Lecture 5 2006 Part 3

Hybridization with short probes derived from other LARs and DNA loops confirm the validity of the whole map constructed using the topoisomerase II-mediated DNA loop excision

A – LAR7 B – LAR5 C – LAR4 D – loop3 E – LAR 3 F – loop1

Hybridizatio n probe

Number of nuclei inspected a

LAR 8

100

Loop 7

Percentage of hybridizatio n signals over nuclear core (nuclear 93% matrix 19%

Persentage of hybridizatio n signals over loop halo 7% 81%

LAR 7

120

89%

11%

LAR 5

90

91%

9%

LAR 4

100

94%

6%

Loop 3

140

23%

77%

A long attachment area is located entirely on the nuclear matrix A 0

CEN

B

C 50 0

D E'E 1000

F 1500

G

H I'I 2000

2500

TEL

Участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу могут быть достаточно протяженными (в ряде случаев, соизмеримыми с длиной петель ДНК).

Существует ли какое-либо соответствие между LARs и SARs/MARs?

MARs/SARs как правило присутствуют в районх прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу (LARs). Однако большая часть MARs/SARs находится в петлях ДНК. Таким образом MARs/SARs могут быть потенциальными участками прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу

Участки начала репликации ДНК прикреплены к ядерному матриксу

C HICKEN DOMAIN OF alpha-GLOBIN GENES LAR/permanent site of DNA attachment to the nuclear matrix

-10 kb

ori / initiation area

π

αD

αA +10 kb

0

Localization of LAR: Razin et al., 1991, Proc. Natl Acad. Sci USA 88, 8515. Localization of ori: Verbovaia and Razin, 1995, Gene 166, 255.

HUMAN C -M YC GENE

LAR ori / initiation area

exon 1

exon 2

exon 3

1 kb

Localization of LAR: Gromova et al., 1995, Proc. Natl Acad. Sci USA 92, 102. Localization of ori: Vassilev and Johnson, 1990, Mol Cell Biol 10, 4899.

Геномная ДНК организована в петли не случайным образом Фрагменты ДНК, дежащие в основаниях петель, могут быть достаточно протяженными и включают MAR элементы и другие специальные элементы генома (изогнутые последовательности, палиндромы, сайты связывания ряда белковых факторов…..) В общем случае границы петель не являются границами транскрипционных единиц Участки начала репликации расположены в основаниях петель (в районах закрепления петель ДНК на ядерном матриксе)

Единообразные петли ДНК можно увидеть и в других областях генома. Это свидетельствует о том, что организация ДНК в петли является достаточно статичной

фрагмент хромосомы 19 человека

Iarovaia O.V., Akopov S.B., Nikolaev L.G., Sverdlov E.D., Razin S.V. 2005. Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix. Nucl. Acids Res. 33, 4157-4163.

В дифференцированных клетках HL60 изучаемая область генома целиком связана с ядерным матриксом

Эукариотический геном организован в большие (50 - 250 т.п.н.) петли ДНК, разделенные участками прикрепления к ядерному матриксу Области (участки) прикрепления ДНК к ядерному матриксу составляют специальный компартмент генома. В этом компартменте находятся участки начала репликации и большинство регулаторных последовательностей В участках (областях) прикрепления к ядерному матриксу реализуются множественные контакты ДНК с ДНК-топоизомеразой II

Гипотеза: области прикрепления к

ядерному матриксу являются предпочтительными местами незаконной рекомбинации, приводящей к утрате или перемещению петель ДНК

ori

ori Topo II

ori ori

Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной близости в физическом пространстве

Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной близости в физическом пространстве

Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной близости в физическом пространстве

Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной близости в физическом пространстве

Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной близости в физическом пространстве

Хотя области прикрепления к ядерному матриксу находятся на значительном расстоянии друг от друга на молекуле ДНК, они могут распологаться в непосредственной близости в физическом пространстве

Расщепление ДНК топоизомеразой II

ДНК

релаксация и лигирование ДНК

Релаксация ДНК и накопление комплексов TOPO II-ДНК

Перенос цепей ДНК путем обмена субъединиц топоизомеразы II

Экспериментальные данные, косвенно подтверждающие модель В геноме существуют предпочтительные места хромосомных перестроек ("hot spots;  горячие точки рекомбинации). Они бывают часто разделены фрагментами ДНК, Протяженностью 20 – 100 т.п.н., которые редко участвуют в рекомбинациях  (Henglein et al., 1989; Geng et al., 1993).  Анализ фрагментов ДНК, участвующих в реципроктных рекомбинациях,  продемонстрировал присутствие MAR элементов и участков предпочтительного  расщепления ДНК топоизомеразой II  (Sperry et al., 1989; Aplan et al., 1996).  Эукариотическая ДНК топоизомераза II способна осуществлять незаконную рекомбинацию ДНК in vitro (Gale and Osheroff, 1992).  Обработка культивируемых клеток агентами, ингибирующими ДНК топоизомеразу II,  стимулирует образование делеций, дупликаций и транслокаций  (Maraschin et al., 1990; Shibuya et al., 1994). При лечении опухолей агентами, ингибирующими активность ДНК топоизомеразы II (VP16, амсакрин, m­AMSA) часто развиваются вторичные лейкозы, которые  коррелируют с наличием хромосомных перестроек (Auxefants et al., 1992; Super et al., 1993 «Горячие точки» рекомбинаций часто бывают относительно короткими и  включают участки расщеплении ДНК топоизомеразой II (Aplan et al., 1996)

ВОПРОС: Существует ли корреляция между «горячими точками» хромосомных перестроек и участками прикрепления ДНК к ядерному матриксу

Транслокации между 8 и 21 хромосомами, затрагивающие гены AML-1 (21 хромосома) и ETO (8 хромосома) часто наблюдаются при острых лейкозах

Транслокации между 8 и 21 хромосомами, затрагивающие гены AML-1 (21 хромосома) и ETO (8 хромосома) часто наблюдаются при острых лейкозах

А – AML-BCR3 проба B – ETO-BCR2 проба процентное содержание AML-BCR3 и ETO-BCR2 в границах ядерного матрикса и в короне петель ДНК Проба

Количество проанализированн ых клеток

Процентное содержание сигналов в границах ядерного матрикса

Процентное содержание сигналов в короне петель ДНК

AML-BCR3

99

77

23

ETO-BCR2

52

89

11

ETO-BCR2 и AML-BCR3 содержат MAR элементы

Тотальная ДНК

BCR2 AML-1 гена предпочтительно представлен в ДНК ядерного матрикса ДНК ядерного матрикса

Метод, основанный на полуколичественной ПЦР, позволяет оценить относительную представленность изучаемого фрагмента ДНК в препарате ДНК ядерного матрикса

ВЫВОД Горячие точки перестроек генов AML-1 и ETO содержат MAR элементы и предпочтительно связаны с ядерным матриксом в пролиферирующих клетках Hel

Это же характерно и для ряда других изученных «горячих точек» рекомбинации локус гена GNA3 китайского хомячка (Svetlova E.Yu., Razin S.V. and Debatisse M. 2001. Mammalian recombination hot spot in a DNA loop anchorage region: A model for the study of common fragile sites. J. Cell. Biochem. 81(S36), 170-178).

локус гена c-myc человека (Gromova I.I., Thomsen B., and Razin S.V. 1995. Different topoisomerase II antitumor drugs direct similar specific long-range fragmentation of an amplified c-myc gene locus in living cells and in high-salt extracted nuclei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA v. 92, p. 102-106).