Lecture 7 2006 Part 2

Определенная часть ламина А присутствует в ядре и колокализуется с компартментами, содержащими факторы сплайсинга

S35

Lamin А

Работающие РНК-полимеразы организованы в «speckles», отличающиеся от «speckles» в которых локализуются факторы сплайсинга. Места локализации РНК-полимеразы II совпадают с местами локализации первичных транскриптов.

Pol II

Nascent RNA

merge

Транскрибирующие РНК-полимеразы II организованы в группы

1 мин пульс

5 мин пульс

15 мин пульс

кластеры включения биотина можно видеть после удаления всей РНК, кроме той, которая находится в составе РНК-ДНК гибрида

Ядерный матрикс представляет собой белковую скелетную структуру ядра, которая сохраняет форму и некоторые особенности морфологии ядра после экстракции хроматина

Структурную основу компартментализации ядра составляет ядерный матрикс. Все известные типы «speckles» сохраняются после экстракции из ядер хроматина.

Replication speckles (early pattern) on nuclei and nuclear matrix

В белковых молекулах обнаружены специальные сигнальные последовательности (отличные от сигналов локализации в ядре) которые направляют данные белки в определенный тип «speckles» и обеспечивают локализацию белков на ядерном матриксе. В транскрипционном факторе AML сигнал локализации в ядерном матриксе расположен между 351 и 381 аминокислотнами остатками.

Сигнальная последовательность локализации на ядерном матриксе белка AML обеспечивает локализацию на ядерном матриксе гетерологичного белка (GAL4)

Клеточное ядро разделяется но множество функциональных зон (компартментов) Локальная концентрация белковых факторов может существенно различаться в разных компартментах compartment Nucleoplasm (exclusion from nucleoli)

Nucleoli

Splicing speckles, as detected by anti-snRNP chromatin

Nuclear lamina

Unknown compartment

К числу наиболее хорошо охарактеризованных можно отнести компартменты, содержащие гетерохроматин Sir белки локализуются как в теломерных фокусах, так и в кластерах неактивных повторов рДНК В дрожжевых клетках 32 теломеры организованы в 3-8 фокусов, расположенных на переферии ядра Эти фокусы содержат RAP1

Перемещение геномного домена из одного компартмента в другой может быть связано с изменением его транскрипционного статуса и тайминга репликации Ядра клеток CHO выделяли на разных стадиях G1 фазы и стимулировали к вхождению в S фазу посредством помещения в экстракт из яйцеклеток ксенопуса. В ядрах, изолированных через 1 час после митоза β - глобиновый домен (неактивный в клетках CHO) и домен гена DHFR (активный в клетках CHO) не имели предпочтительной локализации в ядре и предпочтительного времени репликации. В ядрах, изолированных через 2-3 часа после митоза, β - глобиновый домен локализовался на перефирии ядра и реплицировался в конце S фазы. Домен DHFR лакализовался внутри ядра и реплицировался в начале S фазы.

В ядре существуют активные и пассивные области. Пассивными областями являются, в частности, области расположения конститутивного гетерохроматина, в том числе прицентромерные области и переферия ядра. Перемещение гена в неактивную область коррелирует с изменением его транскрипционного статуса и времени репликации.

Локальная концентрация тех или иных ДНК-связывающих белков может существенно различаться в активных и пассивных областях

Использование флуоресцентных маркеров, входящих в состав полипептидной цепи, позволило изучать динамику распределения и взаимодействия молекул в живой клетке

собственная флуоресценция

Иммуноокрашивание

5% от общего количества PCNA

GFP_PCNA локализуется в местах синтеза ДНК – «репликационных фабриках»

Для изучения динамики передвижения и взаимодеействия молекул используются методы FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) и (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRAP

После возбуждения GFP вторичное возбуждение YFP будет происходить только в том случае, когда расстояние между молекулами не превышает 6 нм

FRET Донор – синий Вторичное возбуждение - красный

Обмен белками между нуклеоплазмой и большинством типов компартментов происходит достаточно быстро Экспрессия ассоциированного с GFP альтернативного фактора сплайсинга

Экспрессия одного из маркеров околоядрышкового компартмента

Первые эксперименты по изучению взаимной локализации хромосом в интерфазном ядре были сделаны с использованием техники локального разрушения хромосом лазерным лучем и последующего включения (in vivo) в разрушенные участки меченных биотином предшественников (Cremer et al.)

Основной вывод - гомологи редко распологаются вместе

Разработка техники дифференциальной окраски хромосом и техники конфокальной микроскопии позволила анализировать взаимное пространственное расположение больших групп хромосом Интерфазные хромосомы занимают в клеточном ядреотносительно компактные неперекрывающиеся территории. Наиболее богатые активными генами хромосомы располагаются ближе к центру ядра