Lezione 4

LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON DNA PLASMIDICO

In realtà l’efficienza è bassa

50/50?

METODO PER ARRICCHIRE IN PLASMIDI MUTAGENIZZATI

NaOH

Klenow+T4+lig

LA MUTAGENESI CASUALE CON INNESCHI OLIGONUCLEOTIDICI DEGENERATI

Permette di generare tutti i possibili cambiamenti di un amminoacido in un certo sito Si usa quando non sono note le sostituzioni in grado di modificare la proteina bersaglio

VANTAGGI Non è necessario conoscere in dettaglio il ruolo di particolari aminoacidi nel funzionamento di una proteina Si possono ottenere mutanti inattesi dotati di proprietà utili, poiché vengono sostituiti più amminoacidi

Problema nell’utilizzo di vettori di espressione per procarioti per la produzione di proteine da cDNA

Difficoltà nell’eseguire determinate modificazioni post-traduzionali (glucosilazione= addizione di zuccheri a ser o asn addizioni agli aminoacidi all’interno della proteina = fosforilazione, acetilazione, carbossilazione γ, miristilazione, palmitilazione )

Si deve ricorrere a sistemi di espressione eucariotici

lievito

cellule di insetto

cellule di mammifero

La produzione di proteine ricombinanti nelle cellule eucariote permette: -Di avere la produzione di proteine a partire da DNA contenente introni -Di avere le corrette modificazioni post-traduzionali Formazione di legami disolfuro Processazione proteolitica Glucosilazioni Addizioni agli aa all’interno delle proteine -Di studiare il ruolo biologico di una proteina

niente

Un generico vettore di espressione per cellule eucariote

Elementi per la costruzione e per la propagazione in E.coli:

Elementi per l’espressione del gene nella cellula eucariota:

ORIE marcatore di selezione (Ampr) multicloning site (CS)

promotore segnale di arresto e di poliA Elemento per la replicazione in cellule eucariote (facoltativo): ORIeuk Marcatore di selezione per cellule eucariote (con p e t)

Saccharomyces cerevisiae

Vantaggi -E’ innocuo -Facile da coltivare -Se ne conosce perfettamente la genetica -Si ottengono facilmente mutanti -Riesce a fare alcune modificazioni post-traduzionali -Secerne poche proteine proprie (agevolazione nel recupero) -Esiste un plasmide che cresce nel lievito

Alcuni vettori di clonazione ed espressione per lievito

(non ha ORI per lievito)

Ha l’ORI di 2µm

Ha l’ARS e il centromero

Un derivato del plasmide 2µm

Terminazione e poliA Marcatore di selezione

promotore

Grazie alla possibilità di avere facilmente mutanti per vie metaboliche importanti, come marcatori si usano geni codificanti enzimi per il ripristino delle stesse

L’esportazione all’esterno del lievito, oltre a favorire il recupero delle proteine, aiuta ad effettuare alcune modificazioni post-traduzionali, come le glicosilazioni

METODO PER INDURRE LA SECREZIONE DELLA PROTEINA BERSAGLIO

DNA per il Peptide leader

codoni per Lys-Arg

Peptide leader: peptide segnale per l’esportazione del Fattore α1 del tipo coniugativo del lievito

Lys-Arg: dipeptide riconosciuto da un’endopeptidasi del lievito

Durante l’esportazione la proteina subisce le modificazioni posttraduzionali

gene estraneo

Alcune proteine di interesse applicativo per l’uomo prodotte in S. cerevisae

Svantaggi: -Poco efficiente nello splicing (cDNA) -Può effettuare delle errate modificazioni post-traduzionali (es. iperglicosilazioni)

I Vettori di Espressione per cellule di insetto: il BACULOVIRUS

Cellule mesenteriche di Spodoptera frugiperda

Il BACULOVIRUS (AcMNPV): fornisce le sequenze necessarie per la produzione di una proteina in cellule di insetto

Virus della Poliedrosi Nucleare Multipla

Autographa californica

Larva deceduta per Infezione da MNPV

Diffusione del baculovirus durante lo sviluppo larvale Tracciante: gfp

Il ciclo vitale del BACULOVIRUS

FORMA INFETTIVA (fase precoce)

FORMA DI RESISTENZA (fase tardiva)

Il virione infetta una cellula. Si moltiplica. L’infezione si diffonde alle cellule adiacenti

I virioni formano un POLIEDRO= virioni intrappolati nella POLIEDRINA Le cellule si lisano e la larva muore

FASE PRECOCE

poliedri FASE TARDIVA

Virioni occlusi nella poliedrina

La POLIEDRINA è sotto controllo di un PROMOTORE eccezionalmente FORTE eTARDIVO: inizia a funzionare dopo 36-48 ore e continua fino a 4-5 giorni dall’infezione.

Si elimina il gene della poliedrina e si sostituisce col gene eterologo mediante “Gene Targeting”

Organizzazione dell’unità di espressione di un vettore di trasferimento del baculovirus

Pp = promotore Pt = terminatore e poliA cs = sito di clonaggio

Si tratta di un vettore navetta propagabile in E. coli

Sequenze a monte e a valle del gene della poliedrina

COSTRUZIONE DI BACULOVIRUS RICOMBINANTI

Le placche di lisi del virus ricombinante sono riconoscibili

Alcune proteine ricombinanti di interesse applicativo per l’uomo prodotte in cellule di insetto

I vettori di espressione per cellule di MAMMIFERO

VETTORI PLASMIDICI: -produzione -studio della funzione delle proteine

VETTORI VIRALI: -studio della funzione delle proteine -terapia genica

IN NATURA NON ESISTONO PLASMIDI SPECIFICI PER LE CELLULE DI MAMMIFERO Devono essere costruiti artificialmente

I PLASMIDI COME VETTORE DI ESPRESSIONE PER CELLULE DI MAMMIFERO

CONTENGONO:

A

Elementi per la costruzione e per la propagazione in E.coli:

Regione di controllo dei geni

ORIE marcatore di selezioneE (Ampr) multicloning site

Promotori,elementi a monte del promotore ed enhancers Segnali di terminazione e di poliA Segnali di splicing

B

Una o più unità di trascrizione che vengono espresse solo in cellule di mammifero

ORI

EUK

DNA non codificante

(facoltativo)

Marker di selezione EUK Gene estraneo

DNA codificante

MODULO DI ESPRESSIONE RICONOSCIUTO DALLE CELLULE DI MAMMIFERO CHE CONTIENE TUTTI GLI ELEMENTI RICHIESTI PER L’ESPRESSIONE DEL DNA ESOGENO

REGIONE DI CONTROLLO DEI GENI : Brevi sequenze di DNA che interagiscono con specifiche proteine cellulari coinvolte nella trascrizione

TATA box

Promotore:

Elementi a monte del promotore

Assemblaggio dei fattori di inizio della trascrizione e dell’RNApolII

Fino a -200 bp dalla TATA BOX Controllano l’efficienza di utilizzo della stessa

Enhancer

Possono essere localizzate anche a migliaia di bp dal gene che controllano (a monte, a valle, dentro gli introni)

Aumentano la trascrizione di un gene anche di 1000 volte

Agiscono indipendentemente dall’orientamento

Possono essere inducibili (da ormoni, metalli, ecc.)

Le sequenze che regolano l’accesso dell’RNApolII alla TATA box delle cellule di mammifero possono essere cellulo-specifiche o poco forti. Si possono però utilizzare per i vettori quelle di virus che infettano cellule di mammifero: SONO POTENTI E POCO SPECIFICHE

pSV40

SP1

SV40

LTR

VIRUS DEL SARCOMA DI ROUS

Citomegalovirus

pCMV

Sequenze non codificanti in 3’: -Si rimuovono nel DNA genomico (destabilizzanti) -Non sono presenti nei cDNA

Sito di poli-Adenilazione

Sito di terminazione:

l’endogeno si può trovare anche a centinaia di basi dal sito di poliA

VANNO INSERITE NEL VETTORE a valle dell’MCS

Segnale di Splicing

L’RNAm esce complessato con una serie ordinata di proteine Che ne indicano la corretta maturazione, tra cui proteine che si dispongono alla giunzione tra esoni. Solo in questo modo il complesso del poro lo riconosce e può attraversare il poro nucleare.

Le proteine legate all’RNAm che marcano eventi di splicing corretti funzionano da Fattori di esportazione dell’RNAm

ORIEUK: permette la replicazione episomale ANCHE TUTTE QUESTE SEQUENZE VENGONO PRESE DA VIRUS CHE INFETTANO LE CELLULE DI MAMMIFERO

MARCATORI DI SELEZIONE PER CELLULE DI MAMMIFERO 1) ENZIMI PER IL RIPRISTINO DI VIE METABOLICHE INTERROTTE

Si usa per cellule TK-/- o HPRT-/-

Timidina cinasi (TK di HSV) Oppure Ipoxantina Guanina Fosforibosil Trasferasi (HPRT)

Sono enzimi che permettono la sintesi dei nucleotidi derivati dalla timidina (TK) o dalla Ipoxantina (HPRT) attraverso la via di sintesi di “emergenza”, quando la via “de novo” è bloccata dalla Amminopterina. Se espressi in cellule difettive, ne Permettono la crescita selettiva in terreno HAT (Ipoxantina, Amminopterina, Timidina)

2) MARCATORI DI ORIGINE BATTERICA PER LA RESISTENZA AD ANTIBIOTICI neor: Aminoglicoside-fosfotrasferasi (APH): inattiva il G418, inibitore di sintesi proteica

hygr:

conferisce la resistenza all’Igromicina

TRASFEZIONE: STABILE O TRANSIENTE?

Transitoria: Si usa per saggi a breve termnine o quando non è possibile ottenere cloni stabili

Stabile: si usa quando si devono fare esperimenti di lunga durata, quando si vuole maggiore riproducibilità quando l’efficienza di trasfezione in transiente è troppo bassa.

E’ necessario un marcatore di selezione. Non è necessario un ORIeuk

CLASSIFICAZIONE IN BASE AL N°° DI COPIE DI DNA BERSAGLIO

1) Vettori plasmidici SEMPLICI PRIVI DI ORIEUK

Possono dare cloni stabili solo se integrati in un cromosoma

2) Vettori plasmidici CON ORIEUK L’ ORIEUK permette di incrementare il n°° di copie del plasmide. Il plasmide viene mantenuto anche in forma episomale

E inducibile da glucocorticoidi’ Si può utilizzare per la trascrizione in vitro

3) Vettori plasmidici che permettono L’AMPLIFICAZIONE DELLE SEQUENZE GENOMICHE INTEGRATE NEL GENOMA DELL’OSPITE

DHFR= Diidrofolato Reduttasi DHFR acido diidrofolico

acido folico Coenzima nelle reazioni di trasferimento di -CH3 E -CHO da alcuni aa

DHFR acido diidrofolico

acido folico

MTX Sintesi di purine e pirimidine

Coenzima nelle reazioni di trasferimento di -CH3 E -CHO da alcuni aa

X

Sintesi di purine e pirimidine

MTX= metotrexato

Nell’amplificare il gene DHFR si amplificano anche sequenze adiacenti

FINALITA’ POSSIBILI DELLA TRASFEZIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO

-Verifica dell’identità di un gene isolato dalla library mediante saggio immunologico o funzionale della proteina espressa -Espressione di geni che codificano proteine che richiedono modificazioni post-traduzionali esclusive dei mammiferi -Produzione su larga scala di proteine normalmente poco rappresentate -Studio della biosintesi, del trasporto intracellulare e della localizzazione subcellulare di una proteina -Studio delle relazioni struttura-funzione mediante analisi delle proprietà delle proteine normali e mutate -Espressione di sequenze genomiche contenenti introni -Identificazione e catatterizzazione di sequenze di DNA coinvolte nel controllo della espressione genica -Studio degli effetti biologici prodotti dalla accensione o dalla soppressione dell’attività di una proteina

Le principali metodiche di trasfezione di cellule di mammifero

1) La PRECIPITAZIONE CON FOSFATO DI CALCIO

2) La LIPOFEZIONE

3) La ELETTROPORAZIONE