Linfomi Lezione Dr

I Linfomi

Dott. Renato Franco SC di Anatomia Patologica Direttore prof. Gerardo Botti Istituto dei Tumori Fondazione G. Pascale, Napoli

• 1mm<>2cm • linfonodi cervicali, ascellari, inguinali frequentemente palpabili nel bambino.

più

preauricolari, epitrocleari, sopraclaveari, poplitei, addominali, mediastinici

• linfonodi

aumentati di volume sempre patologici. • Stazioni linfonodali: Testa-collo: Preauricolari Retronucali Sottomandibolari Laterocervicali Torace: Sovraclaveare Ascellari Mediastinici Addome:

Arti:

Addomio-pelvici Iliaci Inguinali Epitrocleari Poplitei

Linfonodo Struttura 9 9 9 9

Organizzati in gruppi C. linfoidi C. immunologicamente attive C. stromali

9 Foto?

9 Foto?

Linfonodo Parenchima: Corticale 9

Popolato da linfociti B entrati nel LND attraverso le VEA

9

Follicoli primari

9

Follicoli secondari con centro germinativo

9

Il contatto con cellule vergini adeguate induce alla proliferazione del linfocita nel centro germinativo, da cui cellule attivate e cellule della memoria.

9

I linfociti non adeguati lasciano il linfonodo verso il circolo ematico

9

Cellule accessorie: 9 9 9 9

Macrofagi sinusali Tingible bodies Macrofagi della zona marginale Cellule dendritiche nei CG

9 Foto?

Linfonodo Parenchima: Paracorticale Popolato da linfociti T entrati nel LND attraverso le VEA Attivati proliferano determinando espansione della paracorticale Cellule accessorie: cellule interdigitate, tipo di APC

9 Foto?

Linfonodo Sinusoidi linfonodali 9 Seno sottocorticale 9 Seno corticale, difficile da visualizzare 9 Seno midollare

9 Foto?

Linfonodo Parenchima: Midollare Vasi ematici di grandi dimensione Cordoni midollari ricchi di cellule (plasmacellule e macrofagi) Ampi seni midollari

9 Foto?

Homing „

„

Dopo la maturazione iniziale negli organo immunitari, cellule B e T vergini, --> sangue periferico--> LND e altri organi secondari Le sedi B dipendenti includono: „ Follicoli primari e secondari „ Presentazione antigenica „ Proliferazione e differenziazione „ Cordon midollari Rilascio di Ig da parte delle plasmacellule

„

„

Sedi T dipendenti sono le paracorticli La separazione da cellule B e T non è assoluta

MECCANISMI PATOGENETICI DELLA LINFOADENOMEGALIA

INTRINSECO

ESTRINSECO

Proliferazione dei linfociti o degli istiociti normalmente presenti nel linfonodo

Infiltrazione di cellule estrinseche nel linfonodo

MECCANISMO PATOGENETICO INTRINSECO DELLA LINFOADENOMEGALIA •Proliferazione dei linfociti e/o istiociti •ingorgo linfatico per aumentato flusso afferente e rallentamento del tempo di transito dei linfociti •attivazione e proliferazione antigene-dipendente dei linfociti: espansione aree B e T cellulari •iperplasia ed alterazione delle cellule istiocitarie

MECCANISMO PATOGENETICO ESTRINSECO DELLA LINFOADENOMEGALIA

•polimorfonucleati in corso di linfoadeniti batteriche •cellule leucemiche o di tumori solidi metastatizzati.

LINFOADENOMEGALIE Classificazione eziologica Reattive

Neoplastiche

-

infettive autoimmunitarie metaboliche tossico-medicamentose aspecifiche

LINFOADENOMEGALIE inquadramento eziologico Infettive

Cause virali

• • • • • • • • • •

mononucleosi infettiva (EBV) CMV adenovirus coxsachie HHV-6 morbillo rosolia varicella infezioni vie respiratorie AIDS

LINFOADENOMEGALIE inquadramento eziologico Infettive

• Staphilococcus aureus • Streptococco b-emolitico gr.A • Haemophilus influenzae tipo B • Micobatteri T e NT • Bartonella henselae (M. graffio di gatto) Cause batteriche • Corynebacterium diphtherie (difterite) • Brucella melitensis • Treponema pallidum (lue secondaria) • Leptospira interrogans (leptospirosi) • Francisella tularensis (tularemia)

LINFOADENOMEGALIE inquadramento eziologico Infettive Cause micotiche

Cause parassitarie

• Histoplasma capsulatum • Candida albicans • Sporothrix schenckii • • • •

Toxoplasma gondii Leishmania Plasmodi malarici Trypanosoma brucei

Iperplasia linfoide zone T e B dipendenti: toxoplasmosi mononucleosi infettiva linfoadeniti dermatopatiche Iperplasia follicolare e plasmocitosi (cellule B): iperplasia follicolare artrite reumatoide linfoadenite luetica AIDS stadio precoce Iperplasia paracorticale (cellule T): adeniti virali adeniti postvacciniche adeniti iatrogene (idantoina)

Iperplasia corticale MZ

LZ

DZ

Espansione della paracorticale

LINFOADENOMEGALIE inquadramento eziologico Neoplastiche •M. di Hodgkin •Linfoma non Hodgkin •Leucemie acute •Metastasi da tumori solidi

Linfoma di Hodgkin „

„

„

Meno comune di NHL ~ 10,000 casi per anno Età di incidenza bimodale, con primo picco nella tarda adolescenza e secondo picco intorno ai 60 anni Diversamente dai NHL la componente neoplastica è minima. La diagnosi si basa sulla presenza della cellula di Hodgkin e delle sue varianti

Classificazione dei linfomi di Hodgkin Rye Classification Lymphocyte predominant-5%

REAL/WHO Classification Lymphocyte predominance, nodular

Nodular sclerosis-70% Mixed cellularity-20% Lymphocyte depleted-5%

Classical HL Lymphocyte rich classical HL Nodular sclerosis Mixed cellularity Lymphocyte depletion Unclassifiable classical HL

Linfoma di Hodgkin sottotipo istologico „

Sclerosi nodulare „ L’istotipo più comune „ Mediastino, collo „ Capsula fibrotica con bande sepimentanti la neoplasia „ Varainte lacunare della cellula di Reed Sternberg

„

„

Cellularità mista „ Malattia più avanzata „ Pazienti anziani „ Più cellule R-S, eosinofili, plasmacellule „ Varianti mononucleari di cellule di R-S Deplezione linfocitaria „ Retroperitoneo, pazieti anziani „ Perdita di linfociti „ Più aggressiva

„

Predominanza linfocitaria „ Generalmente malattia limitata (collo di giovani adulti) „ Cellule L&H o cellula “popcorn”

Studi ancillari

Pattern di diffusione „

Il linfoma di Hodgkin si diffonde per continuità

Prognosi Tasso di cura oltre 80%

Patobiologia „ „ „

Eziologia ancora ignota Cellula B alterata 30% EBV è riscontrato nella cellula RS

Linfoma di Hodgkin: un problema biologico

Microarrays tissutali: analisi di una popolazione eterogenea (Hodgkin’s)

High-throughput tissue microarray analysis of G1-cyclin alterations in classical Hodgkin's lymphoma indicates overexpression of cyclin E1. Tzankov A, Zimpfer A, Lugli A, Krugmann J, Went P, Schraml P, Maurer R, Ascani S, Pileri S, Geley S, Dirnhofer S. J Pathol. 2003 Feb;199(2):201-7.

Reed Sternberg cells

Linfomi Non Hodgkin „

„

Neoplasie linfoidi che interessano primariamente le sedi dell’ “homing” linfoide normale „ LND „ MILZA „ M.A.L.T. 40.000 casi/anno, 20000 morti/anno

Aspetti clinici „ „ „

„

Massa senza dolore Compressione ed infiltrazione di organi vicini Interferenza con le funzioni normali, nel caso di infiltrazione di altri organi Sintomi sitemici „ „ „

„

Febbre Sudorazione notturna Perdita di pero

Quadro leucemico se c’è infiltrazione midollare

Precedenti classificazioni

„

Rapaport „ Kiel „ WF

R.E.A.L./W.H.O. Classification „

„

REAL/WHO è una classificazione clinicopatologica complessa

Cell lineage: B v T v NK v Histiocytic „

„

„

Stadio di maturazione della presunta controparte normale. Include caratteristiche immunologiche e molecolari e non solo morfologiche Include anche leucemie linfoidi

LINFOMI B

LINFOMI T

•Leucemia/linfoma da precursori Blinfocitari Leucemia linfatica cronica a cellule B/linfoma a piccoli linfociti Leucemia prolinfocitica B Linfoma linfoplasmocitoide Linfoma a cellule mantellari Linfoma centrofollicolare: a piccole cellule, a grandi cellule, diffuso a piccole cellule Linfoma B della zona marginale: extranodale (MALT), a cellule monocitoidi, splenico (con o senza linfociti villosi) Leucemia a cellule capellute Mieloma multiplo Linfoma B diffuso a grandi cellule Linfoma B a grandi cellule primitivo del mediastino Linfoma di Burkitt Linfoma B ad alto grado simil-Burkitt

Leucemia/linfoma da precursori Tlinfocitari Leucemia linfatica cronica a cellule T Leucemia prolinfocitica T Leucemia a grandi linfociti granulari: a linfociti T, o tipo NK Micosi fungoide/sindrome di Sezary Linfomi periferici a cellule T: cellule medie, misto (medie e grandi), grandi; cellule linfoepiteliodi; linfoma T associato a panniculite sottocutanea Linfoma epatosplenico a linfociti T g/d Linfoma T angioimmunoblastico Linfoma angiocentrico Linfoma T intestinale (associato o meno a enteropatia) Leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto Linfoma anaplastico Ki+ a grandi cellule: a cellule T, null, tipo “non Hodgkin

WHO 2000.

Origine delle malattie linfoproliferative: la visione morfologica

REAL/WHO classificationossatura „

Neoplasie B cellulari „

„

„

Neoplasie T/NK cellulari „ „

„

Precursori B cellulari- correlati a leucemie acute Linfomi B cellulari periferici- la maggior parte dei linfomi Precursori T cellulari Linfomi T/NK periferici

Linfoma di Hodgkin

Frequenza

NHL „

„

„

„

Composti da cellule che hanno perso la capacità di completare il progetto di differenziazione. Ricapitolano la biologia e l’immunofenotipo della cellula normale da cui deriva Ai diversi aspetti citologici ed immunofenotipidi riconoscibili nei diversi stadi di maturazione della maturazione della normale cellula linfoide corrispondono diversi tipi di linfoma Due prinicipali tipi clinici „ Linfomi Indolenti „ Linfomi Aggressivi

Linfomi Indolenti „ „

„ „ „ „ „

Caratterizzati da processi di apoptosi difettivi Deriavanti da stadi di maturazione cellulare, caratterizzati da lenta crescita Spesso già diffusi alla diagnosi Storia naturale lunga, sopravvivenza mediana >5 anni Rispondono generalmente a chemio e radio-terapia Generalemte ricadono, ma rispondono ad altre terapie Allo stato sono considerati incurabili, tranne che in caso di „ Malattia localizzata „ Trapianto di midollo

Linfomi Aggressivi „

„

„ „ „

„ „

Caratterizzati da processi difettivi di controllo del ciclo cellulare Derivanti da stadi d maturazione cellulare, caratterizzati da rapido accrescimento cellulare Più spesso localizzati Più spesso extranodali Breve storia naturale; sopravvienza mediana
„

Indolenti „ „

„ „

„

„ „

„ „ „ „

SLL/CLL Linfoma follicolare, Gradi 1/2 Linfoma MALT-type Linfoma nodale della zona marginale Linfoma splenico della zona marginale Hairy cell leukemia Linfoma Linfoplasmacitico Mieloma Plasmacitoma Linfoma cutaneo T Linfoma cutaneo CD30+

„

Aggressivi „

„

„ „ „

„

Leucemia B prolinfocitica Linfoma diffuso a grandi cellule B Linfoma di Burkitt Linfoma mantellare Linfoma anaplastico t/null Linfomi T periferici

Stadiazione „ „ „ „

Definisce l’estensione, determinando la scelta terapeutica Esame clinico, esami strumentali e biopsia midollare Sistema di staging di Ann Arbor Sintomi B - febbre, perdita di peso > 10% , sudorazone notturna

Staging table

Prognosi „

International prognostic index

International Prognostic Index 1

Survival curves

Neoplasie dei precursori B cellulari „

Linfoma/leucemia dei Precursori B cellulari „ Deriva da celule allo stadio linfoblastico di differenziazione, antigene- independente della cellula B (normalmente midollare) „ Leucemia con o senza coinvolgimento linfonodale „ Trattate come leucemie acute „ 80% il tasso di cura tra I bambini „ 20-30% il tasso di cura tra gli adulti, per la presenza di alterazioni citogentiche correlate con maggiore aggressività (es. Cromosoma Philadelfia)

Linfomi B periferici [Derivano dai diversi stadi di maturazione e differenziazione antigene- dependente della cellula B

Neoplasie Periferiche B-cellulari „ „

„ „

„ „ „ „ „ „ „ „ „

SLL/CLL- cellula B vergine Leucemia prolinfocitica- una variante clinica più aggressiva della precedente Linfoma linfoplasmacitico- cellula della risposta immune primaria Linfoma della zona mantellare- cellule della zona mantellare intorno ai follicoli Linfoma foliclare-cellule del follicolo Linfoma della zona marginale extranodale- cellule del MALT Linfoma della zona mantellare nodale- zona mantellare nel linfonodo Linfoma della zona mantellare nodale- zona mantellare nella milza Leucemia a cellule capellute- cellula pre-plasmacellulal Linfoma diffuso a grandi cellule-cellule post-germinalei Linfoma di Burkitt Mieloma- plasmacellule midollari Plasmacitoma- plasmacellule extramidollari

Linfoma Follicolare „

Clinica „ Tra I più frequenti linfomi „ >40 anni (età mediana 59 anni) „ Generalmente diffuso alla diagnosi „ Risponde alla terapia „ Ricade frequentemente „ OAS a 5 anni=72% „ Possibile trasformazione in tipi più aggressivi (DLBCL) „ G3 ha una prognosi sovrapponibile a quella dei DLBCL

„

Patogenesi: „ t(14;18)(q32, q21) „ Overespressione della proteina antiapoptotica anti-apoptotic protein Bcl2

Linfoma follicolare „

Diagnosi „ Pattern follicolare „ Piccole e grandi cellule, clivate e non „ Positive:Monoclonal light chain, CD19, CD10, bcl6, Bcl2 „ Negativi: CD5, Cyclin D1/Bcl1 „

PCR e FISH per t(14;18)

Table X: Indolent B cell lymphomas

Frequency (% all lymphomas Age of onset median Stage at Presentation Response to Therapy

5 yr survival Predominant site presentation Pattern of nodal Infiltration Benign cell Equivalent

Dominant cell type

Immunopheno -type

Molecular Pathogenesis

Follicular Lymphoma (Grade I) 22%

Marginal zone Lymphoma

Small lymphocytic lymphoma/CLL

8

7

59

61

65

Stage III/IV Disseminated Good to most treatments, but incurable short of transplant 72%

Stage I

Stage IV

Frequently curable

Similar to Follicular lymphoma

74%

51%

Nodal

Extranodal

Marrow/nodal

Follicular

Diffuse

Diffuse

Germinal center small cleaved cell Small cleaved cell in most cases, but can be large cell Positive: CD19 CD10, Bcl2+ Negative: CD5-

Marginal zone Lymphocyte

Virgin B cell

Mix of small lymphocytes, plasma cells

t(14;18) Bcl2/JH

t(11;18), Trisomy 3

Small lymphocytes with round nucleus Positive: CD19, CD5 CD23 Negative: CD10 Trisomy 12

Positive: CD19, Bcl2 Negative: CD10, CD5

Linfoma Diffuso a grandi cellule B „

„

Clinica „ 30% NHL „ Età mediana 64 anni „ Frequentemente localizzata „ Rapida crescita della massa neoplastica „ 40% curabile con terapie aggressive/ trapianto delle cellule staminali Patogenesi „ Diverse anomalie citogenetiche, ma nessuna specifica

Diffuse Large B cell lymphoma

„

Diagnosi „ Patern diffuso „ Grandi cellule, con nucleo ovale o inciso, cromatina dispersa e 1-3 nucleoli „ Immunofenotipo dlela cellula B

Linfoma di Burkitt „

Clinica „ 3% dei linfomi „ Età mediana 31 anni „ Identificato in Africa da Thomas Burkitt „ Associato a EBV „ Localizzazione alla mmandibola „ N paesi occidentali si presenta nella regione ileocecal „

~70-80% dei bambini sono curabili così come il 40% degli adulti

„

Patogenesi: „ t(8;14), con overespressione dell’oncogene myc, un regolatore del ciclo cellulare

Origine delle malattie linfoproliferative: il correlato molecolare

Biologia Molecolare. Il profilo di espressione genica identifica sottotipi prognostici di linfoma diffuso a grandi cellule

Nature 403, 503 - 511 (03 February 2000); doi:10.1038/35000501

Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling ASH A. ALIZADEH*†, MICHAEL B. EISEN†‡, R. ERIC DAVIS CHI MA , IZIDORE S. LOSSOS¶, ANDREAS ROSENWALD, JENNIFER C. BOLDRICK*, HAJEER SABET, TRUC TRAN, XIN YU , JOHN I. POWELL#, LIMING YANG#, GERALD E. MARTI§, TROY MOORE , JAMES HUDSON JR , LISHENG LU**, DAVID B. LEWIS**, ROBERT TIBSHIRANI††, GAVIN SHERLOCK‡, WING C. CHAN, TIMOTHY C. GREINER , ENNIS D. WEISENBURGER , JAMES O. ARMITAGE‡‡, ROGER WARNKE¶¶, RONALD LEVY, WYNDHAM WILSON, MICHAEL R. GREVER, JOHN C. BYRD, DAVID BOTSTEIN‡, PATRICK O. BROWN*,18 & LOUIS M. STAUDT

Linfoma di Burkitt „

Diagnosi „ L’equivalente benigno è la piccola cellula non clivata replicante del centro germinale „ Pattern diffuso „ Alto indice mitotico; „ Enorme numero di macrofagi (aspetto a cielo stellato) „ Citologia: nucleo rotondeggiante „ Immunophenotype: „ Positive: CD20, CD10 „ Negative: CD5

Linfoma mantellare „

„

Clinica „ 6% dei linfomi „ Età mediana 63 anni „ Generalmente disseminato alla diagnosi „ Scarsa risposta alla terpia „ OAS 27% a 5 anni Patogenesi „ t(11;14) „ overespressione di ciclina d1, regolatore del ciclo cellulare

Linfoma della zona mantellare „

Diagnosi „ Controparte benigna zona mantellare „ Cellula rotondeggiante „ Pattern diffuso „ Immunofenotipope: „ Positivi: CD20, CD5, Ciclina d1and Bcl2 „ Negativi CD10, CD23

Una selezione di 20 geni costituisce una “Proliferation Signature” di valore prognostico nei linfomi mantellari

The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphoma A. Rosenwald, et. al. CANCER CELL : 2003. 3:185-197

Linfoma dei precursori T cellulari „

Clinica „ adolescenti „ Si presenta come una leucemia o con massa mediastinica +/- coinvolgimento midollare „ curabile: ~70%

Linfoma dei precursori T cellulari „

diagnosi „

„ „

„

Controparte benigna cellule T vergini del timo Pattern diffuso Citologia blastica con nucleo ovalare Markers T

Linfomi T „

„

Prevalentemente leucemici/disseminati „ Leucemia dei prolinfociti T „ Leucemia a grandi cellule granulari „ Leucemia a cellule NK „ Leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto Prevalentemente nodali „ Linfoma T angioimmunoblastico „ Linfoma T periferico, non specificato „ Linfoma T/Null anaplastico

„

Prevalentemente extranodale „ Micosi fungoide „ Sindrome di Sezary „ Linfoma cutaneo CD30+ „ Linfoma T panniculitico „ Linfoma NK/T, nasale e nasal-type „ Linfoma intestinale T „ Linfoma T epatosplenico

Aspetti chiave dei linfomi T

„

„

Clinica „ 20% di tutti I linfomi „ Spesso extranodali „ La maggior parte a scarsa prognosi Patogenesi: „ Anaplastic large cell lymphoma- t(2;5): gene ALK1 „ Linfom T epatosplenico Isocromosoma 7

„

Diagnosi „ Anaplastic large cell lymphoma --> OAS 77% 5 year survival „ Micosis fungoide, indolente „ Immunofenotipo „ Variabile espressione dei markers T cellulari

Studi ancillari „

„

Studi immunologici „ Citofluorimetria „ Immunoistochimica Metodiche di biologia molecolare „ PCR „ FISH Strategia

I linfomi riproducono l’immunobiologia della controparte normale Tale riproduzione può essere aberrante L’espressione normal o aberrante può essere usata per : „ Determinare lineage, B versus T versus NK „ Detectare la clonalità „ Identificare la malignità in caso di perdita o aberrante espressione di determinati antigeni „ Identificare il sottotipo di linfoma

Antigeni di superficie „

„

„

„

La risposta immunitaria richiede il contributo di numerosi fattori che si trovano sulla mambrna plasmatica delle cellule immunocompetenti Sono classificati in B associati, T associati, associati all’attivazione e recettori di chemochine L’espressione è variabile in rapporto alla sequenza di maturazione linfoide Catalogati in CD - clusters of differentiation – seguito da un numero

B cell antigen expression

T cell antigen expression

Tecniche immunologiche

„ „

Flow cytometry Immunoistochimica

IMMUNOISTOCHIMICA

Il fenotipo delle malattie linfoproliferative: classificazione diagnostica con significato terapeutico Lymphoma

Surface immunoglobulin

CD5 CD10 CD20 CD23 CD43 CD103 Cyclin D1

Chronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma

+

+

–

+

+

+

–

+/–

Hairy–cell leukaemia

+

–

–

+

–

+

++

+/–

Follicular lymphoma

+

–

+

+

+/–

–

–

–

Mantle–cell lymphoma

+

+

–

+

–

+

–

+

Diffuse large B–cell lymphoma

+/–

–

+/–

+

NA

+/–

NA

–

Burkitt's lymphoma

+

–

+

+

–

–

NA

–

MALT lymphoma + – – + +/– +/– – – ++, More than 95% positive; +, More than 90% positive; +/–, 10–90% positive; –, less than 10% positive; NA, not applicable; MALT, mucosa-associated lymphoid tissue.

Tecniche molecolari „ „

Clonalità Riarrangiamenti cromosomici

IgL riarrangiato IgH riarrangiato

TdT

TdT mu

TdT

B progenitrice

Pre-pre-B

Pre-B

B immatura

Mantello Midollo osseo

B matura

B attivata

Plasmacel.

Centro germinativo Tessuto linfoide Sangue periférico TCR alfa riarrangiato

TCR beta riarrangiato TCR gamma riarrangiato TCR delta deleto TCR delta riarrangiato

CD3 TdT CD3 TdT

CD3 TdT

CD3 TdT

Protimocito

Timocito immaturo

Timocito comúne

TdT Céllula linfoide proecursore

Midollo osseo

Timo (corticale)

Timocito maturo

CD3 TdT Timo (midollare)

Linfocito TH T maturo

Linfocito TS Sangue periférico Tessuto linfoide

Clonalità dei processi linfoproliferativi

+H

3N

+H

3N

3N

+H

3N

CL

L

VL

V

+H

CL

„

Tutte le neoplasia sono proliferazioni clonali Tutte le cellule B e T presentano riarrangiamento genico del recettore antigenico CL

Vα

Vβ

Cα

Cβ

-S -S -

-S -S

CL

„

-S-S-

COO¯

COO¯

-S-S-

CH

CH

COO¯

COO¯

Ig

TCR

Recettore antigenico +H

3N +H

CL V

L

VL -S -S -

-S -S

CL

CL

• 2 catene leggere: kappa o lambda • 2 catene pesanti: μ (IgM) δ (IgD) γ (IgG) α (IgA) ε (IgE) • Regioni variabili (V) e constanti (C)

3N

3N

CL

Cellule B: Immunoglobulina

+H +H

-S-S-

COO¯

COO¯

-S-S-

CH

CH

COO¯

COO¯

Cellule T: Recettore della Cellula T (TCR) • Proteina di membrana • Eterodímeri: • Catene α/β (95 %) • Catene γ/δ (5 %) • Regioni variabili (V) e constanti (C) • Si associa alla molecola CD3

Vα

Vβ

Cα

Cβ

TCR

γδε

CD3

3N

Organizzazione genomica dei geni delle Ig e TCR IgH 14q32 Igκ 2p11 Igλ 22q11 TCR α/δ 14q11 TCR β 7q34 TCR γ 7p15

VH1 VH2 .... VHn

DH1-15

JH1-6

VK1 VK2 .... VKn

JK1-5

CK

Vλ1 Vλ2 .... Vλn

Vα1 Vα2 ...Vαn

Vβ1 Vβ2 ....Vβn

J C1 J C2 J C 3

Vδ1 Vδ2 ...Vδn

Dβ 1

Jβ1

V1 V2 ..... V8 VA V9 V10 VB V11 V12

Dδ

J C4

Jδ

C β1

Cμ Cδ Cγ3Cγ1Cε1Cα1Cγ2Cγ4CεCα2

J C5

Cδ

J C6

Jαn

Dβ 2

Jβ2

Jγ1 C γ1

Jγ2 C γ2

123

12

Cα

Cβ2

Riarrangiamento di TCRγ : primers Región

Secuencia

TCR V2

5’ CTTCCTGCAGATGACTCCTACAACTCCAAGGTTG 3’

TCR V3

5’ CTTCCTGCAGATGACGTCTCCACCGCAAGGGATG 3’

TCR V4

5’ TCCCCTGCAGATGACTCCTACACCTCCAGCGTTG 3’

TCR V5

5’ TTCCTGCAGATGACGTCTCCAACTCAAAGGATG 3’

TCR V8

5’ CTTCCTCGAGATGACTCCTACAACTCCAGGGTTG 3’

TCR V9

5’ GGNACTGCAGGAAAGGAATCTGGCATTCCG 3’

TCR V10

5’ CTCTGCAGAATCCGCAGCTCGACGCAGCA 3’

TCR V11

5’ CACTGCAGGCTCAAGATTGCTCAGGTGGG 3’

TCR V12

5’ ACTCTGCAGCCTCTTGGGCACTGCTCTAAA 3’

Jγ 1.3, 2.2

5’ AAGTGTTGTTCCACTGCCAAA 3’

Jγ 1.1, 2.1

5’ AGTTACTATGAGC(T/C)TAGTCCC 3’

Jγ 1.2

5’ TGTAATGATAAGCTTTGTTCC 3’

V1 V2 ..... V8 VA V9 V10 VB V11 V12

5’

3’

Mix I, Mix II

Mix I: V2, 8 + V3 + V4 + V9 Mix II: V5 + V10 + V11 + V12 Mix III: Jγ1 - Jγ2

PCR 1: Mix I + III : Tm 59ºC PCR 2: Mix II + III : Tm 55ºC 170-200 pb

Jγ1 C γ1

Jγ2 C γ2

123

12

3’

5’

Mix III

Organizzazione e riarrangiameno dei geni IgH VH1 VH2 .... VHn

DH1-15

Cμ Cδ Cγ3Cγ1Cε1Cα1Cγ2Cγ4CεCα2

JH1-6

1o riarrangiamento

VH1 VH2 .... VHn

Cμ Cδ Cγ3Cγ1Cε1Cα1Cγ2Cγ4CεCα2

DJ

2º riarrangiamento

VDJ

VH

Cμ Cδ Cγ3Cγ1Cε1Cα1Cγ2Cγ4CεCα2

DHDH N

JH N

Cμ

Struttura della regione variabile del gene IgH N

N

Fr1 CDRI Fr2 CDRII Fr3 CDRIII Fr4 VH

DH

JH

•Zone ipervariabili: Regioni Determinanti la Complementarietà (CDR) •Zone più consevate: Framework (Fr) •Inserzioni “N” •Regioni di unione (J)

Primers per detectare il riarrangiamento monoclonale di IgH Regione

Sequenza

CDRII (Fr2)

5’ TGG(A/G)TCCG(C/A)CAG(G/C)C(T/C)(T/C)CNGG 3’

CDRIII (Fr3)

5’ ACACGGC(C/T)(G/C)TGTATTACTGT 3’

JH

5’ TGAGGAGACGGTGACC 3’

VH Fr1

Fr2

N DH N

CDRII

Fr3 5’

5’

CDRIII 3’

3’

CDRII: 230-300 pb CDRIII: 70-150 pb

JH

CH

Fr4 3’

5’

3’

5’

PCR

Riarrangiamento di IgH Pattern di clonalità:

Riarrangiamento policlonale

Riarrangiamento monoclonale

Riarrangiamento oligoclonale

LYMPHOMA- SPECIFIC GENETIC ALTERATIONS (GATEKEEPER GENE). LYM PHOM A

GEN

TRANSLOC. IgH

FUNCTION

Follicular

Bcl2

Apoptosis Inhibitor

Mantle

Cyclin D1 IgH

DLBCL

Bcl6

IgH

Prom otes G1/S transition. GC Form ation

Lp Im

Pax5

IgH

Hom eobox

M ALT

API2

11;18

Apoptosis reg

M ALT

Bcl10

IgH

Apoptosis inhibitor

Burkitt

c-m yc

Ig genes Transcription factor

La diagnosi morfologica Linfoma di Burkitt

Linfoma follicolare

L’immunoistochimica acquisisce un nuovo ruolo Espressione di bcl-2 in un linfonodo normale

Espressione di bcl2 in un linfoma follicolare

Follicular lymphoma

Mantle cell lymphoma

CyclinD1

Bcl2

La morfologia guida l’indagine citogenetica e molecolare

t(8;14) nei Burkitt 1976

Cloning of C-Myc

1982

Cloning of bcl-2

1987

FISH: Applicazioni in oncologia Diagnosi

Valore prognostico

Target terapeutico

FISH

FISH in ematopatologia Diagnosi

Valore prognostico

Applicazioni Terapeutiche??

FISH

Traslocazioni: linfomi e leucemie Leucemie:

BCR/ABL [t(9;22) M-BCR] BCR/ABL [t(9;22) m-BCR BCR/ABL [t(9;22) µ-BCR] AML1/ETO [t(8;21)] PML/RAR [t(15;17)] CBFß/MYH11 [inv(16)] MLL/AF4 [t(4;11)] E2A/PBX1 [t(1;19)] TEL/AML1 [t(12;21)] DEK-CAN [t(6;9)]

Linfomi: ALK/NPM [t(2;5)]

BCL2/IgH [t(14;18) MBR] BCL2/IgH [t(14;18) mcr] BCL1/IgH [t(11;14) MTC] API2/MLT [t(11;18)]

FISH: leucemie Traslocazioni

• t (9;22) o bcr/abl nelle LMC (leucemie mieloidi croniche) • t (15;17) o PML/RARA nelle LE (leucemie acute) • t (12;21) o TEL/AML1 nelle LA (leucemie acute B)

Trisomie e monosomie

•trisomia cr.8 : nelle leucemie mielocitiche acute •trisomia cr.12: nella leucemia linfocitica acuta •monosomia cr.7: nei disordini mieloproliferativi

Delezioni

-20q nei disordini mieloproliferativi -5q nelle leucemie mieloidi acute

FISH: linfomi Traslocazioni • t (14,18) linfoma follicolare • t (11; 14) linfoma mantellare • t (11; 18)(q31;q31) & t(14;18)(q21;q31) linfoma marginale extranodale tipo MALT • t che coinvolgono il gene bcl6 • t(2;5) linfoma anaplastico •T(8;14) linfoma di Burkitt

Differenziazione linfoide B IgL riarrangiato IgH riarrangiato

TdT

TdT

Cellula B progenitrice

Cellula Pre-pre-B

HLA-DR CD34

HLA-DR CD34 CD19 CD22 CD10

TdT mu Cellula Pre-B HLA-DR CD34 CD19 CD22 CD10 CD20 CD79a

Cellula B immatura

Cellula B matura

HLA-DR CD19 CD22 CD20 CD21 CD5 SIgM CD79a

HLA-DR CD19 CD22 CD20 CD21 SIgM,D CD79a

Mantello Midollo osseo

Cellula B attivata HLA-DR CD19 CD22 CD20 SIgM,G, A CD79a

Plasmacellula HLA-DR CD38 CD79a

Centro germinativo Tessuto linfoide Sangue periferico

Linfoma mantellare T(11;14)

Linfoma follicolare T(14;18) DLBCL T(bcl6)

traslocazioni Cromosomi normali

traslocazione

FISH Diagnosi • Dubbia diagnosi anatomopatologica 9Fenotipo ambiguo 9IHC non convincente

• Follow-up dei pazienti con diagnosi “molecolare” certa

Caso 1

CD23

bcl2

FISH t(14;18) Cro 18q21 (BCL2 SpectrumOrange*)

Cro 14q32 (IGH SpectrumGreen*) t (14;18)

Diagnosi:Linfoma follicolare *

Sonde Vysis: LSI IGH SpectrumGreen / LSI BCL2 SpectrumOrange

Linfoma follicolare (LF): PCR t(14;18) FISH

t(14;18) PCR

# Cnt+

# # Caso 1

•Splenomegalia: CM 25X16X9 •MO: infiltrazione neoplastica •Splenectomia diagnostica e terapeutica

Caso 2

Ciclina D1

CD5

FISH t(11;14) t (11;14)(q13;q32,3)

Cro 11q13 (CCND1 SpectrumOrange*)

Cro 14q32,3 (IgH SpectrumGreen*)

Diagnosi:Linfoma Mantellare *

Sonde Vysis: LSI IgH SpectrumGreen / LSI CCND1 SpectrumOrange

Linfoma mantellare :PCR

Caso 2

Foto t(11;14) FISH

Ctr+

Foto t(11;14) PCR

FISH Prognosi •Linfomi 9t(11;18) associata a bcl10 nucleare MALT lymphoma 9t(14;18) (q21,q31) MALT Lymphoma 917p del, 13q del, 11q del e trisomia 12 in SLL/LLC

T(11;18)(q21,q21) „

frequente in casi di MALTomi gastrici localmente avanzati

„

Frequente associazione con BCl10 nucleare „

Frequente associazione con MALTomi H. pylori negativi

„

Non responder all’eradicazone di H. pylori Liu H, et al. Blood 2001; 98:1182-1187 Ye H, et al, Blood 2003; 101:2547-2550

SLL/LLC

„ „

17p del (p53): pz con ridotti intervalli liberi da trattamento 13 q del (RB? E LAMP1): pz con aumentati intervalli liberi da trattamento „

11 q del (ATM): pazienti con avanzato stato di malattia Dohner H, N Engl J Med 2000; 343:1910-6.

11q del

11q green 17p orange

13 q orange(q14.3) e aqua (q34) 12 cep green