Lezione 8

LA CLONAZIONE ANIMALE

Dr. Wilmut & Dolly

Si effettua per TRASFERIMENTO NUCLEARE PROCEDURA: 1) ENUCLEAZIONE di un oocita maturo non fertilizzato in fase G0 o metafase II per aspirazione del nucleo (CITOPLASTO) 2) TRASFERIMENTO NUCLEARE: si effettua per MICROINIEZIONE del nucleo o per ELETTROFUSIONE dell’intera cellula somatica con il citoplasto

Nucleo donatore

Cellula ES (blastocisti)

indifferenziata

Cellula somatica di adulto 3) Un impulso elettrico dà lo stimolo per iniziare la divisione 4) Verifica in coltura della vitalità degli embrioni 5) Impianto in un utero ricevente

a) DEPROGRAMMAZIONE: incubazione in un terreno povero di nutrienti: la cellula spegne l’espressione dei geni b) RIPROGRAMMAZIONE: i fattori citosolici del citoplasto riprogrammano i geni del nucleo somatico per la totipotenza

from Time Magazine, March 10, 1997

Dolly con la madre in affitto

a) Cellule embrionali (SEC1) (da disco embrionale di un embrione di 9 gg.) b) Fibroblasti fetali (BLWF1) (da un feto di 26 gg)) c) Cellule mammarie (OME)

IN CHE MODO SI E’ VERIFICATO CHE DOLLY FOSSE VERAMENTE UN CLONE?

SI E’ UTILIZZATO Il FINGERPRINTING DEL DNA ATTRAVERSO L’ANALISI DI MARCATORI MICROSATELLITARI

CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

Polimorfismi SHORT TANDEM REPEATS (STR): sono collocati in locus altamente polimorfici: esistono tanti alleli per ogni singolo locus Un profilo polimorfico permette di identificare in maniera univoca un individuo

COME SI INDIVIDUA UN POLIMORFISMO STR?

1)

Screening di una library genomica a inserti piccoli (≈ ≈1000bp) con una sonda (CA)n

2)

Sequenza del clone/i positivo/i utilizzando come primer di innesco (CA)n ed il complementare (TG)n. in questo modo si determina la sequenza delle zone che fiancheggiano l’STR

3)

Si verifica che le zone fiancheggiatrici all’STR siano uniche nel genoma tramite FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) a) b) c) d)

Arresto delle cellule in metafase Fissazione delle cellule su vetrino Denaturazione del DNA Ibridazione con la sonda fluorescente

4) Mediante PCR con primers che ibridano le regioni fiancheggianti l’STR si analizzano gli amplificati ottenuti da individui diversi

Non costituisce polimorfismo

Costituisce polimorfismo

Clone 6LL3

SEC-1

OME

BLWF1

PROBLEMI CON LA CLONAZIONE SOMATICA?

-277 cellule enucleate -248 cellule morte dopo il trasferimento nucleare -16 morte prima dell’impianto in utero -13 impiantate

1 Dolly

Yanagimachi, R. 2002. "Cloning: experience from the mouse and other animals." Molecular and Cellular Endocrinology. 21 March, 187.

Specie

N°° di oociti usati

topo

2468

31 (1.3%)

440

6 (1.4%)

2 morti quasi subito 11 morti entro 6 mesi

N°° di nati vivi

Note -

1)

LA RESA E’ MOLTO BASSA

bovino

2)

I CLONI CHE ARRIVANO A TERMINE SPESSO SOFFRONO DI DIFETTI GIA’ ALLA NASCITA

pecora

417

14 (3.4%)

maiale

977

5 (0.5%)

-

capra

285

3 (1.1%)

-

3) I CLONI CHE SOPRAVVIVONO FINO ALL’ETA’ ADULTA SEMBRANO INVECCHIARE PIU’ RAPIDAMENTE DEL NORMALE

-Accorciamento dei telomeri -Altre modificazioni del DNA correlate all’invecchiamento (es: metilazione del DNA e/o perdita di proteine associate al DNA -Mutazioni accumulate nella vita di un animale possono essere silenti nell’individuo adulto, ma causare uno scorretto sviluppo embrionale

4) I CLONI NON SONO COPIE ESATTE

Rainbow

Copycat

-DNA mitocondriale diverso -Fenomeni epigenetici (es: inattivazione dell’X) -Fattori ambientali e sociali

E LA CLONAZIONE UMANA?

-I geni nucleari umani si attivano più precocemente (4 cellule) che in bovini e ovini (8 cellule): tempo insufficiente per la riprogrammazione del nucleo somatico? -Nelle scimmie la rimozione del nucleo rimuove anche componenti importanti del centrosoma. Le mitosi possono essere non corrette a causa di difetti del fuso che portano ad aneuploidia

http://www.clonaid.com/

Clonaid è stata fondata dai membri di una setta religiosa chiamata “the Raelians”. Nel 2002 Clonaid dichiarò di avere clonato Eva, da una cellula di cute di sua “madre”. Essi si sono tuttavia rifiutati di effettuare test, sia per provare la natura di clone di EVa, sia la sua esistenza.

Originally published in Science Express on 12 February 2004 Science 12 March 2004: Vol. 303. no. 5664, pp. 1669 - 1674 DOI: 10.1126/science.1094515 Prev | Table of Contents | Next Reports

Dr Moon

This article has been retracted Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst

Per poter effettuare diagnosi e prognosi di patologie ereditarie è necessario conoscere la sequenza del gene responsabile

L’IDENTIFICAZIONE DI GENI RESPONSABILI DI MALATTIE GENETICHE

SI CONOSCONO LE BASI METABOLICHE (BIOCHIMICHE) DELLA MALATTIA

Screening di una library con: a) b) c)

Oligonucleotidi degenerati EST Sonde ottenute da specie affini

NON SI CONOSCE IL DIFETTO BIOCHIMICO DELLA MALATTIA

CLONAGGIO POSIZIONALE

IL CLONAGGIO POSIZIONALE Permette di arrivare ad identificare un gene responsabile di un fenotipo mutato, partendo dalla attribuzione del gene ad una regione ristretta di un cromosoma

INGREDIENTI:

1)

PEDIGREE di famiglie affette dalla patologia e relativo materiale genetico

2)

MARCATORI POLIMORFICI: polimorfismi la cui posizione all’interno del genoma (locus) è nota

3)

GENOTECHE GENOMICHE AD INSERTO GRANDE

ATTRIBUZIONE DELLA POSIZIONE DEL GENE RESPONSABILE DELLA PATOLOGIA AD UNA REGIONE PARTICOLARE DEL DNA

Gene recessivo associato al cromosoma X

Si analizza la associazione tra soggetti affetti e alleli di marcatori polimorfici

Determinazione del cromosoma su cui è localizzato il gene Avvicinamento al gene utilizzando marcatori specifici per il cromosoma individuato: maggiore è l’associazione (minori crossing over), minore è la distanza

Delimitazione di una zona compresa tra due marcatori

CORRELAZIONE DELLA MAPPA FISICA CON QUELLA GENETICA PER LOCALIZZARE LA POSIZIONE APPROSSIMATIVA DEL GENE DI INTERESSE.

Screening di una Library a inserti genomici grandi per la ricerca del clone positivo per i marcatori polimorfici

Determinazione della sequenza

RICERCA DELLE SEQUENZE ESONICHE

La presenza di isole CpG può indicare la prossimità di geni trascritti

Taglio con enzimi che riconoscono siti ricchi in C e G

oppure si isola direttamente il gene da una library a cDNA mediante la SELEZIONE DEGLI IBRIDI

LA SELEZIONE DEGLI IBRIDI

clone genomico selezionato grazie ai marcatori

Scelta da un tessuto che si pensa sia arricchito per l’espressione del gene Cercato. cDNA = solo esoni

Primers che fiancheggiano l’inserto di cDNA

CLONAZIONE POSIZIONALE DEI GENI CANDIDATI

BANCHE DATI

Una volta individuato il possibile gene, bisogna determinare se esso è effettivamente mutato nei soggetti affetti:

La SSCA (Analisi Conformazionale del Singolo Filamento)

La differenza anche di una singola base può causare, nel DNA a singolo filamento, una diversa configurazione tridimensionale, che comporta una diversa mobilità elettroforetica

sequenziamento

STUDIO DELLA FUNZIONE DELLA PROTEINA

LA TERAPIA GENICA ovvero il trasferimento genico come sistema per la correzione di difetti genetici causa di malattie

-AL MOMENTO E’ APPLICABILE ALLE SOLE CELLULE SOMATICHE -MALATTIE GENETICHE IDEALI SONO QUELLE CARATTERIZZATE DA UNA O PIU’ bMUTAZIONI A CARICO DI UN SOLO GENE -NECESSITA’ DI ELABORARE UNA STRATEGIA PER OGNI DIVERSA TERAPIA GENICA

LE FASI DELLA SPERIMENTAZIONE FASE PRECLINICA: prevede la sperimentazione in vitro e su animali

FASE I: trattamento di pochi individui umani sani per valutare gli effetti generali della terapia (sicurezza) FASI CLINICHE

FASE II: la terapia viene provata in un campione leggermente più ampio di individui affetti dalla patologia, per verificarne la sicurezza e l’efficacia FASE III: la terapia viene testata su un ampio campione di soggetti affetti, confrontando i benefici con quelli di terapie convenzionalmente usate per il tipo di patologia

APPROVAZIONE

TERAPIA GENICA

EX VIVO Il trasferimento genico viene effettuato al di fuori del paziente

IN VIVO Il trasferimento genico viene effettuato direttamente nel paziente

Per il trasferimento genico si usano vettori virali ad ampio spettro, di tipo NON litico (RETROVIRUS DIFETTIVI)

Cellule ideali da trattare sono quelle Ad ampio potenziale proliferativo (es: cellule staminali, cellule di midollo osseo

SCID TALASSEMIA ANEMIA FALCIFORME

VETTORI VIRALI

TERAPIA GENICA

TRASFERIMENTO GENICO IN COLTURE CELLULARI

Non devono replicarsi nell’ospite quando

-non si riescono ad ottenere trasfettati stabili (invecchiamento cellulare) -l’efficienza di trasfezione in transiente è troppo bassa

I RETROVIRUS nella terapia ex vivo Non lisano le cellule

Hanno largo spettro di specificità di cellula ospite

Per l’usi in terapia, si devono usare retrovirus DIFETTIVI

Occorrono delle STRATEGIE DI SICUREZZA per evitare la propagazione incontrollata del virus. Si devono costruire dei RETROVIRUS DIFETTIVI, cioè non in grado di costruire strutture di incapsulamento

Ψ+ :sequenza segnale per il packaging nel plasmide

pol: geni per enzimi (I, RT) env: gene per la proteina dell’involucro

-clonazione del DNA retrovirale in plasmide -eliminazione dei geni pol ed env -mantenimento della regione di gag che contiene Ψ+

Gene funzionante

CELLULE IMPACCHETTATRICI: servono per fornire al retrovirus ricombinante le proteine strutturali in un sito del genoma hanno integrato LTR5’-gag-pol-LTR3’ ∆Ψ+ in un altro sito LTR5’-env-LTR3’

Integrati nel DNA delle cell. impacchettatrici

COSTRUZIONE DI UN VETTORE RETROVIRALE RICOMBINANTE ED INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA

TERAPIA GENICA EX VIVO PER IL TRATTAMENTO DELL’EMOFILIA

TERAPIA GENICA IN VIVO Introduzione diretta di un gene correttivo nelle cellule di un tessuto specifico di un paziente

Le proteine dell’envelope riconoscono specifiche proteine di superficie

I VETTORI RETROVIRALI

SONO POCO SPECIFICI

PSEUDOTIPIZZAZIONE

Sostituzione dell’env con quello di un virus più selettivo

INFETTANO SOLO CELLULE IN PROLIFERAZIONE

UTILIZZO DI PROMOTORI TESSUTO-SPECIFICI PER IL GENE BERSAGLIO

Creazione di env con caratteriestiche diverse e selezione dei virus con le caratteristiche più vantaggiose

ALTA EFFICIENZA DI INFEZIONE

VETTORI DERIVATI DALL’ADENOVIRUS (a DNA)

-Infetta molto bene le cellule della mucosa respiratoria -Infetta anche cellule quiescenti (neuroni, cuore) -Non si integra nel genoma (espressione limitata)

Trattamento della fibrosi cistica con il ripristino del gene CFTR

VETTORI DERIVATI DAL VIRUS ASSOCIATO ALL’ADENOVIRUS (AAV)

-Non è patogeno -Si integra in un sito specifico del cromosoma 19 -Per riprodursi necessita di un virus helper (es: adenovirus) -E’ poco capiente

VETTORI DERIVATI DAL VIRUS DELL’HERPES SYMPLEX tipo1: infettano solo cellule neuronali quiescenti

SISTEMI ALTERNATIVI ALLA TERAPIA GENICA MEDIANTE RIPRISTINO GENICO

IL GANCICLOVIR E LA TK DELL’HSV

EFFETTO BYSTANDER + fagocitosi

RIVEDIAMO IL MECCANISMO DI SPLICING

LA TERAPIA CORRETTIVA PER MEZZO DI OLIGONUCLEOTIDI AS CHE INTERVENGONO SULLO SPLICING DEL pre-RNAm

A causa di mutazioni puntiformi possono comparire siti di splicing criptici all’interno di un introne: Si possono avere mutazioni per scivolamento, con inserimento di aminoacidi sbagliati, o non senso, con comparsa di codoni non stop

Es: Il caso della β-talassemia Il gene della β -globina è piccolo, ma deve essere obbligatoriamente regolato dalle sequenze regolatrici endogene, poiché la proteina deve essere prodotta in maniera stechiometricamente corretta nei confronti delle catene dell’ α-globina. Tutta la cassetta è troppo grande per essere contenuta in un vettore di ripristino.

stop

LO SKIPPING (salto) DELL’ESONE NELLA CURA DELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE

DISTROFINA: 427kDa

codificata dal gene dys (Xp21.1)

2,25 Mbp 7 promotori diversi

4 muscolo (distrofina HMW)

3 altri tessuti

79 esoni

99,4% introni

(isoforme LMW) RNAm 17kDa

Molte mutazioni consistono in piccole delezioni/inserzioni negli esoni, che portano ad uno spostamento nella griglia di lettura con comparsa di prematuri codoni di stop

MANCANZA DEL DOMINIO Ct Distrofia di becker: distrofina con delezione interna, ma con dominio Ct: forma molto meno grave

TOPO mdx Ha una mutazione “non senso” nell’esone 23

Nuovo splicing

c

Mdx + as 2gg

mdx

Mdx + as 14 gg