Metode Lactobacillus Acidophilus.docx

Medium MRS adalah suatu medium pertumbuhan yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri Lactobacillus. Media MRS dikembangkan oleh J. C. de Man, M. Rogosa, dan M. Elisabeth Sharpe untuk menggantikan medium yang menggunakan sari tomat dan sari buah tomat

ekstrak

daging.

Pada

umumnya,

medium

ini

sangat

baik

untuk

pertumbuhan Lactobacililus, bahkan beberapa bakteri yang tidak dapat hidup dengan baik pada beberapa media lainnya seperti, L. brevis dan L. fermenti. Media MRS mengandung polisorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui sebagai faktor penumbuh Lactobacililus seperti substrat yang kaya akan nutrisi dasar.. Komposisi media MRS agar terdiri dari 10 g pepton, 5 g ekstrak daging sapi, 5 g ekstrak yeast, 2 g K2HPO4, 2 g diamonium, 2 g hidrogen sitrat, 20 g glukosa, 5 g sodium asetat.3H2O, 0,1 g MgSO4.7H2O, 0,05 g MnSO4.4H2O, 12 g agar, 1000 ml aquades dengan pH 6,5±0,2 pada suhu 37°C (De Man et al., 1960). Metode Identtifikasi : 1. Identifikasi Lactobacillus acidophilus Koloni yang terisolasi dan terbentuk pada MRS agar-agar dapat diidentifikasi menggunakan pewarnaan gram, tes biokimia, pemindaian dengan mikroskop electron dan system otomatis untuk identifikasi bakteri secara cepat (BioLog identifikasi sistem). Identifikasi dilakukan berdasarkan pada manual Bergey dari penentuan bakteriologi. Kultur disimpan di MRS agar miring dan disimpan pada 4 °C. Untuk penyimpanan jangka panjang, satu loop bakteri dicampur dalam Microbank (botol steril yang mengandung manikmanik berpori disimpan di gliserol sebagai cryopresertative dan berfungsi sebagai pembawa untuk mendukung mikroorganisme) dan disimpan pada 20°C. 2. Tes Pewarnaan Gram Menurut Collins dan rekan-rekan tekniknya, bakteri terisolasi diperiksa menggunakan kotak pewarnaan gram lalu diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 x. 3. Uji Motilitas Dua metode yang dilakukan yaitu metode tetes gantung basah dan teknik Carigie. Kaca mikroskop diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 x untuk memeriksa motilitas bakteri. Pada metode lain di teknik Carigie, bakteri diinokulasi ke dalam pusat tabung yang memiliki media motilitas menggunakan metode menusuk. Media diinkubasi pada dua suhu berbeda yaitu, 25°C dan 37°C selama 48 jam. Motilitas dari bakteri

tersebut disimpulkan dengan cara mengamati pertumbuhan yang menyebar pada semisolid agar yang diinkubasi. 4. Uji Katalase Untuk melakukan uji ini, sebuah koloni tunggal yang terisolasi dicoret pada kaca mikroskop dan satu tetes hidrogen peroksida 3% ditambahkan di atas itu. Buih oksigen menunjukkan bakteri positif menanggapi uji katalase tersebut. 5. Tes Karbohidrat Fermentasi Media dasar kaldu fenol merah digunakan sebagai media untuk tes ini. Substrat gula berbeda yang digunakan, yaitu arabinose, sukrosa, maltose, laktosa, sorbitol dan glukosa. 0,1 g (0,1% w/v) dari setiap substrat gula ditambahkan pada 100 mL media. 5 mL dari setiap campuran dipindahkan ke setiap tabung. Untuk mendeteksi gas, tabung Durham dimasukkan ke dalam uji tabung yang mengandung glukosa. Semua tabung disterilkan selama 15 menit pasa 121°C. Tabung yang diinokulasi dengan koloni tunggal dari bakteri ditelusuri. Reaksi positif bakteri ditandai dengan perubahan warna pada media. 6. Mikroskop Elektron Scanning Mikroskop

elektron

scanning

(SEM)

digunakan

untuk

mengamati

dan

mengidentifikasi bentuk bakteri pada sebuah studi. Dalam metode ini, suspensi bekteri disentrifugasi pada 5000 rpm untuk 15 min. Supernatant bekteri dibuang dan bakteri sel tetap Mc Dowell-Trump fiksatif reagen pH 7,2. Sel sel bakteri yang dicuci dengan 0,1 m buffer fosfat dan kembali disentrifugasi pada 5000 rpm dalam waktu 10 menit. Pellet yang telah di hasilkan dimasukkan pada larutan buffer fosfat. Pellet digunakan untuk satu jam di tetroxide osmium 1,0 % disiapkan pada buffer fosfat. Sampel dicuci dua kali dengan air dengan waktu 10 menit pada etanol , pada konsentrasi 50%, 75%, 95%, dan 99,5 %. Setelah itu, 1 ml hexamethyldisilazane ditambahkan dalam tabung sampel dalam waku 10 menit Hexamethyldisilazane dituang dari tabung dan sel-sel yang kering pada suhu kamar. Spesimen sampel berlapis emas dan dilihat dibawah SEM (Leo Supra 50 VP dilengkapi dengan Oxford INCA 400 energi sinar-xx dispersif mikro sistem) 7. Sistem Biolog Cepat Otomatis Biolog mikro piring dan data base pertama kali diperkenalkan pada tahun 1989. Biologi ilmuwan mengembangkan pemanfaatan sumber karbon dan meletakannya pada alat

tes piring TM. Mikro Biolog anaerobik mikro piring dirancang untuk mengidentifikasi sejumlah bakteri anaerobik. Prosedur berikut ini digunakan untul mengidentifikasi bakteri terisolasi. Bakteri terisolasi yang berkultur pada pelat MRS suhu 37 untuk h 48- 72. Koloni sel tunggal dari MRS agar adalah disubkultur dalam BHI media untuk h 36-48. Kultur bakteri yang digunakan dalam cairan biolog enaerobik ,kekeruhan suspensi diamati dan diukur dengan menggunakan biolog turbidity meter hingga mencapai 65 %. 100 μL suspensi ditunagkan dalam setiap lubang –ubang 99 Biolog Mikro PlateTM diinkubasi untuk 24 jam pada suhu 37 ° c dalam jar aerobik yang anya mengandung CO2. Piring dimasukkan ke dalam sistem otomatis Biolog dan identifikasi pada proses ini dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Biolog Metode Karakteristik Lactobacillus acidophilus 1. Pertumbuhan Pada pH Berbeda Untuk mengetahui pH optimum atau kemampuan pertumbuhan dari bakteri Lactobacillus acidophilus dibuat sebuah koloni terisolasi tunggal dalam kaldu MRS yang disesuaikan dengan pH berbeda

menggunakan NaOH (1,0 M) atau HCl (1,0 M) lalu

diinkubasi pada 37  C selama 24 jam. 2. Toleransi Garam Empedu Untuk mengetahui kemampuan ketahanan bakteri Lactobacillus acidophilus dalam mentolelir garam empedu dapat diuji coba melalui metode yang dijelaskan oleh Gilliland dan Walker. Lactobacillus acidophilus diuji dalam medium kaldu MRS dengan dan tanpa penambahan gatam empedu (Sigma, jerman). Kaldu MRS disiapkan dengan konsentrasi berbeda pada 0, 0.1, 0.3, 0.5, dan 1.0% w/v dan dibagikan dalam 10 ml tabung rekasi bolume dan disterilkan pada 121  C selama 15 menit. Tiga tabung dari masing-masing konsentrasi diinokulasi dengan 0,1 ml koloni Lactobacillus acidophilus dan diinkubasi pada 37  C selama 48 – 72 jam.

Total jumlah yang layak dari L. acidophilus diperoleh untuk semua konsentrasi. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase pertumbuhan di tidaknya garam empedu. Toleransi empedu (%) Dihitung menggunakan persamaan di bawah ini:

Toleransi empedu (%) =

𝑇𝑖𝑑𝑎𝑘 𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑙𝑎𝑦𝑎𝑘 𝑑𝑒𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑔𝑎𝑟𝑎𝑚 𝑒𝑚𝑝𝑒𝑑𝑢 𝑇𝑖𝑑𝑎𝑘 𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑙𝑎𝑦𝑎𝑘 𝑡𝑎𝑛𝑝𝑎 𝑔𝑎𝑟𝑎𝑚 𝑒𝑚𝑝𝑒𝑑𝑢

x 100%

(Pyar dan PEH, 2014).

Daftar Pustaka Collins, C. H., et al. 2004. Collins and Lyne's Microbiological Methods 8th Edition. London: Butterworth-Heinemann. De Man, J. C., et al. 1960. A Medium for The Cultivation of Lactobacilli. England: The British Library. Gilliland, S. dan Walker, D. 1990. Factors to Consider When Selecting A Culture of Lactobacillus Acidophilus as a Dietary Adjunct To Produce a Hypocholesterolemic Effect In Humans. J. Dairy Sci, 73: 905- 911. Pyar, H. and PEH, K. K. 2014. Characterization and Identification of Lactobacillus acidophilus Using Biolog Rapid Identification System. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol. 6, Issue 1: 189-193.