Lezione Snupe 2

La Fibrosi Cistica La più frequente malattia ereditaria cronica che colpisce indifferentemente i maschi e le femmine appartenenti prevalentemente alla razza bianca Etnia

Incidenza

Freq. eterozigosi

Caucasici

1/2500

1/25 (4%)

Ebrei Ashkenazi

1/3300

1/29

Ispanici (America latina) Africani Americani

1/8000

1/46

1/15000

1/65

Asiatici Americani

1/30000

1/150

Cenni storici • 1936: per la prima volta vengono messi in relazione disfunzioni pancreatiche e respiratorie • 1938: le prime osservazioni anatomo-patologiche in autopsia forniscono una prima descrizione della malattia

• 1953: rilevazione di eccessi di cloruro di sodio nel sudore • 1983: osservazione dettagliata degli epiteli respiratori FC mediante microscopia

• 1989: individuazione della molecola che, se difettata, causa FC: CFTR

Proteina CFTR

“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”

• Superfamiglia dei trasportatori ABC (ATP Binding Cassette) trasporto attivo primario •Proteina trans membrana • 1480 Aminoacidi • Canale per il passaggio di ioni Cloro • Presente negli epiteli secretori: ghiandole sudoripare, naso, bronchi, pancreas, intestino e dotti deferenti.

CFTR: struttura

“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”

• MSD-1 e MSD2: porzioni trans membrana (alfa-eliche idrofobiche) • NBD-1 e NBD-2: domini ATPasici • R: dominio regolatore

CFTR: regolazione

“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”

1) Quando la proteina non lega i cofattori il canale è chiuso da R 2) Quando l’ATP si lega ai domini NBD e la PKA fosforila R il canale è aperto Passaggio di ioni cloro dal lato citosolico a quello extracellulare del plasmalemma

CFTR e Fibrosi Cistica

L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette l’attività secretoria epiteliale

Principali sintomi FC Apparato respiratorio (epitelio polmonare)

•Tosse frequente •Catarro •Stanchezza •Infezioni respiratorie

•Insufficienza pancreatica Apparato digerente

•Maldigestione

(epitelio intestinale)

•Malnutrizione •Occlusioni intestinali

CFTR: mutazioni 1200 mutazioni diverse, con incidenza variabile La mutazione più diffusa nella popolazione caucasica è la ∆F508: Popolaz. anglosassoni: 70% Popolaz. mediterranea: 50% Wild type DNA

GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC

Proteina

Glu

Asn

Ile

Ile

Phe

Gly

Val

Ser

Posizione

504

505

506

507

508

509

510

511

Fibrosi cistica ∆F508 DNA

GAA AAT ATC AT-

--T GGT GTT TCC

Proteina

Glu

Asn

Ile

Ile

Gly

Posizione

504

505

506

507

508

Val 509

Ser 510

CFTR: classi di mutazioni Classe I: sintesi assente della proteina Classe II: compromissione del trasporto intracellulare Classe III: difetti della regolazione (∆F508) Classe IV: alterazioni a livello dei tratti transmembrana che riducono la conduttanza del canale Classe V: mutazioni che non alterano la funzione della proteina ma ne riducono i livelli di sintesi

Gene CFTR

“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”

• 250.000 paia di basi • localizzato sul cromosoma 7

Segue il modello dell’eredità mendeliana

Eredità autosomica recessiva Allele CFTR wild type: dominante Allele CFTR “mutato”: recessivo

Chi eredita due copie mutate (Omozigoti) manifesta i sintomi

Chi eredita una sola copia mutata (Eterozigoti) non ha nessun sintomo (Portatore sano)

Diagnosi Test del sudore

Screening neonatale

valutazione di [Na+] e [Cl-] nel sudore

Determinazione della tripsina nel sangue lattasi nel meconio

Diagnosi: test del sudore Stimolazione della sudorazione mediante inoforesi

Condizioni normali [Na+] e [Cl-] < 40 mEq/l Fibrosi cistica [Na+] e [Cl-] > 70 mEq/l

Diagnosi: screening neonatale Saggio immunologico per rilevare la quantità di tripsina Goccia di sangue prelevata in terza giornata

Meconio

I livelli di entrambi questi enzimi risultano aumentati nei pazienti FC per la ridotta funzionalità pancreatica

Determinazione dei livelli di lattasi

CFTR e Fibrosi Cistica

L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette l’attività secretoria epiteliale

Infezioni delle vie respiratorie causate da patogeni opportunisti

Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:

Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Burkholderia cepacia complex Haemophilus influenzae Ralstonia pickettii Burkholderia gladioli Alcaligenes xylosoxidans Coenye et al, 2001

Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:

Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Burkholderia cepacia complex Haemophilus influenzae Ralstonia pickettii Burkholderia gladioli Alcaligenes xylosoxidans

Burkholderia: origine Ambientale: Suolo Rizosfera Acqua

Clinica:

polmone dei pazienti FC

B. cepacia complex: tassonomia A causa dell’alto grado di omologia genomica l’identificazione di questi patogeni risulta molto difficoltosa Genomovar

Specie

I

B. cepacia

II

B. multivorans

III

B. cenocepacia

IV

B. stabilis

V

B. vietnamiensis

VI

B. dolosa

VII

B. ambifaria

VIII

B. anthina

IX

B. pyrrocinia

III-A III-B III-C III-D

Burkholderia cepacia complex (Bcc) La colonizzazione delle vie aeree da B. cepacia e la conseguente infezione polmonare “sindrome da cepacia ” sono la più importante causa di malattia tra i pazienti affetti da Fibrosi Cistica Coenye et al, 2001

Cura: Terapia antibiotica mirata

Identificazione tempestiva del patogeno

Scopo Sviluppo di un test diagnostico rapido per la discriminazione di specie e genomovars di Burkholderia cepacia complex nella routine clinica

Entrambi questi ospedali pediatrici ospitano un Centro Fibrosi Cistica

Microbiologia del Bcc

Biologia molecolare applicata ai microrganismi

AFLP

RAPD

PCR specifiche 16S rDNA 16S rDNA RFLP

Identificazione e/o e/o Identificazione tipizzazione tipizzazione

RFLP del gene recA

Analisi del proteoma Analisi del contenuto in acidi grassi

Test fenotipici

SDS-PAGE

Analisi di restrizione di recA: •amplificazione via PCR di un tratto del gene recA: si ottiene un frammento di circa 1000 pb dai soli batteri del complex utilizzando i primer BCR1 e BCR2 Mahenthiralingam et al, 2000

Prodotto di amplificazione

Elettroforesi su gel di agarosio

Taglio con l’enzima di restrizione HaeIII ed elettroforesi su gel per visualizzare i profili ottenuti: Mahenthiralingam et al, 2000

Gvr x

Gvr y

Gvr z

Si ottengono profili di restrizione diversi per la presenza di polimorfismi puntiformi all’interno della sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione.

LIMITI DELLA TECNICA 9 L’uso del solo HaeIII non consente di distinguere ogni genomovar, ma solo di creare dei pattern di profili di restrizione

Mahenthiralingam et al, 2000

9 Necessità di confrontare un profilo con tutti i profili possibili 9 Disponibilità di una banca di ceppi aggiornata 9 Tempi considerevoli per l’ottenimento dei risultati 9 Necessità che il polimorfismo puntiforme genomovar specifico generi o faccia scomparire un sito di restrizione

SNuPE Single Nucleotide Primer Extension 1. Amplificazione via-PCR di un frammento genico 2. Purificazione del templato di PCR 3. Reazione di estensione del primer specifico con dideossinucleotidi marcati con fluorocromi di colore e peso molecolare diversi 4. Purificazione del prodotto di reazione 5. Elettroforesi capillare con identificazione di colore e posizione del fluorocromo incorporato

STEP PRELIMINARI Analisi delle sequenze del gene scelto alla ricerca di polimorfismi puntiformi (SNP): CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATCGGCTCGAT Specie x CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATTGGCTCGAT Specie y CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATAGGCTCGAT Specie z

Disegno di primer specifici sulla base degli SNP individuati

Amplificazione per PCR della regione contenente il polimorfismo 5’ 3’

T A Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato

3’ 5’

Denaturazione 5’

3’

T

A Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato

3’

5’

Annealing 5’

3’

T

A Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato

3’

5’

Primer extension effettuata sul prodotto di amplificazione 5’

3’

3’

5’

T T A

Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato

Elettroforesi capillare Si visualizza così un picco di colore diverso a seconda del dideossinucleotide incorporato, di posizione nota in quanto è nota la lunghezza del frammento (primer specifico + 1 ddNTP) GATATCCGCCGGATCGGCTCGATCGCACTG

GATATCCGCCGGATTGGCTCGATCGCACTG

Specie x

I

I Specie y

I GATATCCGCCGGATAGGCTCGATCGCACTG

posizione

posizione

Specie z

posizione

Individuazione di più polimorfismi

0.2 Specie 1

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

A

C

T

G

C

Specie 2 A

G

A

C

T

Specie 3 C

A

G

T

A

Specie 4 G

T

C

A

G

Specie 5 T

A

C

G

T

2.4 Kbp

Progettazione di un set di primer

0.2 Specie 1

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

A

C

T

G

C

Specie 2 A

G

A

C

T

Specie 3 C

A

G

T

A

Specie 4 G

T

C

A

G

Specie 5 T

A

C

G

T

2.4 Kbp

Reazione SNuPE in Multiplex A 0.2

0.4

C 0.6

0.8

T 1

1.2

G 1.4

1.6

C 1.8

2.0

2.2

2.4 Kbp

Specie 1

G 0.2

0.4

T 0.6

0.8

C 1

1.2

A 1.4

Specie 4

1.6

G 1.8

2.0

2.2

2.4 Kbp

Elettroforesi capillare I

A C T G C

posizione

I

GT C A G

posizione

Specie A 1

C

T

G

C

Specie A 2

G

A

C

T

Specie C 3

A

G

T

A

Specie G 4

T

C

A

G

Specie T 5

A

C

G

T

Gene gyrB come marcatore molecolare

Ricerca delle sequenze disponibili nelle banche dati Disponibilità di una sola sequenza dell’intero gene gyrB di B. cenocepacia, ceppo J2315

Allineamento significativo prodotto dalla sequenza: gi|52208053|emb|BX571965.1| Burkholderia pseudomallei strai... gi|52426793|gb|CP000010.1| Burkholderia mallei ATCC 23344 c... gi|19909532|dbj|AB014891.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... gi|19909684|dbj|AB014967.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... gi|19909686|dbj|AB014968.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ...

Score E (bits) Value 2252 2228 1848 1509 1495

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Progettazione dei primer per l’amplificazione del gene gyrB 3 sequenze di B. cepacia prese da banche dati + 25 sequenze di altri Proteobatteri quali Bordetella, E.coli,

Neisseria, Nitrosomonas, Ralstonia, Salmonella, Xanthomonas

Dall’analisi del multiallineamento di queste sequenze sono state individuate le regioni conservate del gene

gyrB

Primer per l’amplificazione del gene gyrB E’ STATO COSI’ POSSIBILE DISEGNARE UN SET DI 10 PRIMER. FORWARD

REVERSE

• gyr1

• PC5r

• PC2

• PC6r

• PC3

• PC7r

• PC4

• PC8r • PC9r • PC10r

TEST DEI PRIMER 1 0.2

2 0.4

0.6

3 0.8

5r

4 1

1.2

6r

1.4

gyrB

7r

1.6

9r

8r

1.8

2.0

2.2

10r

2.4 Kbp

TEST DEI PRIMER Ceppo LMG 16654, B. cenocepacia III-B PC5r M

1

2 3 4

PC6r 5

6

7

PC8r

PC9r

8 9 10 11 12 13 14 15 16

M = Marker 1,5,9,13 = gyr1 2,6,10,14 = PC2 3,7,11,15 = PC3 4,8,12,16 = PC4

TEST DEI PRIMER 1 0.2

2 0.4

0.6

3 0.8

5r

4 1

1.2

6r

1.4

7r

1.6

9r

8r

1.8

2.0

2.2

10r

2.4 Kbp

1-5

+

1-6

+

3-9 1-9 4-9

+ +

2-9 1-10

+ + _

Coppia di primer gyr1-PC9r 1

2

3

4

5 6

7

8

9 10 11 12

1)

LMG 1222 gvr I

7)

Mi 5 gvr IV

2)

LMG 18822 gvr II

8)

TVV75 gvr V

3)

LMG 16656 gvr III-A

9)

LMG 18941 gvr VI

4)

LMG 16654 gvr III-B

10) MCI 7 gvr VII

5)

LMG 19230 gvr III-C

11) LMG 16670 gvr VIII

6)

So1 gvr III-D

12) ATCC15958 gvr IX

OTTENIMENTO SEQUENZE Abbiamo ottenuto 69 SEQUENZE del gene gyrB, della lunghezza di circa 1850bp

Genomovar

Sequenze prodotte

Origine

4 FC + 2 A

B. cenocepacia III-A

6 11 6

B. cenocepacia III-B

17

15 FC +2 A

LEGENDA:

B. cenocepacia III-C

2 8 3 3 2 2 2 6

2A

FC = fibrosi cistica

B. cepacia B. multivorans

B. cenocepacia III-D

B. stabilis B. vietnamiensis B. dolosa B. ambifaria B. anthina B. pyrrocinia

10 FC +1 A 6 FC

8 FC 3 FC 1 FC + 2 A 2 FC 1 FC +1 A 2A 4FC + 2A

A = ambientale

Analisi delle sequenze nucleotidiche del gene gyrB gvrI gvrII gvrIII-A gvrIII-B gvrIII-C gvrIII-D gvrIV gvrV gvrVI gvrVII gvrVIII gvrIX

757 668 767 658 751 676 650 760 748 763 788 761

TTGGAAGAGTTCCTGCTTGAAACGCCGATCGACGCGAAGATTATTTGCGGGAAGATTGTT CTCGAGGAGTTCCTCCTCGAAACGCCGAACGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTCGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAGACGCCTATCGACGCAAAGATCATTTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAGACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATTGTT CTCGAAGAATTCCTGCTCGAAACGCCGACCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTCGAGGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGCTCGATGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTTTTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGCTCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC

816 727 826 717 810 735 709 819 807 822 847 820

Polimorfismo puntiforme genomovar specifico

Sono stati individuati più di 400 SNPs e di questi ne sono stati selezionati sei

Localizzazione dei SNPs scelti nella sequenza del gene gyrB Nome gyr1 Posizione 508

PC6r 900

989

1028

1068

1168

PC9r

gyrB

Profili SNuPE attesi Nome gyr1

PC6r

Posizione 508 GvrI GrvII GvrIIIa GvrIIIb GvrIIIc GvrIIId GvrIV GvrV GvrVI GvrVII GvrVIII GvrIX

G G G G G G A G G G G G

900

989

1028

1068

1168

C A A C T A C C C C C C

G A G G G A G G A A G A

A T A A A A A G T A A A

C C C C C C C C C C T C

G G G G G G G G G G G C

PC9r

gyrB

Set di primer per SNuPE Nome LF 1 LF2 LF2(gvr6) LF 3 LF 4 LF 5 LF 6

Sequenza 5’-3’ TTGTCCTT(G/C)GT(T/C)TGCGAGCT TTTTA(C/T)CGCGGCGTCGCGCAGGATCGCGTG TTTTATCGCGGCGTCGCGCAGAATCGGATT (11T)ACCTTCACGGA(G/C)AGCACGCACGACA (6T)CGACGATCTTCCCGCA(A/G)ATGATCTTCGCGTCG (12T)CGTGCTGTGCTTCACGAACAACATTCCGCAGCG (13T)ACAAGTACATC(A/G)CCGA(T/C)AACGAAATCGCGAA GAAGGC

Taglia (basi) 20 30 30 36 38 45 50

SNuPE (simplex) primer LF2

Ceppo TVV75, gvr V

Ceppo LMG16654, gvr III-B

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

C

Nero

Nero

C

Nero

Nero

SNuPE (simplex) primer LF4

Ceppo TVV75, gvr V

Ceppo LMG16654, gvr III-B

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

G

Blu

Blu

A

Verde

Verde

SNuPE (Multiplex)

Ceppo

gvr

Primer

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

LMG 1222

I

Multiplex

G-C-G-A-C-G

B-N-B-V-N-B

B-N-B-V-N-B

SNuPE (Multiplex)

Ceppo

gvr

Primer

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

LMG16656

III-A

Multiplex

G-A-G-A-C-G

B-V-B-V-N-B

B-V-B-V-N-B

SNuPE (Multiplex)

Ceppo

gvr

Primer

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

LMG16654

III-B

Multiplex

G-C-G-A-C-G

B-N-B-V-N-B

B-N-B-V-N-B

SNuPE (Multiplex)

Ceppo

gvr

Primer

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

So1

III-D

Multiplex

G-A-A-A-C-G

B-V-V-V-N-B

B-V-V-V-N-B

SNuPE (Multiplex)

Ceppo

gvr

Primer

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

LMG18942

VI

Multiplex

G-C-A-T-C-G

B-N-V-R-N-B

B-N-V-R-N-B

SNuPE (Multiplex)

Ceppo

gvr

Primer

Nucleotide incorporato

Risultato atteso

Risultato ottenuto

LMG19467

VII

Multiplex

G-C-A-A-C-G

B-N-V-V-N-B

B-N-V-V-N-B

Conclusioni I risultati ottenuti corrispondono a quelli attesi Picchi inequivocabili, assenza di rumore di fondo

Ceppo LMG18942, gvr VI

Applicabilità alla routine clinica