Cac Phuong Phap đo Quang - Lt.pdf

PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG Mục tiêu : 1. Trình bày được các định luật cơ bản về sự hấp thu ánh sáng . 2. Trình bày được ứng dụng phương pháp đo quang trong các xét nghiệm hóa sinh lâm sàng. ĐINH LUẬT CƠ BẢN VỀ SỰ HẤP THU ÁNH SÁNG : ̣

I.

1. Đinh ̣ luâ ̣t Lambert – beer : Cường độ của một chum tia đơn sáng đơn sắc khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ tỷ lệ nghịch với chiều dày của lớp dung dịch mà nó đi qua : I = Io . 10-kl

(1)

Io : cường độ chùm sáng tới I : cường độ chum sáng ló ra ngoài L : chiều dày của môi trường chất hấp thụ k : hệ số hấp thụ (phu ̣ thuô ̣c vào bản chấ t của chấ t màu và dung môi, bước sóng của chùm tia và nhiê ̣t đô ̣. 2. Định luật Beer : Sự giảm cường độ dòng sáng khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các tiểu phần chất hấp thụ mà ánh sáng đó gặp phải trên đường đi, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ C của dung dịch chất hấp thụ : k = a.C

(2)

a : hằng số hấp thụ C : nồng độ chất hấp thụ 3. Định luật Lambert-beer : Kết hợp 2 phương trình (1) và (2) ta có : I = Io . 10-aCl **Một số đại lượng về sự hấp thu ánh sáng cần biết : a. Độ thấu quang T : (độ truyền quang) (Transmittance) T = I/Io = 10-aCl

b. Độ hấp thụ quang A (ABS : Absorbance) hay mật độ quang OD (Optical Density) : A = OD = lg 1/T = lg 1/10-aCl = lg 10aCl = aCl Trong cùng mô ̣t điề u kiê ̣n , khi k và L không đổ i, mâ ̣t đô ̣ quang tỷ lê ̣ với nồ ng đô ̣ của dung dich ̣ (OD = kLC ). Do đó nế u so sánh nồ ng đô ̣ C chưa biế t của 1 dung dich ̣ với nồ ng đô ̣ mẫu Co, ta có: A = kLC A/Ao = C/Co Ao = kLCo C = A/Ao × Co Nế u biế t đươ ̣c tỷ số giữa mâ ̣t đô ̣ quang của ố ng đo, ố ng mẫu và nồ ng đô ̣ Co của ố ng mẫu, ta sẽ tin ́ h đươ ̣c nồ ng đô ̣ C của ố ng cầ n đo. PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG ĐO QUANG : ̣ Dựa trên cơ sở mâ ̣t đô ̣ quang của dung dich ̣ tỷ lê ̣ với nồ ng đô ̣ của chấ t đó. Đo mâ ̣t đô ̣

II.

quang của các dung dich ̣ bằ ng MÁY ĐO QUANG (photometre hay spectrophotometer ). Đă ̣c điể m chủ yế u của máy là dòng sáng sau khi đi qua dung dich ̣ đươ ̣c chiế u lên tế bào quang điê ̣n để chuyể n thành dòng điê ̣n mà cường đô ̣ của nó đo đươ ̣c nhở 1 điê ̣n kế nha ̣y, đươ ̣c khuế ch đa ̣i rồ i chuyể n sang bô ̣ phâ ̣n ghi nhâ ̣n kế t quả. Trong phép đinh ̣ lươ ̣ng đo quang, thong thường qua các kỹ thuâ ̣t xét nghiê ̣m tương ứng ta chuyể n chấ t cầ n xác đinh ̣ X không có màu thành hơ ̣p chấ t có màu RX bằ ng thuố c thử R thích hơ ̣p. X Chấ t cầ n Xác đinh ̣

+

R

Thuố c thử

RX Sản phẩ m có đô ̣ hấ p thu ̣ ở bước sóng Xác đinh ̣ ( khả kiế ncâ ̣n UV-340nm-UV )

ĐO ĐỘ HẤP THỤ (Do) Đo mâ ̣t đô ̣ quang Do nhờ MÁY ĐO QUANG

-Dung dich ̣ đo quang phải trong suố t. -Xác đinh ̣ nồ ng đô ̣ C chưa biế t của 1 chấ t bằ ng cách làm song song với 1 ố ng chuẩ n có nồ n g đô ̣ Co đã biế t trước : C = A/Ao × Co -Hoă ̣c bằ ng cách lâ ̣p 1 biể u đồ mẫu hoă ̣c dùng hê ̣ số ( factor = Co/Ao )

**Dùng mẫu trắ ng : khi dung dich ̣ đo có chứa các chấ t khác ( như thuố c thử ta ̣o màu) cũng hấ p thu các tia sử du ̣ng. Pha 1 mẫu trắ ng (dd không hay dd blank) giố ng như khi chuẩ n bi ̣dd đo, cũng cho thuố c thử ta ̣o màu vào, chỉ khác là không cho chấ t cầ n xác đinh ̣ vào . Đo D củ add đo đố i chiế u với mẫu trắ ng. CẤU TẠO CỦA MÁY QUANG PHỔ :

III.

Hiện nay , các phòng xét nghiệm hóa sinh thường sử dụng 2 loại máy : quang kế (photometer) và quang phổ kế (spectrophotometer) . Điểm khác biệt chính giữa 2 loại máy này là nguồn sáng , máy quang phổ kế có bộ phận tạo phổ liên tục ( sự dụng lăng kính hoặc cách tử ) nghĩa là tạo các chùm tia đơn sắc có bước sóng (λ) đặc trưng theo ý muốn , trong khi máy quang kế không có bộ phận này mà chỉ có kính lọc màu tạo ra tia sáng đơn sắc có bước song tương ứng với màu của kính lọc. Cấu tạo của 1 máy quang phổ thường có 10 bộ phận như sau :

2

1

3

4

5

6

7

8

9

10

(1) Nguồn sáng : Đèn tungsten (w) cho ánh sáng khả kiến và đèn hydrogen hoặc deuterium (D2) cho phổ phát xạ liên tục trong vùng tử ngoại . (2) Gương phản xạ : có tác dụng hất toàn bộ các tia sáng phát ra từ nguồn sáng về 1 phía. (3) Hê ̣ thố ng thấ u kính hội tụ và phân kỳ : có tác dụng chỉnh cho các tia sáng đi song song với nhau. (4) Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc (monochromator) : có thể là lăng kính (reflectance grating) hoă ̣c cách tử (prism ) – chỉ có ở máy quang phổ kế. (5) Khe sáng : có tác dụng chỉ cho 1 tia sáng đơn sắc đi qua. (6) Kính lo ̣c phu ̣ : có tác dụng lọc các tia tạp khỏi dòng sáng của tia đơn sắc. (7) Cuvet đựng dung dich ̣ chấ t hấ p thu ̣ (8) Bộ phận phát hiện : là tế bào quang điê ̣n (phototube) : có tác dụng tiếp nhận dòng tia đơn sắc sau khi đã bị dung dịch đo hấp thụ 1 phần, tạo nên 1 dòng quang điện. (9) Bô ̣ khuế ch đa ̣i : có tác dụng khuếch đại dòng quang điện.

(10)

Bộ phận hiển thị kết quả : đồ ng hồ đo thể hiện độ hấp thụ quang (ABS) hay độ

truyền qua (T). - Các thông số thu đươc̣ trên bô ̣ chỉ thi ̣: • Tri số ̣ bách phân truyề n : T% = 0 – 100 • Mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c hay Đô ̣ hấ p thu : OD (Abs) = 0.000 – 2.000 IV.

ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG TRONG CÁC XÉT NGHIỆM HÓA SINH LÂM SÀ NG : 1. Phương pháp đo điể m cuố i (end point method) : Đo số lươ ̣ng sản phẩ m ta ̣o thảnh từ thời điể m to bắ t đầ u đế n thời điể m t kế t thúc phản ứng, khi tấ t cả chấ t cầ n xác đinh ̣ (substrate) đã đươ ̣c tiêu thu ̣ hế t. ** Có thể đo và tính kế t quả : - So với chuẩ n. - Nhân với hê ̣ số (factor) ** Kỹ thuâ ̣t thực hiê ̣n : a. PP hóa ho ̣c : dùng các phản ứng hóa ho ̣c đă ̣c hiê ̣u cho các chấ t cầ n xác đinh ̣ . Ví du ̣ : o Creatinin : phản ứng Jaffe, a.picric. o Ure : kỹ thuâ ̣t Bousquet , dùng DAM (diacetyl monoxim) o Protein : phản ứng biuret , dùng sulfat đồ ng / môi trường kiề m. o Cholesterol : phản ứng Liebermann – Burchard. o Glucose : dùng ortho – toluidine , hoă ̣c phản ứng khử Somogyi – Nelson … b. PP enzyme : dùng enzym là thuố c thử tác du ̣ng đă ̣ hiê ̣u , chuyên biê ̣t trên cơ chấ t xác đinh, ̣ cho kế t quả đúng, xác thực hơn phương pháp cổ điể n,hóa ho ̣c, tiế n hành nhanh , vi đinh ̣ lươ ̣ng nên hiê ̣n nay đươ ̣c áp du ̣ng rấ t phổ biế n. Ví du ̣ : dùng glucose oxidase cho glucose Urease cho ure Cholesterol oxidase cho cholesterol Uricase cho acid uric… 2. Phương pháp đo đô ̣ng ho ̣c (kinetic method) Theo dõi đô ̣ng ho ̣c, mô ̣t cách lien tu ̣c quá trình diễn tiế n của phản ứng, qua các thời điể m to, t1, t2 , t3 … … trong khoảng tuyế n tin ́ h của phản ứng. **Kỹ thuâ ̣t thực hiê ̣n đô ̣ng ho ̣c Enzym:

Đo vâ ̣n tố c ta ̣o thành sản phẩ m từ thời điể m to, t1, t2, t3… …Hoa ̣t tiń h enzyme đươ ̣c tính bằ ng cách nhân trung bình của các ∆Do/min với hê ̣ số riêng của phản ứng (F), ra kế t quả là số đơn vi ̣U/L Kỹ thuâ ̣t này đươ ̣c áp du ̣ng để xác đinh ̣ hoa ̣t tính của các thông số enzyme như GOT, GPT, CPK, ALP, amylase, … …) **Lưu ý : tri ̣số đố i chiế u (giá tri ̣bình thường) của các thông số có tùy thuô ̣c vào loa ̣i kỹ thuâ ̣t xét nghiê ̣m, điề u kiê ̣n tiế n hành, nhiê ̣t đô ̣, … … ngoài ra các biế n thiên sinh lý cũng có gây ảnh hưởng lên kế t quả xét nghiê ̣m. Khi nhâ ̣n đinh ̣ kế t quả nên lưu ý đế n các yế u tố trên.