La Fibrosi Cistica La più frequente malattia ereditaria cronica che colpisce indifferentemente i maschi e le femmine appartenenti prevalentemente alla razza bianca Etnia
Incidenza
Freq. eterozigosi
Caucasici
1/2500
1/25 (4%)
Ebrei Ashkenazi
1/3300
1/29
Ispanici (America latina) Africani Americani
1/8000
1/46
1/15000
1/65
Asiatici Americani
1/30000
1/150
Cenni storici • 1936: per la prima volta vengono messi in relazione disfunzioni pancreatiche e respiratorie • 1938: le prime osservazioni anatomo-patologiche in autopsia forniscono una prima descrizione della malattia
• 1953: rilevazione di eccessi di cloruro di sodio nel sudore • 1983: osservazione dettagliata degli epiteli respiratori FC mediante microscopia
• 1989: individuazione della molecola che, se difettata, causa FC: CFTR
Proteina CFTR
“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”
• Superfamiglia dei trasportatori ABC (ATP Binding Cassette) trasporto attivo primario •Proteina trans membrana • 1480 Aminoacidi • Canale per il passaggio di ioni Cloro • Presente negli epiteli secretori: ghiandole sudoripare, naso, bronchi, pancreas, intestino e dotti deferenti.
CFTR: struttura
“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”
• MSD-1 e MSD2: porzioni trans membrana (alfa-eliche idrofobiche) • NBD-1 e NBD-2: domini ATPasici • R: dominio regolatore
CFTR: regolazione
“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”
1) Quando la proteina non lega i cofattori il canale è chiuso da R 2) Quando l’ATP si lega ai domini NBD e la PKA fosforila R il canale è aperto Passaggio di ioni cloro dal lato citosolico a quello extracellulare del plasmalemma
CFTR e Fibrosi Cistica
L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette l’attività secretoria epiteliale
Principali sintomi FC Apparato respiratorio (epitelio polmonare)
•Tosse frequente •Catarro •Stanchezza •Infezioni respiratorie
•Insufficienza pancreatica Apparato digerente
•Maldigestione
(epitelio intestinale)
•Malnutrizione •Occlusioni intestinali
CFTR: mutazioni 1200 mutazioni diverse, con incidenza variabile La mutazione più diffusa nella popolazione caucasica è la ∆F508: Popolaz. anglosassoni: 70% Popolaz. mediterranea: 50% Wild type DNA
GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC
Proteina
Glu
Asn
Ile
Ile
Phe
Gly
Val
Ser
Posizione
504
505
506
507
508
509
510
511
Fibrosi cistica ∆F508 DNA
GAA AAT ATC AT-
--T GGT GTT TCC
Proteina
Glu
Asn
Ile
Ile
Gly
Posizione
504
505
506
507
508
Val 509
Ser 510
CFTR: classi di mutazioni Classe I: sintesi assente della proteina Classe II: compromissione del trasporto intracellulare Classe III: difetti della regolazione (∆F508) Classe IV: alterazioni a livello dei tratti transmembrana che riducono la conduttanza del canale Classe V: mutazioni che non alterano la funzione della proteina ma ne riducono i livelli di sintesi
Gene CFTR
“Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator”
• 250.000 paia di basi • localizzato sul cromosoma 7
Segue il modello dell’eredità mendeliana
Eredità autosomica recessiva Allele CFTR wild type: dominante Allele CFTR “mutato”: recessivo
Chi eredita due copie mutate (Omozigoti) manifesta i sintomi
Chi eredita una sola copia mutata (Eterozigoti) non ha nessun sintomo (Portatore sano)
Diagnosi Test del sudore
Screening neonatale
valutazione di [Na+] e [Cl-] nel sudore
Determinazione della tripsina nel sangue lattasi nel meconio
Diagnosi: test del sudore Stimolazione della sudorazione mediante inoforesi
Condizioni normali [Na+] e [Cl-] < 40 mEq/l Fibrosi cistica [Na+] e [Cl-] > 70 mEq/l
Diagnosi: screening neonatale Saggio immunologico per rilevare la quantità di tripsina Goccia di sangue prelevata in terza giornata
Meconio
I livelli di entrambi questi enzimi risultano aumentati nei pazienti FC per la ridotta funzionalità pancreatica
Determinazione dei livelli di lattasi
CFTR e Fibrosi Cistica
L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette l’attività secretoria epiteliale
Infezioni delle vie respiratorie causate da patogeni opportunisti
Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Burkholderia cepacia complex Haemophilus influenzae Ralstonia pickettii Burkholderia gladioli Alcaligenes xylosoxidans Coenye et al, 2001
Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:
Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
Burkholderia cepacia complex Haemophilus influenzae Ralstonia pickettii Burkholderia gladioli Alcaligenes xylosoxidans
Burkholderia: origine Ambientale: Suolo Rizosfera Acqua
Clinica:
polmone dei pazienti FC
B. cepacia complex: tassonomia A causa dell’alto grado di omologia genomica l’identificazione di questi patogeni risulta molto difficoltosa Genomovar
Specie
I
B. cepacia
II
B. multivorans
III
B. cenocepacia
IV
B. stabilis
V
B. vietnamiensis
VI
B. dolosa
VII
B. ambifaria
VIII
B. anthina
IX
B. pyrrocinia
III-A III-B III-C III-D
Burkholderia cepacia complex (Bcc) La colonizzazione delle vie aeree da B. cepacia e la conseguente infezione polmonare “sindrome da cepacia ” sono la più importante causa di malattia tra i pazienti affetti da Fibrosi Cistica Coenye et al, 2001
Cura: Terapia antibiotica mirata
Identificazione tempestiva del patogeno
Scopo Sviluppo di un test diagnostico rapido per la discriminazione di specie e genomovars di Burkholderia cepacia complex nella routine clinica
Entrambi questi ospedali pediatrici ospitano un Centro Fibrosi Cistica
Microbiologia del Bcc
Biologia molecolare applicata ai microrganismi
AFLP
RAPD
PCR specifiche 16S rDNA 16S rDNA RFLP
Identificazione e/o e/o Identificazione tipizzazione tipizzazione
RFLP del gene recA
Analisi del proteoma Analisi del contenuto in acidi grassi
Test fenotipici
SDS-PAGE
Analisi di restrizione di recA: •amplificazione via PCR di un tratto del gene recA: si ottiene un frammento di circa 1000 pb dai soli batteri del complex utilizzando i primer BCR1 e BCR2 Mahenthiralingam et al, 2000
Prodotto di amplificazione
Elettroforesi su gel di agarosio
Taglio con l’enzima di restrizione HaeIII ed elettroforesi su gel per visualizzare i profili ottenuti: Mahenthiralingam et al, 2000
Gvr x
Gvr y
Gvr z
Si ottengono profili di restrizione diversi per la presenza di polimorfismi puntiformi all’interno della sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione.
LIMITI DELLA TECNICA 9 L’uso del solo HaeIII non consente di distinguere ogni genomovar, ma solo di creare dei pattern di profili di restrizione
Mahenthiralingam et al, 2000
9 Necessità di confrontare un profilo con tutti i profili possibili 9 Disponibilità di una banca di ceppi aggiornata 9 Tempi considerevoli per l’ottenimento dei risultati 9 Necessità che il polimorfismo puntiforme genomovar specifico generi o faccia scomparire un sito di restrizione
SNuPE Single Nucleotide Primer Extension 1. Amplificazione via-PCR di un frammento genico 2. Purificazione del templato di PCR 3. Reazione di estensione del primer specifico con dideossinucleotidi marcati con fluorocromi di colore e peso molecolare diversi 4. Purificazione del prodotto di reazione 5. Elettroforesi capillare con identificazione di colore e posizione del fluorocromo incorporato
STEP PRELIMINARI Analisi delle sequenze del gene scelto alla ricerca di polimorfismi puntiformi (SNP): CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATCGGCTCGAT Specie x CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATTGGCTCGAT Specie y CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATAGGCTCGAT Specie z
Disegno di primer specifici sulla base degli SNP individuati
Amplificazione per PCR della regione contenente il polimorfismo 5’ 3’
T A Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato
3’ 5’
Denaturazione 5’
3’
T
A Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato
3’
5’
Annealing 5’
3’
T
A Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato
3’
5’
Primer extension effettuata sul prodotto di amplificazione 5’
3’
3’
5’
T T A
Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al diverso fluorocromo incorporato
Elettroforesi capillare Si visualizza così un picco di colore diverso a seconda del dideossinucleotide incorporato, di posizione nota in quanto è nota la lunghezza del frammento (primer specifico + 1 ddNTP) GATATCCGCCGGATCGGCTCGATCGCACTG
GATATCCGCCGGATTGGCTCGATCGCACTG
Specie x
I
I Specie y
I GATATCCGCCGGATAGGCTCGATCGCACTG
posizione
posizione
Specie z
posizione
Individuazione di più polimorfismi
0.2 Specie 1
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
A
C
T
G
C
Specie 2 A
G
A
C
T
Specie 3 C
A
G
T
A
Specie 4 G
T
C
A
G
Specie 5 T
A
C
G
T
2.4 Kbp
Progettazione di un set di primer
0.2 Specie 1
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
A
C
T
G
C
Specie 2 A
G
A
C
T
Specie 3 C
A
G
T
A
Specie 4 G
T
C
A
G
Specie 5 T
A
C
G
T
2.4 Kbp
Reazione SNuPE in Multiplex A 0.2
0.4
C 0.6
0.8
T 1
1.2
G 1.4
1.6
C 1.8
2.0
2.2
2.4 Kbp
Specie 1
G 0.2
0.4
T 0.6
0.8
C 1
1.2
A 1.4
Specie 4
1.6
G 1.8
2.0
2.2
2.4 Kbp
Elettroforesi capillare I
A C T G C
posizione
I
GT C A G
posizione
Specie A 1
C
T
G
C
Specie A 2
G
A
C
T
Specie C 3
A
G
T
A
Specie G 4
T
C
A
G
Specie T 5
A
C
G
T
Gene gyrB come marcatore molecolare
Ricerca delle sequenze disponibili nelle banche dati Disponibilità di una sola sequenza dell’intero gene gyrB di B. cenocepacia, ceppo J2315
Allineamento significativo prodotto dalla sequenza: gi|52208053|emb|BX571965.1| Burkholderia pseudomallei strai... gi|52426793|gb|CP000010.1| Burkholderia mallei ATCC 23344 c... gi|19909532|dbj|AB014891.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... gi|19909684|dbj|AB014967.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... gi|19909686|dbj|AB014968.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ...
Score E (bits) Value 2252 2228 1848 1509 1495
0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
Progettazione dei primer per l’amplificazione del gene gyrB 3 sequenze di B. cepacia prese da banche dati + 25 sequenze di altri Proteobatteri quali Bordetella, E.coli,
Neisseria, Nitrosomonas, Ralstonia, Salmonella, Xanthomonas
Dall’analisi del multiallineamento di queste sequenze sono state individuate le regioni conservate del gene
gyrB
Primer per l’amplificazione del gene gyrB E’ STATO COSI’ POSSIBILE DISEGNARE UN SET DI 10 PRIMER. FORWARD
REVERSE
• gyr1
• PC5r
• PC2
• PC6r
• PC3
• PC7r
• PC4
• PC8r • PC9r • PC10r
TEST DEI PRIMER 1 0.2
2 0.4
0.6
3 0.8
5r
4 1
1.2
6r
1.4
gyrB
7r
1.6
9r
8r
1.8
2.0
2.2
10r
2.4 Kbp
TEST DEI PRIMER Ceppo LMG 16654, B. cenocepacia III-B PC5r M
1
2 3 4
PC6r 5
6
7
PC8r
PC9r
8 9 10 11 12 13 14 15 16
M = Marker 1,5,9,13 = gyr1 2,6,10,14 = PC2 3,7,11,15 = PC3 4,8,12,16 = PC4
TEST DEI PRIMER 1 0.2
2 0.4
0.6
3 0.8
5r
4 1
1.2
6r
1.4
7r
1.6
9r
8r
1.8
2.0
2.2
10r
2.4 Kbp
1-5
+
1-6
+
3-9 1-9 4-9
+ +
2-9 1-10
+ + _
Coppia di primer gyr1-PC9r 1
2
3
4
5 6
7
8
9 10 11 12
1)
LMG 1222 gvr I
7)
Mi 5 gvr IV
2)
LMG 18822 gvr II
8)
TVV75 gvr V
3)
LMG 16656 gvr III-A
9)
LMG 18941 gvr VI
4)
LMG 16654 gvr III-B
10) MCI 7 gvr VII
5)
LMG 19230 gvr III-C
11) LMG 16670 gvr VIII
6)
So1 gvr III-D
12) ATCC15958 gvr IX
OTTENIMENTO SEQUENZE Abbiamo ottenuto 69 SEQUENZE del gene gyrB, della lunghezza di circa 1850bp
Genomovar
Sequenze prodotte
Origine
4 FC + 2 A
B. cenocepacia III-A
6 11 6
B. cenocepacia III-B
17
15 FC +2 A
LEGENDA:
B. cenocepacia III-C
2 8 3 3 2 2 2 6
2A
FC = fibrosi cistica
B. cepacia B. multivorans
B. cenocepacia III-D
B. stabilis B. vietnamiensis B. dolosa B. ambifaria B. anthina B. pyrrocinia
10 FC +1 A 6 FC
8 FC 3 FC 1 FC + 2 A 2 FC 1 FC +1 A 2A 4FC + 2A
A = ambientale
Analisi delle sequenze nucleotidiche del gene gyrB gvrI gvrII gvrIII-A gvrIII-B gvrIII-C gvrIII-D gvrIV gvrV gvrVI gvrVII gvrVIII gvrIX
757 668 767 658 751 676 650 760 748 763 788 761
TTGGAAGAGTTCCTGCTTGAAACGCCGATCGACGCGAAGATTATTTGCGGGAAGATTGTT CTCGAGGAGTTCCTCCTCGAAACGCCGAACGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTCGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAGACGCCTATCGACGCAAAGATCATTTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAGACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATTGTT CTCGAAGAATTCCTGCTCGAAACGCCGACCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTCGAGGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGCTCGATGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC CTGGAAGAGTTCCTTTTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGCTCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC
816 727 826 717 810 735 709 819 807 822 847 820
Polimorfismo puntiforme genomovar specifico
Sono stati individuati più di 400 SNPs e di questi ne sono stati selezionati sei
Localizzazione dei SNPs scelti nella sequenza del gene gyrB Nome gyr1 Posizione 508
PC6r 900
989
1028
1068
1168
PC9r
gyrB
Profili SNuPE attesi Nome gyr1
PC6r
Posizione 508 GvrI GrvII GvrIIIa GvrIIIb GvrIIIc GvrIIId GvrIV GvrV GvrVI GvrVII GvrVIII GvrIX
G G G G G G A G G G G G
900
989
1028
1068
1168
C A A C T A C C C C C C
G A G G G A G G A A G A
A T A A A A A G T A A A
C C C C C C C C C C T C
G G G G G G G G G G G C
PC9r
gyrB
Set di primer per SNuPE Nome LF 1 LF2 LF2(gvr6) LF 3 LF 4 LF 5 LF 6
Sequenza 5’-3’ TTGTCCTT(G/C)GT(T/C)TGCGAGCT TTTTA(C/T)CGCGGCGTCGCGCAGGATCGCGTG TTTTATCGCGGCGTCGCGCAGAATCGGATT (11T)ACCTTCACGGA(G/C)AGCACGCACGACA (6T)CGACGATCTTCCCGCA(A/G)ATGATCTTCGCGTCG (12T)CGTGCTGTGCTTCACGAACAACATTCCGCAGCG (13T)ACAAGTACATC(A/G)CCGA(T/C)AACGAAATCGCGAA GAAGGC
Taglia (basi) 20 30 30 36 38 45 50
SNuPE (simplex) primer LF2
Ceppo TVV75, gvr V
Ceppo LMG16654, gvr III-B
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
C
Nero
Nero
C
Nero
Nero
SNuPE (simplex) primer LF4
Ceppo TVV75, gvr V
Ceppo LMG16654, gvr III-B
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
G
Blu
Blu
A
Verde
Verde
SNuPE (Multiplex)
Ceppo
gvr
Primer
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
LMG 1222
I
Multiplex
G-C-G-A-C-G
B-N-B-V-N-B
B-N-B-V-N-B
SNuPE (Multiplex)
Ceppo
gvr
Primer
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
LMG16656
III-A
Multiplex
G-A-G-A-C-G
B-V-B-V-N-B
B-V-B-V-N-B
SNuPE (Multiplex)
Ceppo
gvr
Primer
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
LMG16654
III-B
Multiplex
G-C-G-A-C-G
B-N-B-V-N-B
B-N-B-V-N-B
SNuPE (Multiplex)
Ceppo
gvr
Primer
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
So1
III-D
Multiplex
G-A-A-A-C-G
B-V-V-V-N-B
B-V-V-V-N-B
SNuPE (Multiplex)
Ceppo
gvr
Primer
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
LMG18942
VI
Multiplex
G-C-A-T-C-G
B-N-V-R-N-B
B-N-V-R-N-B
SNuPE (Multiplex)
Ceppo
gvr
Primer
Nucleotide incorporato
Risultato atteso
Risultato ottenuto
LMG19467
VII
Multiplex
G-C-A-A-C-G
B-N-V-V-N-B
B-N-V-V-N-B
Conclusioni I risultati ottenuti corrispondono a quelli attesi Picchi inequivocabili, assenza di rumore di fondo
Ceppo LMG18942, gvr VI
Applicabilità alla routine clinica