Métodos De Esterilización.docx

UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA – UMA FARMACIA Y BIOQUIMICA MICROBIOLOGIA

PRÁCTICA N° 2: PREPARACIÓN DEL MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN - DESARROLLAR TÉCNICAS DE SIEMBRA

DOCENTE: EDWIN ERICK HUALPA CUTIPA, PhD.

INTEGRANTES:    

ALTAMIRANO HUAMAN ADA YESICA CANAZA HUAYRA YESICA NORMA QUIQUINLLA NUÑEZ EDISON MAMANI SERPA JOVANNA ELIZABETH

CICLO: III GRUPO: 2

-B

CURSO: MICROBIOLOGIA

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TITULO: PREPARACIÓN DEL MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN DESARROLLAR TÉCNICAS DE SIEMBRA I.

RESUMEN: Un cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio. El laboratorio de Microbiología es de gran importancia para la aplicación de los procedimientos, técnicas y productos que suprimen o disminuyen la vitalidad de los microorganismos patógenos. No existe un procedimiento de esterilización y desinfección aplicable a todos los casos. El método de esterilización será seleccionado para cada caso teniendo en cuenta la naturaleza física del objeto y la naturaleza biológica del contaminante. El método de esterilización a emplearse debe ser previamente valorado. Actualmente existen valores tabulados de tiempo de exposición, temperatura y concentración de principios activos para los métodos de esterilización más usados que nos permiten elegir el más adecuado para cada caso. En la elección debe tenerse en cuenta también el uso posterior que le será dado (o no) al objeto a esterilizar.1

II.

PALABRAS CLAVES:

Placa Petri, microorganismos, asa de siembra, mechero de bunsen.

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III.

INTRODUCCION Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo, no solamente en el laboratorio, donde son fundamentales para evitar la contaminación de medios, cultivos, placas etc., sino también en otros ámbitos tales como los hospitales, donde fallas en estos procedimientos aumentan la morbimortalidad de los pacientes. Cabe señalar además que esterilización por definición, es el proceso de destrucción o remoción de todas las formas de vida microbiana patógenas o no, tanto en su forma vegetativa como esporulada de un material o un objeto, o sea la destrucción de toda forma de vida microbiana, como bacterias, hongos y virus, tanto en su forma vegetativa como esporulada. Es de suma importancia conocer los diferentes métodos de esterilización, las medidas que se deben tomar para realizarlo. Para evitar contaminarnos o contaminar el ambiente. También tomar en cuenta las temperaturas la presión y tiempo para los diferentes procesos de esterilización a realizar.

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IV.

OBJETIVOS: Conocer los métodos de esterilización y manejo de la autoclave. Conocer los medios de cultivo y métodos de siembra,

V.

MATERIALES Y METODOS 1. METODOS:  Expositivo: El docente nos da a conocer un método para realizar el trabajo  Descriptivo: Conocimos los diferentes materiales que se utilizan para este procedimiento.  Experimental:

Aplicamos

todos

los

conocimientos

brindados por el docente. 2. MATERIALES Papel kraf, placa Petri, mechero bunsen, asa de siembra, alcohol, atomizador, papel toalla.

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VI.

Resultados

Los materiales deben estar libres de contaminantes para esto deben pasar por un proceso de esterilización. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN. A continuación se presenta un esquema de los principales métodos de esterilización, clasificados de acuerdo al tipo de agente que actúa.

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PARA NUESTRO LABORATORIO UTILIZAMOS La AUTOCLAVE que consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituido por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. de presión (15 psi) durante 15 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas vegetativas y esporas. Se lo utiliza para esterilizar todo material resistente a esa temperatura y es muy utilizado para la esterilización de medios de cultivo. Esta esterilización con calor húmedo (vapor de agua) es mucho más rápida y eficaz que el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma irreversible mediante rotura de las uniones H entre los grupos peptídicos a temperaturas relativamente bajas. 3.

CALDO PEPTONADO AGAR LB. NaCl, kriptona, extracto de levadura. Es una gente inerte que contiene nutrientes, se solidifica como gelatina

EL CALDO DE CULTIVO NO SE PUDO REALIZAR DADO QUE EL AUTOCLAVE NO ESTABA OPERATIVO. PERO SI REALIZAMOS EL MODO EN QUE DEBE ENTRAR UNA PLACA PETRI AL AUTOCLAVE DEBE ESTAR ENVUELTA EN PAPEL KRAFT.

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MODO DE ENVOLVER CON EL PAPEL KRAFT LA PALCA PETRI. 1. Se dobla envolviendo

2. Se dobla los lados

2.

3. A manera de cerrar

I.

se coloca una cinta que cambia de color

4. Ambos lados

6. listo para poner en la autoclave

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ASA DE SIEMBRA: El asa bacteriológica o asa de platino es un instrumento de laboratorio que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en un arito de 5 mm o en punta. Se emplea para transportar, arrastrar, trasvasar inóculos (pequeño volumen que contiene microorganismos) desde la solución de trabajo también llamada “solución madre” al medio de cultivo (sólido o líquido) o de un medio a otro. 2 MECHERO: Un mechero o quemador Bunsen es un instrumento utilizado en los laboratorios científicos para calentar, esterilizar o proceder a la combustión de muestras o reactivos químicos PLACA PETRI: es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética. PROCEDIMIENTO:  Tener preparado los materiales de trabajo, asa de siembra, placa Petri con agar (LB), bacteria.  Esterilizar la zona de trabajo con alcohol y limpiar con papel.

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 Encender el mechero bunsen y esperar unos minutos para esterilizar la zona con la llama.  Dejar marcado la bacteria que se va arrastrar con el asa de siembra.  Se introduce el asa de alambre de platino directamente en la zona de color azul de la llama del mechero, hasta que se ponga al rojo vivo.  Seguidamente, proceda a introducir lentamente el resto del alambre para lograr el mismo efecto.  Luego se retira el instrumento de la llama y espere de 4 a 5 segundos con el objetivo de que el asa se enfríe.  Con el asa estéril y fría se toma la bacteria de la muestra que será sembrado y se traslada de inmediato para el medio del cultivo seleccionado  Introduzca el asa con la muestra y proceda a deslizarla suavemente de un lado a otro, desde la pared, hasta cubrir aproximadamente un tercio de toda la superficie. Se repite esterilizando la el asa y rotando la placa. Luego en medio en forma de zig zag  Finalizando se esteriliza el asa de platino a la llama del mechero, en la forma explicada antes de dejarla en el puesto de trabajo para matar las bacterias para que no contamine el ambiente. - Rotular y guardar el cultivo en una temperatura de ambiente.

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VII.

Conclusiones Para realizar un método de siembra siempre se tiene que tener todo el material esterilizado. En este caso al hacer el cultivo se usa el fuego para crear una ambiente esterilización. Las bacterias o microorganismos necesitan de un medio proteico o alimento (AGAR) para seguir desarrollándose.

Al colocar

microorganismos individualmente en la placa crecerán en colonias individuales. Cada réplica del microorganismo es seguramente idéntica genéticamente a su antecesor. Por lo tanto, la placa se puede usar para estimar la concentración de microorganismos en un cultivo o una solución de ese cultivo, usando un contador de colonias. Cada vez que se termina de trabajar con la siembre se guarda en una temperatura ambiente de incubación también, presión, condiciones atmosféricas (concentración de O2). Estos medios de cultivo son sólidos (cultivos en reposo), o líquidos (para cultivos en agitación). Al realizar una siembra de microorganismos, debemos tener en cuenta que técnica se va a utilizar, debido a que estas varían respecto a las características del microorganismo a tratar. También debe tenerse en cuenta la forma, espacio y el objetivo al que se quiere llegar, pues dependiendo de esto la técnica de siembra es diferente. Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Un cultivo de bacterias o de hongos es con el fin de aislarlas en el medio para lograr un mejor estudio de ellos.

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VIII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS Limpieza y Esterilización Microbiología General- Carrera Farmacia Año 2006 http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp3.pdf 2. https://www.academia.edu/9286004/INFORME/CULTIVO_D E_MICROORGA NISMOS 3. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmaci a/catedraMicro/10_M%C3%A9todos_de_esterilizaci%C3%B3 n.pdf 4. http://asignatura.us.es/mbclinica/docs/recursos/12/medios -de-cultivo.pdf

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X. ANEXOS AUTO CLAVE:

MECHERO DE BUNSEN:

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ASA DE SIEMBRA:

ESTERILIZACION DE ASA DE SIEMBRA:

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BACTERIA:

SIEMBRA: 1er día

3er día

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MICROBIOLOGÍA ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO (CURSO 2012-2013)4

Agar BCYE (agar tamponado con extracto de levadura y carbón, “buffered, charcoal, yeast extract”) Medio rico suplementado con L-cistina y pirofosfato férrico que permite el crecimiento y enriquecimiento de especies de Legionella. Cuando se le añade polimixina B, vancomicina y anisomicina es selectivo para Legionella y Nocardia, ya que inhibe bacterias Gram negativas, Gram positivas y levaduras, respectivamente. Agar chocolate. Este medio usa la misma base que el agar sangre. En un principio, los eritrocitos se adicionaban a la base fundida y luego se elevaba la temperatura (alrededor de 85°C) para lisar parcialmente las células, lo que otorgaba al medio el color pardo-chocolate Agar cistina-telurito. Medio utilizado para el aislamiento de Corynebacterium diphtheriae. Sobre la base de agar infusión se agrega 5% de sangre de oveja. La reducción del telurito de potasio por C. diphtheriae produce colonias negras. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos). Es un medio diferencial recomendado para el análisis bacteriológico de orina ya que en él crecen profusamente la gran mayoría de las bacterias, tanto Gram negativas como Gram positivas, que provocan infecciones urinarias, pudiéndose diferenciar o identificar sus respectivas colonias. Debido a su deficiencia en electrolitos (no lleva cloruro sódico), no permite que las colonias de Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento. La lactosa es el único carbohidrato presente. La cistina facilita el crecimiento de los coliformes dependientes de ella. El azul de bromotimol permite distinguir las colonias de bacterias fermentadoras de las que no lo son. Los microorganismos fermentadores de lactosa dan lugar a colonias de color amarillo. Los no fermentadores dan lugar a colonias traslúcidas o de color claro. La alcalinización del medio provoca la aparición de un color azul intenso. Agar CNA (colistina, ácido nalidíxico). Agar base de Columbia adicionado de colistina y ácido nalidíxico que suprimen por completo el crecimiento de enterobacterias y de Pseudomonas, pero permiten el desarrollo de estafilococos, estreptococos, enterococos y levaduras. Ciertos microorganismos Gram negativos como Gardnerella vaginalis y algunas especies de Bacteroides pueden crecer muy bien en este medio. Se puede añadir 5% de sangre desfibrinada que proporciona más nutrientes y la capacidad de detectar reacciones hemolíticas. Agar EMB (eosina, azul de metileno, “eosin-methylen blue”, Agar de Levine). Es un medio diferencial y selectivo para aislar y detectar enterobacterias en muestras mixtas. Los colorantes de anilina (eosina y azul de metileno) inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. También se combinan precipitando a pH ácido, actuando como indicadores de producción de ácidos. El medio incluye lactosa, lo que permite la diferenciación de los fermentadores de lactosa de los no fermentadores. Los fermentadores fuertes de lactosa, sobre todo Escherichia coli, producen colonias de color negro verdoso con brillo metálico. Los productores más débiles de ácidos, forman colonias de color violeta. Los no fermentadores de lactosa forman colonias transparentes. Agar glucosa de Sabouraud. Este medio fue desarrollado para el cultivo de hongos patógenos, especialmente de los productores de micosis superficiales. En la actualidad se recomienda sólo para el aislamiento primario de dermatófitos, con el agregado de cicloheximida y cloranfenicol. El pH final (alrededor de 5,6) es mucho menor que el de la mayoría de los medios y tiende a eliminar el crecimiento bacteriano. Los subcultivos de los hongos aislados originalmente en BHI pueden presentar una morfología más uniforme en agar glucosa de Sabouraud, por esto es útil para la identificación de hongos una vez aislados.

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Agar MacConkey. Es un medio selectivo y diferencial utilizado para la recuperación de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados. Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas Gram negativas exigentes. La lactosa es la única fuente de carbono. El indicador es el rojo neutro. Las bacterias fermentadoras de lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo. Los fermentadores fuertes de lactosa pueden provocar la precipitación de las sales biliares por la gran cantidad de ácidos formados, lo que se observa fácilmente en el medio por la aparición de zonas opacas alrededor de las colonias. Las bacterias que no fermentan la lactosa forman colonias incoloras o transparentes. Agar Martin-Lewis. Modificación del agar Thayer-Martin, consistente en la sustitución de nistatina por anisomicina (que se conserva durante más tiempo y tiene una mayor actividad contra las levaduras) y una mayor concentración de vancomicina. Agar nutritivo. Medio sólido que se prepara añadiendo agar a un caldo nutritivo. Existen diversas clases de agar nutritivo comercializadas: agar infusión de cerebro y corazón (agar BHI), agar triptona de soja (TSA), agar brucela, agar Columbia. Agar salino manitol (SM, MS “mannitol saline”, Medio de Chapman). Es un medio selectivo para estafilococos debido a la alta concentración de cloruro sódico (75 g/L). La mayoría de los microorganismos no crecen a esta concentración de sal, mientras que los estafilococos, entre los que se encuentran los del género Staphylococcus, sí lo hacen. Incorpora manitol como fuente de carbono y rojo fenol como indicador, lo que permite aprovechar la correlación que existe entre la patogenia y la capacidad fermentadora del manitol de los estafilococos para establecer un diagnóstico presuntivo y sirve, por lo tanto, como indicativo de la presencia de Staphylococcus aureus. Los estafilococos patógenos fermentan el manitol y producen colonias amarillas. Los estafilococos no patógenos no lo fermentan y producen colonias de color rosa. Agar sangre (AS ó BA, blood agar). Medio muy rico que permite el crecimiento de todos los microorganismos con importancia clínica excepto el de los más exigentes. Se prepara añadiendo un 5% de sangre desfibrinada (oveja, caballo, conejo, etc.) a un agar base rico (agar Columbia, por ejemplo). Se utiliza también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos, por lo que se considera un medio diferencial. Agar sangre con suplementos para anaerobios. Es un medio rico, sin inhibidores, que permite el desarrollo de gran cantidad de especies anaerobias. Contiene un agar base, como el agar Columbia, adicionado de sangre de oveja, extracto de levadura, hemina y vitamina K. Agar SS (Salmonella-Shigella). Lleva sales biliares, citrato sódico y férrico, tiosulfato y el colorante verde brillante. El carácter diferencial se basa en la fermentación de la lactosa. Incorpora rojo neutro. Las colonias lactosa positivas son de color rojo, mientras que las lactosa negativas son transparentes (Shigella). Las colonias de Salmonella son transparentes con el centro negro. Agar sulfito de bismuto. Medio para el aislamiento de Salmonella typhi. El sulfato ferroso actúa como indicador en la producción de sulfhídrico. El sulfito de bismuto y el verde brillante inhiben considerablemente el crecimiento de bacterias contaminantes. S. typhi produce colonias con centro negro y bordes claros que a las 48 horas adquieren halo negro grisáceo y brillo metálico. Agar TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares). Medio selectivo para especies del género Vibrio debido a las altas concentraciones de tiosulfato sódico, citrato férrico y cloruro sódico que inhiben a la mayoría de las enterobacterias. Por la presencia de sacarosa y el azul de timol y bromotimol como indicadores, permite diferenciar los microorganismos que fermentan este azúcar, como V. cholerae (colonias amarillas), de otros que no lo fermentan, como V. parahaemolyticus (colonias verdes), y, entre éstos, los productores de sulfhídrico (generalmente Proteus).

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Agar Thayer-Martin.Este medio es una modificación del agar chocolate para que sea selectivo para las neiserias patógenas. Estas modificaciones incluyen la adición de colistina (para inhibir otras bacterias Gram negativas), vancomicina (para inhibir bacterias Gram positivas) y nistatina o anisomicina (para inhibir levaduras). El agar Thayer-Martin incorpora nistatina. El agar Thayer-Martin Modificado (MTM) incluye trimetoprim para inhibir a Proteus.

Agar triptona-soja (TSA). Medio rico de uso general para el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Se produce por digestión enzimática de la soja y de la caseína. Con frecuencia se utiliza como agar base para otros tipos de medios, como agar sangre, por ejemplo. En este medio pueden crecer algunos microorganismos exigentes como ciertas especies de Brucella, Corynebacterium, Listeria, Neisseria y Vibrio. Caldo nutritivo. Contiene extracto de carne y cloruro sódico. Puede complementarse con peptonas, extracto de levadura y/o glucosa. Asimismo, puede incorporar un tampón. Caldo para Gram negativos. Se emplea como caldo selectivo para el cultivo de Salmonella y Shigella a partir de muestras de heces e hisopos rectales. Contiene citrato de sodio y desoxicolato sódico (una sal biliar) que destruyen los microorganismos Gram positivos e inhiben la multiplicación temprana de los coliformes. La adición de mayor cantidad de manitol que de glucosa estimula el crecimiento de los patógenos fermentadores de manitol y no es favorable para Proteus. El medio se tampona para mantener el pH neutro aún después de la producción de metabolitos bacterianos ácidos. Para obtener el máximo beneficio de sus propiedades selectivas, el caldo GN debe ser subcultivado después de 6-8 horas tras la inoculación e incubación iniciales, ya que después de este período los coliformes sobrepasan a los patógenos. Caldo tioglicolato. Es el caldo más comúnmente usado en microbiología clínica. Favorece el crecimiento de anaerobios, aerobios, microaerófilos y microorganismos exigentes. Contiene 0,075% de agar para evitar que las corrientes de convección transporten el oxígeno atmosférico a toda la masa del caldo. El ácido tioglicólico también actúa como agente reductor, disminuyendo aún más el potencial de óxidoreducción del medio. Con el agregado de muchos nutrientes como caseína, extractos de levadura y de carne, vitaminas y otros, el medio permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias patógenas.