individuales de DNA de una molécula más grande o de una mezcla de fragmentos de DNA mediante su incorporación en un vector para formar DNA recombinante que puede ser multiplicado en un huésped bacterial.
Transformación ◗
Vectores sirven para transportar el fragmento de DNA de interes. • Plasmidos: moleculas de DNA circulares autoreplicables. • Bacteriofagos: virus que se replican en bacterias independientemente del genoma. • YAC’s: Yeast Artificial Chromosomes • Viruses eucarióticos como SV40.
Clonación ◗
La muestra purificada de DNA a ser clonada primero se fragmenta con enzimas de restricción: endonucleasas que cortan el DNA en secuencias especificas llamadas palíndromes. • Ejemplo de palíndrome: Madam, I am Adam.
Clonación ◗
◗ ◗
Ambos, el DNA a ser clonado y el vector se cortan con la misma enzima de restricción dejando extremos cohesivos que se pueden unir por medio de una ligasa. La mezcla resultante de recombinantes se utiliza para transformar células bacterianas. Bacterias que reciban el vector se identifican por medio de una reacción producida por algún gen incorparado ya en el vector.
Clonación ◗
Genes utilizados para seleccionar colonias que incorporen el vector: • Genes resistentes a antibióticos como ampecilina, tretraciclina y cloroamfenicol. • Incorporar el fragmento de interes en medio de alguno de estos genes, lo inactiva. • Colonias que crezcan en medio conteniendo el antibiotico especifico, incorporaron el vector con el gen de interes.
• Gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa que produce un color azul. • Colonias azules no incorporaron el gen de interes.
Transformación
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/mol
Luego que tenemos la bacteria transformada, ésta se cultiva y existen varias técnicas para aislar ese DNA y purificarlo.
Southern Blot ◗ ◗
◗
Una técnica desarrollada por Edward Southern en 1975. DNA denaturado es transferido de una gel de agarosa en donde los fragmentos han sido separados por electroforesis a una membrana de nilón o nitrocelulosa colocada sobre la gel. El protocolo original envuelve el colocar toallas de papel sobre la membrana para acelerar el paso de buffer a través de la gel y directo a la membrana por acción capilar.
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Northern Blot Un método de transferir RNA denaturado a una membrana de nitrocelulosa o de nilón para utilizarse subsecuentemente en experimentos de hibridación. ◗ RNA se somete a electroforesis antes de ser transferido a la membrana por acción capilar o por acción de un campo eléctrico ◗
Northern Blot Un probe de DNA o RNA marcado radioactivamente se hbiridiza al RNA enlazado a la membrana para detectar secuencias especificas. ◗ Técnica similar al Southern blot. ◗
Northern Blot
Northern Blot
Northern Blot
Western Blot Un método para detectar una (o más) proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas tal como un extracto celular. ◗ El procedimiento envuelve fraccionar la mezcla de proteínas denaturandolas en una gel de poliacrilamida. ◗
Western Blot ◗ ◗
◗
Se transfiere e inmobiliza la mezcla en una membrana de nilón o neutrocelulosa. Se incuba la membrana con anticuerpos producidos especificamente contra la proteína de interes. El compleo antígeno—anticuerpo que se forma en la membrana puede ser detectado aplicando un segundo anticuerpo creado contra el primer anticuerpo al cual una enzima ha sido covalentemente enlazada.
Western Blot La enzima genera un producto insoluble que se usa para detectar la presencia d ela proteína de interes en la membrana. ◗ Ejemplo: quimoluminiscencia. ◗
Western Blot
Western Blot
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