Lezione Snupe 1
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- Words: 968
- Pages: 28
Università degli Studi di Firenze Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Biotecnologie
Dott. Ferri Lorenzo
Dott. Sparvoli Valentina
Single Nucleotide Primer Extension Permette di rilevare polimorfismi puntiformi (SNPs) in qualsiasi punto di una regione del DNA amplificabile via PCR.
Attraverso l’estensione di uno o più primer di un solo nucleotide complementare alla base polimorfica che si vuole studiare.
Single Nucleotide Primer Extension T
5’
3’
T A
3’
5’ O
O
O
O- P O P O P O CH2
I
O-
O-
BASE
O
OH H H
ELETTROFORESI CAPILLARE lunghezza
H H H
Single Nucleotide Primer Extension
INDIVIDUAZIONE MUTAZIONI
ANALISI SNuPE
IDENTIFICAZIONE di SPECIE
DETERMINAZIONE GENOTIPI
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICA Ricerca e recupero, per ogni specie, delle sequenze nucleotidiche del MARCATORE MOLECOLARE (es. un gene) scelto come bersaglio dell’analisi, disponibili in banca dati
SPECIE A AF108056 AF108057 AF269041 AY074260 AY460027 ........
SPECIE C SPECIE B AY473021 AF057108 AY604126 AY067403 AF269017 ........
AF247043 AF604821 AY600626 AY744103 AY690319 ........
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICA Allineamento delle sequenze recuperate per ogni specie AF108056 Specie A
AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG
AF108057 Specie A
AGTCAACCGACCGTTCCGACCGGTGACTATTCGACG
AF269041 Specie A
AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG
AY074260 Specie A
AGTCAATCGGCCGTTCGGACCGCTGACTATACGACG
AY460027 Specie A
AGTCAATCGGCCGTTCGGCCCGCTGACTATACGACG
Consensus sequence AGTCAAYCGRCCGTTCGGCCCGSTGACTATWCGACG
Creazione di SEQUENZE CONSENSO
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICA Allineamento delle sequenze consenso delle specie considerate SpecieA
95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Individuazione SNPs SPECIE SPECIFICI
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER CRITERI Devono ricadere all’interno di una regione amplificabile via PCR
Scelta SNPs utili per l’analisi SNuPE
Devono presentare regioni conservate a monte o a valle Singolarmente o combinati insieme devono consentire di discriminare le specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER CARATTERISTICHE
Disegno primer per l’analisi SNuPE
Annealing su tutte le specie Coda di poli T all’estremità 5’
SpecieA
215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
5’-(T)5AGTCACGACGTCGCTGAGTAT-3’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
3. PCR Fw
245
Rev
PURIFICAZIONE PCR
1. Marker; 2. campione; 3. controllo negativo
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE PRODOTTO di PCR PURIFICATO
READY REACTION MIX
PRIMER SNuPE
9AmpliTaq®DNA Polymerase; 9 FS Reaction Buffer; 9ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddTTP,ddATP) O
O
O O- P O P O P O CH2 O-
O-
OH H H
O
BASE H H H
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX) 9 Denaturazione. Specie A
9 Annealing del primer.
5’
3’
3’
T A
5’
T
3’
3’
A
5’
5’
Specie A
STRATEGIA SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX) O
9 Estensione del primer.
O
O
O- P O P O P O CH2 O-
O-
OH H H
5’
T
3’
T
Specie A
3’
A
BASE
O
5’
H H H
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX) 9 Elettroforesi capillare. I Specie A
3’
T A
5’ lunghezza
Specie B
3’
G C
I 5’ lunghezza
Specie C
3’
A T
I 5’ lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX) 9 Elettroforesi capillare Specie A
Specie B
3’
3’
T A
A T
5’
5’
I
lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAYT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
5’-(T)14CGTTCGCCCGCTGACTATACG-3’
PRIMER 1 (35 basi)
SpecieA
215 TCTACGTTCAGTCACGACGCCGCTGAGTATACGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATCCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
5’-(T)5TACGTTCAGTCACGACG-3’
PRIMER 2 (22 basi)
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX) PRODOTTO di PCR PURIFICATO
READY REACTION MIX 9AmpliTaq®DNA Polymerase; 9 FS Reaction Buffer; 9ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddUTP,ddATP)
PRIMER 1 PRIMER 2
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REZIONE SNuPE (MULTIPLEX) 9 Denaturazione. Specie A
A T
C G
3’ 5’
5’
A
C
3’
3’
T
G
5’
5’ 3’
9 Annealing del primer. Specie A
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX) 9 Estensione del primer. 5’
Specie A 3’
A
C
A
C
T
G
I
lunghezza
3’ 5’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX) 9 Elettroforesi capillare. 5’
Specie A 3’
A
C
A
C
T
G
3’
I
5’ lunghezza
5’
Specie B 3’
A
T
A
T
T
A
3’
I
5’ lunghezza
5’
Specie C
3’
G
T
G
T
C
A
3’
I
5’ lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX) 9 Elettroforesi capillare. 5’
3’
A
C
A
C
3’
T
G
5’
5’
G
T
3’
G
T
C
A
Specie A
Specie C 3’
I
lunghezza 5’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX) 9 Elettroforesi capillare. 5’
3’
A
C
A
C
3’
T
G
5’
5’
A
T
3’
A
T
T
A
Specie A
Specie B 3’
I
lunghezza 5’
Single Nucleotide Primer Extension
SENSIBILITA’
VANTAGGI TECNICA SNuPE
RILEVAZIONE SNPs in QUALSIASI PUNTO del MARCATORE SCELTO
RAPIDITA’ di ESECUZIONE
Dott. Ferri Lorenzo
Dott. Sparvoli Valentina
Single Nucleotide Primer Extension Permette di rilevare polimorfismi puntiformi (SNPs) in qualsiasi punto di una regione del DNA amplificabile via PCR.
Attraverso l’estensione di uno o più primer di un solo nucleotide complementare alla base polimorfica che si vuole studiare.
Single Nucleotide Primer Extension T
5’
3’
T A
3’
5’ O
O
O
O- P O P O P O CH2
I
O-
O-
BASE
O
OH H H
ELETTROFORESI CAPILLARE lunghezza
H H H
Single Nucleotide Primer Extension
INDIVIDUAZIONE MUTAZIONI
ANALISI SNuPE
IDENTIFICAZIONE di SPECIE
DETERMINAZIONE GENOTIPI
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICA Ricerca e recupero, per ogni specie, delle sequenze nucleotidiche del MARCATORE MOLECOLARE (es. un gene) scelto come bersaglio dell’analisi, disponibili in banca dati
SPECIE A AF108056 AF108057 AF269041 AY074260 AY460027 ........
SPECIE C SPECIE B AY473021 AF057108 AY604126 AY067403 AF269017 ........
AF247043 AF604821 AY600626 AY744103 AY690319 ........
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICA Allineamento delle sequenze recuperate per ogni specie AF108056 Specie A
AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG
AF108057 Specie A
AGTCAACCGACCGTTCCGACCGGTGACTATTCGACG
AF269041 Specie A
AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG
AY074260 Specie A
AGTCAATCGGCCGTTCGGACCGCTGACTATACGACG
AY460027 Specie A
AGTCAATCGGCCGTTCGGCCCGCTGACTATACGACG
Consensus sequence AGTCAAYCGRCCGTTCGGCCCGSTGACTATWCGACG
Creazione di SEQUENZE CONSENSO
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICA Allineamento delle sequenze consenso delle specie considerate SpecieA
95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Individuazione SNPs SPECIE SPECIFICI
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER CRITERI Devono ricadere all’interno di una regione amplificabile via PCR
Scelta SNPs utili per l’analisi SNuPE
Devono presentare regioni conservate a monte o a valle Singolarmente o combinati insieme devono consentire di discriminare le specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER CARATTERISTICHE
Disegno primer per l’analisi SNuPE
Annealing su tutte le specie Coda di poli T all’estremità 5’
SpecieA
215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
5’-(T)5AGTCACGACGTCGCTGAGTAT-3’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
3. PCR Fw
245
Rev
PURIFICAZIONE PCR
1. Marker; 2. campione; 3. controllo negativo
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE PRODOTTO di PCR PURIFICATO
READY REACTION MIX
PRIMER SNuPE
9AmpliTaq®DNA Polymerase; 9 FS Reaction Buffer; 9ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddTTP,ddATP) O
O
O O- P O P O P O CH2 O-
O-
OH H H
O
BASE H H H
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX) 9 Denaturazione. Specie A
9 Annealing del primer.
5’
3’
3’
T A
5’
T
3’
3’
A
5’
5’
Specie A
STRATEGIA SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX) O
9 Estensione del primer.
O
O
O- P O P O P O CH2 O-
O-
OH H H
5’
T
3’
T
Specie A
3’
A
BASE
O
5’
H H H
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX) 9 Elettroforesi capillare. I Specie A
3’
T A
5’ lunghezza
Specie B
3’
G C
I 5’ lunghezza
Specie C
3’
A T
I 5’ lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX) 9 Elettroforesi capillare Specie A
Specie B
3’
3’
T A
A T
5’
5’
I
lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA
155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB SpecieC
155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieA
215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
Specie
SNP 1
SNP 2
Specie A
A
C
Specie B
A
T
Specie C
G
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE SpecieA
95
AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB
95
AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAYT
SpecieC
95
AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
5’-(T)14CGTTCGCCCGCTGACTATACG-3’
PRIMER 1 (35 basi)
SpecieA
215 TCTACGTTCAGTCACGACGCCGCTGAGTATACGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB
215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATCCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC
215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
5’-(T)5TACGTTCAGTCACGACG-3’
PRIMER 2 (22 basi)
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX) PRODOTTO di PCR PURIFICATO
READY REACTION MIX 9AmpliTaq®DNA Polymerase; 9 FS Reaction Buffer; 9ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddUTP,ddATP)
PRIMER 1 PRIMER 2
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REZIONE SNuPE (MULTIPLEX) 9 Denaturazione. Specie A
A T
C G
3’ 5’
5’
A
C
3’
3’
T
G
5’
5’ 3’
9 Annealing del primer. Specie A
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX) 9 Estensione del primer. 5’
Specie A 3’
A
C
A
C
T
G
I
lunghezza
3’ 5’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX) 9 Elettroforesi capillare. 5’
Specie A 3’
A
C
A
C
T
G
3’
I
5’ lunghezza
5’
Specie B 3’
A
T
A
T
T
A
3’
I
5’ lunghezza
5’
Specie C
3’
G
T
G
T
C
A
3’
I
5’ lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX) 9 Elettroforesi capillare. 5’
3’
A
C
A
C
3’
T
G
5’
5’
G
T
3’
G
T
C
A
Specie A
Specie C 3’
I
lunghezza 5’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX) 9 Elettroforesi capillare. 5’
3’
A
C
A
C
3’
T
G
5’
5’
A
T
3’
A
T
T
A
Specie A
Specie B 3’
I
lunghezza 5’
Single Nucleotide Primer Extension
SENSIBILITA’
VANTAGGI TECNICA SNuPE
RILEVAZIONE SNPs in QUALSIASI PUNTO del MARCATORE SCELTO
RAPIDITA’ di ESECUZIONE
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