Lezione 5

I GENI REPORTER -Sono geni che codificano un prodotto la cui attività è facilmente rilevabile e quantificabile, privi della regione del promotore. -Vengono posti a valle di una regione del promotore che normalmente controlla geni diversi -L’attività della proteina codificata da gene reporter indica l’avvenuta attivazione del promotore

lacZ

Spettrofotometro

La LUCIFERASI

luciferasi

luciferina

Luciferasi ATP + D-luciferina + O2---------> oxyluciferina + AMP + PPi + CO2 + luce

LUMINOMETRO

La GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) e i suoi derivati

Aequorea victorea

Prof. Osamu Shimomura

Centro attivo della gfp

Mutando la proteina o il centro attivo si sono prodotte gfp che emettono diverse bioluminescenze

La PEROSSIDASI

luminometro

luminolo

I geni reporter possono anche essere anche usati per produrre proteine di fusione per seguire la localizzazione di una proteina nei tessuti o a livello subcellulare

ALCUNE APPLICAZIONI DEI GENI REPORTER

-isolamento di NUOVE REGIONI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE da library genomiche

-valutazione dell’ATTIVITA’ DI UN TRANSATTIVATORE TRASCRIZIONALE

-individuazione di proteine che interagiscono tra di loro in vivo: IL DOPPIO IBRIDO NEL LIEVITO

Uso dei geni reporter per L’ISOLAMENTO DI NUOVE REGIONI DI REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE DA UNA LIBRARY GENOMICA

Scannerizzazione di una regione del promotore alla ricerca di sequenze regolatrici, attracerso mutagenesi

DAL GENE ALLA PROTEINA………………………E RITORNO

I TRANSATTIVATORI TRASCRIZIONALI Proteine che controllano la trascrizione agendo in TRANS, legandosi alle sequenze regolatrici di un gene, che agiscono invece in CIS, reclutando sulla TATA box l’apparato trascrizionale basale

Per svolgere questa funzione sono essenziali due domini

1)

DOMINIO DI LEGAME SPECIFICO AL DNA

2)

DOMINIO DI ATTIVAZIONE

1) IL DOMINIO CHE LEGA IL DNA (DBD)

La selettività del transattivatore risiede nel riconoscimento di sequenze nucleotidiche specifiche (elementi regolatori):

a) Riconoscimento di distorsioni dell’elica dipendenti dalla sequenza nucleotidica Elica ideale: 36°° di giro d’elica tra due coppie di basi adiacenti (10 coppie di basi per giro completo)

Es: AAAANNN

La geometria della doppia elica dipende dalla sequenza nucleotidica

b) Riconoscimento delle informazioni chimiche offerte dal bordo della doppia elica (solco maggiore)

Interazioni tipiche tra aa del DBD e gruppi chimici delle basi del DNA esposti Lungo il solco maggiore del sito riconosciuto dal transattivatore

Arg-G

Asn-A

Il DBD interagisce con circa 20 nucleotidi, in modo da intraprendere una interazione estremamente FORTE e SPECIFICA

NAME Bacteria lac repressor CAP lambda repressor Yeast Gal4 Matα α2 Gcn4 Drosophila Kruppel Bicoid Mammals Sp1

DNA SEQUENCE RECOGNIZED* 5′′AATTGTGAGCGGATAACAATT 3′′TTAACACTCGCCTATTGTTAA TGTGAGTTAGCTCACT ACACTCAATCGAGTGA TATCACCGCCAGAGGTA ATAGTGGCGGTCTCCAT CGGAGGACTGTCCTCCG GCCTCCTGACAGGAGGC CATGTAATT GTACATTAA ATGACTCAT TACTGAGTA AACGGGTTAA TTGCCCAATT GGGATTAGA CCCTAATCT

GGGCGG CCCGCC Oct-1 Pou domain ATGCAAAT TACGTTTA GATA-1 TGATAG ACTATC MyoD CAAATG GTTTAC p53 GGGCAAGTCT CCCGTTCAGA •Each protein in this table can recognize a set of closely related DNA sequences; for convenience, only one recognition •sequence, rather than a consensus sequence, is given for each protein.

Sebbene ciascun esempio di riconoscimento proteina-DNA sia unico nei dettagli esistono delle serie di motivi strutturali che legano il DNA

-ELICA-GIRO-ELICA

Es: i GENI OMEOTICI

DITA DI ZINCO

CERNIERA DI LEUCINE

ELICA-ANSA-ELICA

L’ETERODIMERIZZAZIONE ESPANDE IL REPERTORIO DI SEQUENZE DI DNA RICONOSCIUTE DA PROTEINE CHE REGOLANO I GENI

repressore

2) IL DOMINIO DI ATTIVAZIONE -La sua funzione è quella di attrarre, modificare e posizionare l’apparato trascrizionale basale (TFII + RNApol II) -può avere una configurazione non strutturata finchè non entra in contatto con una proteina co-attivatrice

I transattivatori trascrizionali modificano la struttura locale della cromatina A) B)

Dirigendo l’iperacetilazione degli istoni a livello delle sequenze che regolano la trascrizione Reclutando complessi proteici di rimodellamento della cromatina

A) La iperacetilazione degli istoni attenua la carica positiva delle code istoniche

B) I complessi di rimodellamento della cromatina permettono lo scorrimento del nucleosoma

L’effetto dell’interazionetra attivatori sulla trascrizione è cooperativo

Più transattivatori possono cooperare per stimolare l’assemblaggio dei complessi di inizio, combinandosi in modo da determinare espressione cellulo-specifica

epatocita

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Regolazione dell’attività dei transattivatori trascrizionali negli eucarioti superiori Segnali provenienti dall’esterno/interno della cellula modificano l’espressione genica nodulando l’attività dei transattivatori trascrizionali

Un unico transattivatore trascrizionale può tenere sotto controllo molti geni, in modo da poter coordinare risposte integrate e complesse agli stimoli esterni

L’adattamento all’ipossia

EFFETTI A BREVE TERMINE

*EFFETTI A LUNGO TERMINE

-Incremento della frequenza respiratoria

-Incremento del numero degli eritrociti

-Aumento del flusso circolatorio

-Proliferazione dei capillari

-Aumento della glicolisi

HIF1α α (Fattore Inducibile dall’Ipossia 1α α)

HIF1α α

Tirosina idrossilasi (sintesi catecolamine)

*Epo

Enzimi glicolisi

eritropioesi

vasocostrizione periferica frequenza cardiaca broncodilatazione glicogenolisi

*VEGF angiogenesi

Enzimi trasporto glucosio

IPOSSIA (Sensore dell’O2)

Trascrizione e traduzione degradazione

HIF1α α

ub

HIF1α α HIF1β β HIF1β β

NORMOSSIA

NF-KB: il grande integratore della risposta allo stress

Degradazione di IkB

STRESS

p53

Il dominio caldo per le mutazioni è il DBD: alterazioni, sia della struttura del DBD, sia degli aa che legano direttamente il DBD

Regolazione dell’attività di p53

1)

MDM2: segnala p53 per l’ubiquitinazione

degradazione

Cinasi attivate dal danno al DNA

reclutamento del macchinario replicativo

Sensori del danno al DNA: attivano specifiche cinasi che modificano la regione di legame a MDM2: stabilizzazione dell’emivita e accumulo di p53

2) La localizzazione subcellulare

NES: Sequenza di Esportazione dal Nucleo (compresa nel dominio di tetramerizzazione) NLS: Sequenza di Localizzazione Nucleare La tetramerizzazione maschera l’NES

p53 entra nel nucleo

3) Le modificazioni covalenti Fosforilazioni e acetilazioni del carbossiterminale

VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ DI UN TRANSATTIVATORE TRASCRIZIONALE (es: p53)

pMDM2

1) Trasfezione delle cellule col vettore 2) Applicazione dello stimolo (es: irradiazione = danno al DNA) 3) Misurazione dell’attività del gene reporter

Es: stimolo infiammatorio

p53

Si clona a monte del gene reporter la sequenza regolatrice prelevata da un gene attivato dal transattivatore oggetto di studio

Molte vie di trasduzione del segnale avvengono per interazione di proteine, senza necessità di modificazioni covalenti

Esempio: le vie che conducono all’APOPTOSI I RECETTORI DELLA MORTE DEPRIVAZIONE DI GF DEPRIVAZIONE DI CITOCHINE

LA VIA DEL MITOCONDRIO

La via dei RECETTORI DELLA MORTE

Il ligando induce trimerizzazione del recettore

DD= dominio di morte /MORT1

DED= dominio effettore della morte

APOPTOSI

La VIA DEL MITOCONDRIO

p53

Danno genotossico

Come si scoprono le interazioni tra proteine?

IL DOPPIO IBRIDO NEL LIEVITO

GAL4 di S.cerevisiae: transattivatore necessario per l’espressione di geni codificanti enzimi per l’utilizzo del lattosio, indotti dalla presenza del substrato

Dominio Nt

Corrisponde al DBD. Si lega alle UASG del lievito

Dominio Ct

Corrisponde al dominio di attivazione

GAL1-lacz: gene di fusione di tipo reporter. GAL1: contiene le UASG di lievito LacZ: gene di E. coli. Permette l’utilizzo di X-gal

Ct Nt

Contiene la parte del gene di GAL4 (Nt) per il DBD di GAL1 (UASG)

Contiene la parte del gene di GAL4 (Ct) per il DA di GAL1 (UASG)

A valle di esso si clona il gene codificante la proteina di cui si vuole determinare un partner di interazione, detto ESCA (es. bcl-2)

A valle di esso si clona una genoteca di cDNA prodotta da cellule in cui la proteina è attiva, per individuare il partner di interazione (PESCE)

Leu+

Trp+

Si usano lieviti del ceppo GGY1::171

GAL4-, Leu-, TrpGAL1-lacZ

Si usano lieviti del ceppo GGY1::171

GAL4-, Leu-, TrpGAL1-lacZ

Devono crescere in terreno contenente Leu e Trp bcl2

Trasformazione del lievito con Il plasmide contenente l’esca e Crescita in terreno Leu-/Trp+

Selezione dei lieviti contenenti il plasmide

y

x Ulteriore trasformazione dei lieviti con la genoteca di fusione e crescita in terreno Leu-/Trp-

z

Selezione dei doppi ibridi

………….

Le cellule vengono incubate in piastre in presenza di X-gal per la ricerca di colonie blu =ricostituzione della attività beta-galattosidasica = riavvicinamento di GAL4 Nt e GAL4 Ct. Interazione tra ESCA e PESCE: quel clone contiene il gene codificante la proteina che interagisce con l’esca (es. per Bcl-2, BAX)

STUDIO DELL’ESCA PER CLONAGGIO, SEQUENZIAMENTO, ECC.

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