Lezione 1

Calendario del corso Mese

Giorno

8.30-10.30

Ottobre

LUN 1

Lezione

Ottobre

VEN 5

Ottobre

LUN 8

Ottobre

VEN 12

Ottobre

LUN 15

Ottobre

VEN 19

Ottobre

LUN 22

Ottobre

VEN 26

Ottobre

LUN 29

Novembre

VEN 2

Novembre

LUN 5

Novembre

VEN 9

Novembre

LUN 12

Novembre

VEN 16

Novembre

LUN 19

8.30-11.30

14.00-17.00

Lab A Lezione

Lab A Lab B

Lezione

Lab B Lab A

Lezione

Lab A Lab B

Lezione

Lab B Lab A

Lezione

Lab A Lab A

Lezione

Lab B Lab B

Lezione

ATTENZIONE – Le esercitazioni si svolgeranno presso i Laboratori Didattici di Viale Morgagni. Gli studenti lavorano a gruppi di 3 persone: portare camice, un pennarello indelebile a punta fine e un righello.

Scopo del corso Fornire una preparazione teorica e pratica (esperienze di laboratorio) delle:  tecniche di base del laboratorio microbiologico.  problematiche riguardanti l’isolamento, la caratterizzazione e la classificazione di microrganismi.

Ricevimento studenti, per appuntamento: E-mail: Telefono:

[email protected] 055 22 88 245

Testi consigliati: 

Madigan, Martinko, Parker – BROCK. BIOLOGIA DEI MICRORGANISMI – Casa Editrice Ambrosiana 2003



Perry, Staley, Lory – MICROBIOLOGIA - Zanichelli 2004

 Seeley, Vandemark, Lee – LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA - Zanichelli 1995

Argomenti dei laboratori Laboratorio 1a.

Preparazione piastre terreno solido. Analisi microbiologica di un campione di suolo: procedure di isolamento su piastra e conteggio cellule vitali, utilizzo di condizioni selettive.

Laboratorio 1b.

Valutazione risultati Laboratorio 1a.

Laboratorio 2a.

Colorazione di Gram, colorazione spore. Incrocio di lievito Saccharomyces cerevisiae.

Laboratorio 2b.

Valutazione risultati dell’incrocio. Ciclo vitale del lievito S. cerevisiae: osservazioni microscopiche di lieviti in differenti fasi del ciclo.

Laboratorio 3a.

Antibiogramma. Misurazione della crescita microbica mediante determinazione della densità ottica.

Laboratorio 3b.

Valutazione risultati antibiogramma. Costruzione della curva di crescita.

Particolarità dei microrganismi

Per la maggior parte degli organismi animali e vegetali è possibile (e spesso semplice) lo studio in situ. I microrganismi difficilmente possono essere studiati nel loro ambiente naturale; la coltivazione in laboratorio è perlopiù la norma.

Studio microrganismi in laboratorio 

Isolare il microrganismo d’interesse da tutti gli altri che sono presenti nello stesso sito.

 Coltivare i microrganismi in laboratorio: trovare condizioni favorevoli. La coltivazione avviene come coltura pura. Cosa è una coltura pura? Come la otteniamo? Infine, è necessario caratterizzare (dal punto di vista morfologico, genetico, metabolico, fisiologico, ecologico, molecolare, ecc.) il microrganismo. Il processo di caratterizzazione porta anche alla identificazione del microrganismo. 

Lavorare con i microrganismi in laboratorio: norme generiche  pulizia: prima di iniziare a lavorare bisogna lavarsi le mani (con saponi particolari) e disinfettare il banco di lavoro;

 evitare la formazione di correnti d’aria;

 evitare di parlare, tossire, starnutire mentre si trasferiscono batteri da un terreno ad un altro.

La manipolazione dei microrganismi: cappe sterili TIPO DI CAPPA Flusso laminare orizzontale

Flusso laminare verticale

PROTEZIONE

IMPIEGHI

campione

preparazioni sterili, es. terreni per microbiologia

operatore campione

materiale non patogeno, colture cellulari

Lavorare con i microrganismi in laboratorio: norme particolari La manipolazione dei microrganismi avviene utilizzando la cosiddetta tecnica asettica, asettica che prevede tre fasi: •

sterilizzare i terreni e gli strumenti con cui i microrganismi vengono in contatto;

•

prelevare sterilmente il microrganismo;

•

trasferire sterilmente il microrganismo.

La sterilizzazione di terreni in autoclave L'autoclave  ci  permette  di  sterilizzare  mediante  calore  umido  a  temperature  superiori  a  100  °C  .  Il  vapore  è  il  vettore  di  calore,  quindi il vapore deve circolare liberamente dentro l’autoclave. P•V=R•T P = 1.1 kg/cm2; T = 121ºC tempo necessario circa 15 min Assicura  l'uccisione  di  tutte  le  forme  viventi,  incluse  le  endospore.  Impiegata perlopiù per sterilizzare contenitori in vetro vuoti o contenenti acqua, soluzioni e terreni di coltura in brodo o agarizzati, purchè privi di sostanze deperibili ad alte temperature (siero).

La sterilizzazione degli strumenti di lavoro L’ansa oppure l’ago per prelievi vengono passati sopra la fiamma di un becco Bunsen, inclinati a circa 60°, fino a che l’intero filamento diventa incandescente (arancione). Fino al suo utilizzo, l’ansa sterile non deve essere né toccata né poggiata sul piano per non contaminarla, ma prima di usarla va raffreddata.

Anse e aghi per inoculi

Becco Bunsen

Sterilizzazione dell’ansa

Sempre più spesso si utilizzano strumenti sterili monouso.

Il prelievo dei microrganismi.

•

Da una piastra di coltura (capsula di Petri)

•

Da un brodo di coltura (in provetta o beuta)

a. Prelievo da una piastra di coltura e trasferimento in una provetta 1

1.

Sterilizza l’ansa.

3.

-

2

Solleva il coperchio quanto basta per inserire l’ansa all’interno della piastra con il microrganismo,

- raffredda l’ansa affondando la punta incandescente nell’agar, lontano dalle zone di crescita batterica, -

asporta con l’ansa un piccola quantità di massa batterica.

-

chiudi il coperchio della piastra e poi……………

….trasferisci le cellule del microrganismo nella provetta con il terreno di coltura sterile. Prendi il contenitore contenente il terreno liquido, togli il tappo senza poggiarlo.

3

Inocula il terreno di coltura con le cellule del microrganismo .

5

Flamba brevemente il bordo della provetta.

4

Rimetti il tappo e …. Flamba nuovamente il bordo della provetta. ….sterilizza l’ansa! 6

7

b. Prelievo da un brodo di coltura e trasferimento in piastra 1. La provetta con la coltura in una mano, nell’altra, come se fosse una penna, l’ansa sterile. Rimuovi il tappo dalla provetta tenendolo con la stessa mano che tiene l’ansa. Passa brevemente il bordo della provetta sulla fiamma (flambare). Questo crea una corrente convettiva che forza l’aria fuori dalla stessa e previene l’entrata di contaminanti.

B

A

2. Inclina la provetta, inserisci l’ansa e preleva un piccolo volume di coltura.

3. Flamba il bordo

(1) Riscalda il filamento nella fiamma fino a che diventa rosso e (2) lascia raffreddare.

2

3

della provetta.

2

4. Alza il coperchio della piastra e striscia l’ansa sulla superficie dell’agar per trasferire il microrganismo.

1

1

Sterilizza l’ansa

5. Risterilizza l’ansa. 4

VIDEO AscepticTransfers.mov

Coltura pura

Definizione di coltura pura, coltura clonale e ceppo Una coltura pura è formata da cellule di un microrganismo tutte identiche tra loro. Una coltura clonale, o clone, è ottenuta dalla moltiplicazione di una singola cellula del microrganismo, ed è perciò sicuramente una coltura pura. Quando ad una coltura pura viene assegnato un codice identificativo si parla di ceppo. Un ceppo viene conservato in laboratorio e/o depositato in una banca di microrganismi (ceppoteca).

Come si ottengono colture pure

La procedura di isolamento Per ottenere una coltura pura bisogna separare l’una dall’altra singole cellule (procedura di isolamento). Soltanto se otteniamo colture che sono generate dalla crescita di una singola cellula abbiamo la certezza che queste siano colture pure.

Coltura monocitogenetica I microrganismi sono molto piccoli ed è quindi molto difficile “maneggiarli”, ma è comunque possibile con l’ausilio di un microscopio e di un micromanipolatore. Se prendiamo fisicamente una singola cellula, la separiamo da altre cellule vicine e la trasferiamo in un terreno di coltura libero da altre forme viventi, dalla sua crescita otteniamo una coltura monocitogenetica.

Micromanipolatore al laser Un raggio laser esercita sulla cellula delle forze radianti che permettono di trascinarla in una qualunque direzione.

Isolamento di coltura pura su piastra scopo: separare da una sorgente di microflora mista (per es., campione ambientale) colonie pure di microrganismi (cioè provenienti dalla riproduzione di singole cellule). •

Metodo dello striscio su piastra (o per spandimento con ansa - streak-plate method).

•

Metodo di diffusione su piastra (o piastramento di superficie).

•

Metodo di inclusione in piastra.

1. Isolamento mediante striscio su piastra

2. Metodo di diffusione su piastra (piastramento) Una piccola quantità del campione (in genere 0,1 ml) viene posta sulla superficie della piastra e poi distribuita uniformemente mediante un’ansa sterile o palline di vetro o plastica sterili. Se sufficientemente diluite le cellule cresceranno in colonie ben isolate.

3. Metodo di inclusione in piastra Il terreno viene inoculato mischiando insieme il campione e il terreno agarificato mentre è ancora liquido (45 °C). Dopo aver mischiato bene si versa il contenuto della provetta in piastra. Le colonie si sviluppano all’interno del terreno, e non sulla superficie. POUR PLATING

AGAR “OVERLAY”

Poiché lo scopo di queste procedure è di ottenere colonie isolate (colture pure o clonali) di un dato microrganismo, è bene notare che:  Su piastre ricche di colonie queste tendono ad essere molto piccole e si distinguono male perché le crescite convergono.  Le colonie ben isolate sono di solito più grandi con forma, configurazione, colore e trama ben definite.  Le colonie che crescono in superficie sono più grandi e usualmente circolari, mentre quelle che si sviluppano in profondità sono più piccole e la loro forma è limitata dall’agar. 

In popolazioni batteriche miste alcune specie sono presenti con un numero limitato di individui, con il rischio che su piastre diluite non siano rappresentate. Particolari tecniche d’isolamento possono risolvere, almeno in parte, questo problema.

VIDEO Streaking - Filmato streaking.mov