Lezione 4
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- Words: 1,153
- Pages: 15
IDENTIFICAZIONE BATTERICA Dopo aver isolato un microrganismo per identificarlo procediamo con la sua caratterizzazione andando a valutare: morfologia: forma, struttura e organizzazione cellulare. Importanti sono anche le caratteristiche morfologiche delle colonie: l’aspetto di una coltura, forma e pigmentazione; capacita’ biochimiche e metaboliche: capacità di utilizzare o attaccare alcune sostanze dando origine a particolari prodotti chimici che possono essere individuati; patogenicità: essere causa di particolari malattie, è un carattere distintivo; caratteristiche sierologiche; caratteristiche genomiche.
VALUTAZIONE DELLE CAPACITA’ BIOCHIMICHE E METABOLICHE DEI MICRORGANISMI I microrganismi modificando l’ambiente in cui vivono utilizzando sostanze chimiche per produrre energia e costituenti cellulari, e producendo cataboliti. Tutte queste attività cellulari vengono mediate da enzimi. Saggiando la produzione e la scomparsa nel terreno di coltura di particolari substrati o prodotti del metabolismo microbico, i microbiologi indagano il profilo enzimatico di un microrganismo. Il profilo metabolico che ne risulta è caratteristico di un dato microrganismo e può essere utile nella differenziazione e identificazione dei microrganismi.
DEGRADAZIONE DEI CARBOIDRATI
Gli acidi organici (acido acetico, acido lattico) e i gas (CO2 e H2) sono tra i comuni prodotti di degradazione (cataboliti) dei carboidrati. La capacità di un microrganismo di degradare diversi carboidrati può essere valutata indagando la produzione qualitativa e quantitativa di questi cataboliti durante la crescita microbica.
ANALISI PRODUZIONE ACIDI E GAS La produzione di acidi organici è evidenziata aggiungendo un indicatore di pH nel terreno di coltura. La produzione di gas viene determinata usando tubi Durham. Terreno con glucosio e con rosso fenolo (rosso sopra pH 8,5 e giallo sotto pH 6,8) + tubo Durham
Nel tubo Durham è visibile il gas formatosi
a sinistra, controllo non inoculato; al centro campione positivo per la produzione di acidi ma non di gas; a destra campione positivo per la produzione sia di acidi che di gas.
Caratteristiche fermentative di batteri Gram-negativi enterici Fermentazione glucosio 1
• • • • •
2
3
A
A G
4
5
-
A G
Organismo Control S.aeureus P. vulgaris P aeruginosa E. coli
Fermentazione lattosio 1
glucosio A A/G A/G
2
3
4
A
- -
lattosio A A/G
Fermentazione saccarosio
5
A G
saccarosio A A/G -
1
-
2
3
A
A G
4
5
- -
A = acidi G = gas
L’UTILIZZO DEL CITRATO La capacità di utilizzare citrato come unica fonte di carbonio e di energia distingue tra loro alcune batteri Gram-negativi a bastoncello. Questi batteri, in presenza di citrato come unica fonte di C e di NH4(H2PO4) come unica fonte di N, provocano un aumento di pH del terreno (dovuto all’utilizzo dell’ammonio fosfato deidrogenato) e causano il viraggio da verde a blu dell’indicatore blu di bromotimolo presente nel terreno. Agar citrato di Simmons
Enterobacter aerogenes
Escherichi a coli
+
-
CAPACITÀ AMILOLITICA Alcuni microrganismi producono amilasi e riescono a idrolizzare l’amido producendo destrine, maltosio e glucosio. In presenza di soluzioni di iodio il terreno contenente amido è colorato di blu; la degradazione dell’amido viene evidenziata dalla decolorazione.
Microrganismo B non-produttore di amilasi
-
+
Microrganismo A produttore di amilasi
CAPACITÀ PROTEOLITICA Molti batteri producono proteasi che rendono possibile l’idrolisi di proteine. La caseina, principale proteina del latte e che gli conferisce il suo colore bianco opaco, viene idrolizzata dalle proteasi formando derivati più solubili e trasparenti. Le colonie di batteri proteolitici saranno circondate da aloni chiari, le aree in cui la caseina non è stata attaccata resteranno opache.
La gelatina è una proteina che si ottiene dall’idrolisi del collagene, un componente del tessuto connettivo e dei tendini degli animali. Questa proteina viene utilizzata per saggiare l’attività proteolitica nei microrganismi.
_ +
LA DEGRADAZIONE DEL TRIPTOFANO E LA PRODUZIONE DI INDOLO Gli aminoacidi possono essere utilizzati dai microrganismi come fonte di energia oppure essere degradati ad una varietà di prodotti finali (NH3, indolo, H2O) ed eventualmente essere trasformati in componenti cellulari. Alcuni batteri degradano il triptofano, presente nel terreno di coltura durante la crescita, formando indolo. .
+
triptofano + H2O
indolo + ac. piruvico + NH3
Se dopo la crescita aggiungiamo il reattivo di Kovacs (soluzione alcolica acida di para-dimetilamminobenzaldeide) e mescoliamo, quando le fasi alcolica e acquosa si separano, si svilupperà un colore rosso nella fase alcolica che indica la presenza di indolo.
-
PRODUZIONE DI IDROGENO SOLFORATO Alcuni batteri sono in grado di degradare gli aminoacidi solforati liberando H2S. L’H2S reagisce con metalli, come il bismuto e il ferro, formando il solfuro del metallo, un precipitato insolubile e scuro. La produzione di H2S da parte di colture batteriche può essere dimostrata in laboratorio coltivando i batteri su terreni contenenti sali di questi metalli.
-
+
L’IDROLISI DEI LIPIDI Alcuni lipidi, trigliceridi e fosfolipidi, vengono comunemente decomposti dai batteri. La capacità di idrolizzare lipidi è anche un fattore di virulenza; tutte le cellule viventi hanno fosfolipidi tra i loro componenti.
TEST DELL’UREASI Alcuni microrganismi producono grandi quantità dell’enzima ureasi, che catalizza l’idrolisi dell’urea presente nel terreno di coltura, producendo ammoniaca e CO2. L’ammoniaca, alcalina, causa un aumento di pH e, quando il pH > 8, l’indicatore presente nel terreno vira al rosso. Differenziazione di Enterobatteriacee: 1. Negativo (Klebsiella); 3.
Positivo dopo 24 h di crescita, l’intero tubo è rosa brillante (E.coli e Salmonella);
6.
Positivo dopo 4 ore di crescita (tipico positivo di Proteus);
4.
Non inoculato
1
2
3
4
-
+
+
NO
Questo test è utile nell’identificazione di microrganismi e/o nel distinguere tra patogeni (es., Salmonella) e non-patogeni (es., Proteus) intestinali.
TEST DELLA CATALASI La catalasi è un enzima prodotto dalla maggior parte dei batteri e serve a catalizzare la degradazione dell’acqua ossigenata con conseguente rilascio di ossigeno libero. Il test di solito viene effettuato aggiungendo poche gocce di H2O2 su un vetrino dove è stato trasferito il microrganismo. Se quest’ultimo esprime attività catalasica si sviluppa una schiuma bianca.
I batteri catalasi-negativi sono di solito anaerobi (Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Clostridium, Mycoplasma).
TEST DELL’OSSIDASI Su una striscia impregnata con para-amminodimetilammina viene distesa la coltura batterica; se questa presenta attività citocromo-ossidasica c’è produzione di citocromo-c ossidato che ossida la paraamminodimetilammina dando luogo ad un prodotto rosso scuro-violaceo, la reazione è positiva.
+
-
Batteri appartenenti ai generi Pseudomonas e Neisseria sono ossidasipositivi. Il test è anche utile per distinguere tra i batteri enterici quelli appartenenti alle Enterobacteriacee, che sono ossidasi-negativi.
DIAGNOSI DELLA GONORREA Neisseria gonorrhoeae (gonococco) è in genere individuato come diplococco Gram-negativo. N. gonorrhoeae cresce sul terreno di arricchimento non selettivo agar-cioccolato (sangue lisato col calore), e sul terreno selettivo Thayer-Martin che contiene vancomicina, nistatina, trimetropim e colistina che sopprimono la normale flora microbica ma non inibiscono Neisseria. Le colture vengono saggiate con il test dell’ossidasi (le Neisseria sono ossidasi-positive). Diplococchi Gram-negativi e ossidasi-positivi che crescono su agar-cioccolato e altri terreni selettivi, isolati da campioni patologici di derivazione genito-urinaria, si assume siano gonococchi. La conferma definitiva viene da test biochimici per l’utilizzo di alcuni carboidrati e di altri substrati nutrizionali, da saggi immunologici e mediante l’uso di sonde di acidi nucleici.
VALUTAZIONE DELLE CAPACITA’ BIOCHIMICHE E METABOLICHE DEI MICRORGANISMI I microrganismi modificando l’ambiente in cui vivono utilizzando sostanze chimiche per produrre energia e costituenti cellulari, e producendo cataboliti. Tutte queste attività cellulari vengono mediate da enzimi. Saggiando la produzione e la scomparsa nel terreno di coltura di particolari substrati o prodotti del metabolismo microbico, i microbiologi indagano il profilo enzimatico di un microrganismo. Il profilo metabolico che ne risulta è caratteristico di un dato microrganismo e può essere utile nella differenziazione e identificazione dei microrganismi.
DEGRADAZIONE DEI CARBOIDRATI
Gli acidi organici (acido acetico, acido lattico) e i gas (CO2 e H2) sono tra i comuni prodotti di degradazione (cataboliti) dei carboidrati. La capacità di un microrganismo di degradare diversi carboidrati può essere valutata indagando la produzione qualitativa e quantitativa di questi cataboliti durante la crescita microbica.
ANALISI PRODUZIONE ACIDI E GAS La produzione di acidi organici è evidenziata aggiungendo un indicatore di pH nel terreno di coltura. La produzione di gas viene determinata usando tubi Durham. Terreno con glucosio e con rosso fenolo (rosso sopra pH 8,5 e giallo sotto pH 6,8) + tubo Durham
Nel tubo Durham è visibile il gas formatosi
a sinistra, controllo non inoculato; al centro campione positivo per la produzione di acidi ma non di gas; a destra campione positivo per la produzione sia di acidi che di gas.
Caratteristiche fermentative di batteri Gram-negativi enterici Fermentazione glucosio 1
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A
A G
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A G
Organismo Control S.aeureus P. vulgaris P aeruginosa E. coli
Fermentazione lattosio 1
glucosio A A/G A/G
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lattosio A A/G
Fermentazione saccarosio
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A G
saccarosio A A/G -
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A G
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A = acidi G = gas
L’UTILIZZO DEL CITRATO La capacità di utilizzare citrato come unica fonte di carbonio e di energia distingue tra loro alcune batteri Gram-negativi a bastoncello. Questi batteri, in presenza di citrato come unica fonte di C e di NH4(H2PO4) come unica fonte di N, provocano un aumento di pH del terreno (dovuto all’utilizzo dell’ammonio fosfato deidrogenato) e causano il viraggio da verde a blu dell’indicatore blu di bromotimolo presente nel terreno. Agar citrato di Simmons
Enterobacter aerogenes
Escherichi a coli
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CAPACITÀ AMILOLITICA Alcuni microrganismi producono amilasi e riescono a idrolizzare l’amido producendo destrine, maltosio e glucosio. In presenza di soluzioni di iodio il terreno contenente amido è colorato di blu; la degradazione dell’amido viene evidenziata dalla decolorazione.
Microrganismo B non-produttore di amilasi
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Microrganismo A produttore di amilasi
CAPACITÀ PROTEOLITICA Molti batteri producono proteasi che rendono possibile l’idrolisi di proteine. La caseina, principale proteina del latte e che gli conferisce il suo colore bianco opaco, viene idrolizzata dalle proteasi formando derivati più solubili e trasparenti. Le colonie di batteri proteolitici saranno circondate da aloni chiari, le aree in cui la caseina non è stata attaccata resteranno opache.
La gelatina è una proteina che si ottiene dall’idrolisi del collagene, un componente del tessuto connettivo e dei tendini degli animali. Questa proteina viene utilizzata per saggiare l’attività proteolitica nei microrganismi.
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LA DEGRADAZIONE DEL TRIPTOFANO E LA PRODUZIONE DI INDOLO Gli aminoacidi possono essere utilizzati dai microrganismi come fonte di energia oppure essere degradati ad una varietà di prodotti finali (NH3, indolo, H2O) ed eventualmente essere trasformati in componenti cellulari. Alcuni batteri degradano il triptofano, presente nel terreno di coltura durante la crescita, formando indolo. .
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triptofano + H2O
indolo + ac. piruvico + NH3
Se dopo la crescita aggiungiamo il reattivo di Kovacs (soluzione alcolica acida di para-dimetilamminobenzaldeide) e mescoliamo, quando le fasi alcolica e acquosa si separano, si svilupperà un colore rosso nella fase alcolica che indica la presenza di indolo.
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PRODUZIONE DI IDROGENO SOLFORATO Alcuni batteri sono in grado di degradare gli aminoacidi solforati liberando H2S. L’H2S reagisce con metalli, come il bismuto e il ferro, formando il solfuro del metallo, un precipitato insolubile e scuro. La produzione di H2S da parte di colture batteriche può essere dimostrata in laboratorio coltivando i batteri su terreni contenenti sali di questi metalli.
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L’IDROLISI DEI LIPIDI Alcuni lipidi, trigliceridi e fosfolipidi, vengono comunemente decomposti dai batteri. La capacità di idrolizzare lipidi è anche un fattore di virulenza; tutte le cellule viventi hanno fosfolipidi tra i loro componenti.
TEST DELL’UREASI Alcuni microrganismi producono grandi quantità dell’enzima ureasi, che catalizza l’idrolisi dell’urea presente nel terreno di coltura, producendo ammoniaca e CO2. L’ammoniaca, alcalina, causa un aumento di pH e, quando il pH > 8, l’indicatore presente nel terreno vira al rosso. Differenziazione di Enterobatteriacee: 1. Negativo (Klebsiella); 3.
Positivo dopo 24 h di crescita, l’intero tubo è rosa brillante (E.coli e Salmonella);
6.
Positivo dopo 4 ore di crescita (tipico positivo di Proteus);
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Non inoculato
1
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Questo test è utile nell’identificazione di microrganismi e/o nel distinguere tra patogeni (es., Salmonella) e non-patogeni (es., Proteus) intestinali.
TEST DELLA CATALASI La catalasi è un enzima prodotto dalla maggior parte dei batteri e serve a catalizzare la degradazione dell’acqua ossigenata con conseguente rilascio di ossigeno libero. Il test di solito viene effettuato aggiungendo poche gocce di H2O2 su un vetrino dove è stato trasferito il microrganismo. Se quest’ultimo esprime attività catalasica si sviluppa una schiuma bianca.
I batteri catalasi-negativi sono di solito anaerobi (Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Clostridium, Mycoplasma).
TEST DELL’OSSIDASI Su una striscia impregnata con para-amminodimetilammina viene distesa la coltura batterica; se questa presenta attività citocromo-ossidasica c’è produzione di citocromo-c ossidato che ossida la paraamminodimetilammina dando luogo ad un prodotto rosso scuro-violaceo, la reazione è positiva.
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Batteri appartenenti ai generi Pseudomonas e Neisseria sono ossidasipositivi. Il test è anche utile per distinguere tra i batteri enterici quelli appartenenti alle Enterobacteriacee, che sono ossidasi-negativi.
DIAGNOSI DELLA GONORREA Neisseria gonorrhoeae (gonococco) è in genere individuato come diplococco Gram-negativo. N. gonorrhoeae cresce sul terreno di arricchimento non selettivo agar-cioccolato (sangue lisato col calore), e sul terreno selettivo Thayer-Martin che contiene vancomicina, nistatina, trimetropim e colistina che sopprimono la normale flora microbica ma non inibiscono Neisseria. Le colture vengono saggiate con il test dell’ossidasi (le Neisseria sono ossidasi-positive). Diplococchi Gram-negativi e ossidasi-positivi che crescono su agar-cioccolato e altri terreni selettivi, isolati da campioni patologici di derivazione genito-urinaria, si assume siano gonococchi. La conferma definitiva viene da test biochimici per l’utilizzo di alcuni carboidrati e di altri substrati nutrizionali, da saggi immunologici e mediante l’uso di sonde di acidi nucleici.
